:100mmol/L，Tris-HClpH 8.0,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl0
[0030]进一步的，所述蛋白质提取液为:70mmol/L Tris_HCl，2 % (V/V) β -巯基乙醇，2% (ff/V) SDS,20% (V/V)甘油，0.005% (ff/V)溴酚兰。
[0031]进一步的，所述步骤二中退火后72°C条件下5亚基延伸45s，10亚基延伸Imin。
[0032]进一步的，所述步骤二中:lXBuffer为 10mmol /T, Tris-HCl, pH = 8.3, 50mmol/LKCl0
[0033]本发明的有益效果在于:本发明方法利用远离胚部的1/3?1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1，17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3?1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0034]图1是本发明的具体实施例的PCR检测结果；
[0035]图2是本发明具体实施例高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE电泳检测结果；
[0036]图3是本发明具体实施例分离群体5亚基PCR检测结果；
[0037]图4是本发明具体实施例分离群体10亚基PCR检测结果；
[0038]图5是本发明具体实施例初选种子SDS-PAGE电泳检测结果。
【具体实施方式】
[0039]下文将结合附图详细描述本发明的实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
[0040]本方法所用的实验材料为中国春、宁春4号、扬麦19号以及宁春4号X扬麦19号F2分离群体种子。宁春4号(1，17+18，5+10)为我国西北春麦区的主推品种，是优质面条专用粉一雪花粉的主要原料；扬麦19号为我国长江中下游冬麦区的主推品种；中国春(Null, 7+8，2+12)用作分析扬麦19号高分子量谷蛋白亚基组成的参照品种。
[0041 ] 1、小麦籽粒DNA的提取
[0042]a.用干净刀片切取1/3?1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入I粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700 μ L DNA提取缓冲it (10mmoI/L Tris-HCl pH 8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl)，65°C水浴约 30min，其间每隔5分钟上下颠倒I次；冷却至室温，13000rpm离心15min ；
[0043]b.取500 μ L上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50 μ L 10mol/L醋酸钱和ImL95%乙醇，上下充分颠倒，13000rpm离心1min ；
[0044]c.弃上清液，加入ImL 70%乙醇，上下缓慢颠倒7?8次，13000rpm离心2min ；
[0045]d.弃上清液，于室温下充分干燥；
[0046]e.加30 μ L双蒸水溶解DNA。
[0047]2、高分子量谷蛋白亚基的PCR检测
[0048]考虑到5+10亚基对食品加工品质的影响较大，本方法对其进行PCR检查。
[0049]5亚基的引物序列为:
[0050]P1Sr -GCCTAGCAACCTTCACAATC-3' ，P25' -GAAACCTGCTGCGGACAAG-3'；
[0051]10亚基的引物序列为:
[0052]P35, -GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3' ，P45, -TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3'；
[0053]?0?反应体系均为25 4 1^，其中含1“1^提取的0嫩，1\81^€61(1011111101/1 Tris-HClpH = 8.3，50mmol/L KCl)，2mmol/L MgCl2,每种 dNTP 各 0.8mmol/L,每种引物各 0.2 μ mol/L，Taq 酶 1.5U ；
[0054]PCR反应条件为:95 °C预变性3min，94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸45s (5亚基)或Imin (10亚基)，35个循环，最后72°C再延伸5min。
[0055]扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)进行电泳检测。
[0056]3、高分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE电泳
[0057]小麦籽粒提取DNA后，还剩下沉淀物。为全面了解小麦籽粒高分子量谷蛋白亚基组合，选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，1000rpm离心2min，弃上清液，加入30(^1^蛋白质提取液(70臟01/1 Tris-HCl, 2% (V/V) β-巯基乙醇，2% (V/V) SDS, 20% (V/V)甘油，0.005% (W/V)溴酚兰)，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴lOmin，取出冷却至室温，1000rpm离心lOmin，取上清液上样。同时，以用蛋白质提取液直接从中国春、宁春4号和扬麦19号的1/3?1/2粒种子提取的上清液作为对照(直接提取)。高分子量谷蛋白亚基的检测采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为8%，二者交联度均为3.33%，考马斯亮蓝染色。
[0058]4、宁春4号和扬麦19号5+10亚基的PCR检测结果
[0059]由图1所示，用5亚基特异性引物Pl和P2进行PCR扩增，宁春4号扩增出450bp条带，而扬麦19号未扩增出该条带，说明宁春4号含有5亚基；用10亚基特异性引物P3和P4进行PCR扩增，宁春4号扩增出576bp特异性条带，而扬麦19号扩增出612bp特异性条带，说明宁春4号含有10亚基，而扬麦19号含有12亚基。同时，也说明本方法提取的小麦籽粒DNA可满足5+10亚基PCR检测的需要。
[0060]5、宁春4号和扬麦19号SDS-PAGE电泳检测结果
[0061]由图2所示，直接提取和提取DNA后再提取高分子量谷蛋白亚基，其SDS-PAGE电泳结果一致，说明小麦籽粒DNA的提取对SDS-PAGE电泳结果影响不大。同时，根据Payne等的命名标准，确定扬麦19号高分子量谷蛋白亚基组成为Null，7+9，2+12。
[0062]6、宁春4号和扬麦19号F2分离群体PCR检测结果
[0063]由图3所示，24粒种子中有15粒可扩增出明亮的450bp条带，说明约占总数3/4的种子可能含有5亚基。由图4所示，泳道2、9、11、15、19、21、22、23、24可扩增出576bp特异性条带，说明这9粒种子可能含有10亚基。考虑到约占总数3/4的种子含有5亚基，这9粒种子10亚基基因位点很可能为纯合型，即为本研究的初选种子。
[0064]7、宁春4号和扬麦19号F2分离群体初选种子SDS-PAGE电泳检测结果
[0065]为进一步了解初选种子高分子量谷蛋白亚基的组合，对其进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图5所示，泳道3含Null, 7+9，5+10亚基，泳道4、5、6含I, 7+9，17+18，5+10亚基，泳道7可能含I, 7+9，17+18，2+10亚基，泳道8含1，7+9，17+18，5+10亚基，泳道9可能含
I,7+9，17+18，2+12，5+10 亚基，泳道 10 含 I, 17+18，5+10 亚基，泳道 11 含 Null, 17+18，5+10亚基。
[0066]本发明方法利用远离胚部的1/3?1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1，17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3?1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。
[0067]本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本权利范围的限定。
【主权项】
1.一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，包含如下步骤: 步骤一:小麦籽粒DNA的提取 a.切取1/3?1/2粒小麦种子，研磨，加入DNA提取缓冲液，水浴，每隔5分钟上下颠倒I次；冷却至室温，离心； b.取上清液加入醋酸铵和乙醇，上下充分颠倒，离心； c.弃上清液，加入乙醇，上下缓慢颠倒7?8次，离心； d.弃上清液，于室温下充分干燥； e.加双蒸水溶解DNA； 步骤二:高分子量谷蛋白亚基的PCR反应 5亚基的引物序列为:P1Sr -GCCTAGCAACCTTCACAATC-3' ，P25' -GAAACCTGCTGCGGACAAG-3'； 10亚基的引物序列为:P35' -GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3' ，P45' -TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3'； PCR反应体系为25yL，含I 4 1^提取的0嫩，1\8虹€61，2臟01/1 MgCl2，每种dNTP各为0.8mmol/L，每种引物各为 0.2 μ mol/L, Taq 酶 1.5U ； PCR反应条件为:95°C预变性3min，94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸45s?Imin, 35个循环，最后72°C再延伸5min ； 步骤三:高分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE电泳及检测 选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，1000rpm离心2min，弃上清液，加入300 μ L蛋白质提取液，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴lOmin，取出冷却至室温，1000rpm离心lOmin，取上清液； 高分子量谷蛋白亚基的检测:采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为8%，交联度为3.33%。2.如权利要求1所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述步骤一具体为: a.用干净刀片切取1/3?1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入I粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700 μ L DNA提取缓冲液，65°C水浴约30min，其间每隔5分钟上下颠倒I次；冷却至室温，13000rpm离心15min ； b.取500μ L上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50 μ L 1moI/L醋酸铵和ImL 95%乙醇，上下充分颠倒，13000rpm离心1min ； c.弃上清液，加入ImL70%乙醇，上下缓慢颠倒7?8次，13000rpm离心2min ； d.弃上清液，于室温下充分干燥； e.加30μ L双蒸水溶解DNA。3.如权利要求2所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述 DNA 提取缓冲液为:100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/LNaCl04.如权利要求3所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述蛋白质提取液为:70mmol/L Tris-HCl，2%(V/V) β -巯基乙醇，2%(W/V) SDS，20%(V/V)甘油，0.005% (W/V)溴酚兰。5.如权利要求4所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述步骤二中退火后，72°C条件下，5亚基延伸45s，10亚基延伸Imin。6.如权利要求4所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，所述步骤二中:1 XBuffer 10mmol/L Tris-HCl，ρΗ=8.3，50mmol/L KCl0
【专利摘要】本发明公开了一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，属于分子生物技术领域。本发明方法利用远离胚部的1/3～1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1,17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。小麦籽粒被切去1/3～1/2后，其发芽率会有不同程度的下降，但切口经封蜡处理后，其出苗率和完整种子的出苗率相当。本发明所用方法快捷、可靠、实用，具有很好的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, G01N27/447
【公开号】CN105039545
【申请号】CN201510438797
【发明人】刘永安, 许立奎, 潘彬荣, 岳高红, 梅喜雪
【申请人】温州市农业科学研究院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月23日