用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引物及检测方法，检测引物包括甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物，具体序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示，该引物能够同时检测甘薯SPVD病毒病的2种复合侵染病毒SPCSV和SPMFV，具有快速简单、灵敏度高、特异性强等优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的缺陷，具有很好的应用前景。
【专利说明】用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引 物，还涉及含有检测引物的试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 甘薯病毒病（Sweet potato virus disease，SPVD)是由甘薯裡绿矮化病毒（sweet potato cholotic stunt virus，SPCSV)和甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)协生共侵染甘薯引起的病毒病害。感染SPVD的甘薯表现叶片扭曲、 畸形、叶片褪绿、明脉以及植株严重矮化等症状。SPVD对甘薯产量影响极大，可使甘薯减 产50 %?98 %，严重时可造成90 %以上的产量损失，甚至绝收，是甘薯上的毁灭性病害。 2012-2013年度SPVD病毒病在我国大面积爆发，在重庆地区爆发造成了严重的影响；因此， 建立一种简便、快速、有效的检测SPVD的方法，对于该病的预警和防治具有重要意义。
[0003] 目前用于甘薯病毒检测目前检测手段有病状学诊断、指示植物检测法、电子显微 镜检测法、血清学检测，较为常用方法是酶联免疫吸附（ELISA)技术和PCR技术。由于ELISA 技术的灵敏度较低，而且SPLV、SPVG和SPFMV 3种病毒的抗体之间常常有交互反应，不能对 3种病毒进行特异性检测。而利用单一的RT-PCR检测方法对多种病毒进行检测时，工作量 大，效率低。因此，急需建立一种在一次PCR反应中同时检测上述3种甘薯病毒的多重方法。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测 引物；本发明的目的之二在于提供含有上述检测引物的试剂盒；本发明的目的之三在于提 供利用上述试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测引物，包括甘薯褪绿矮化病毒SPCSV 热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物，所述甘薯褪绿矮化 病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所示；所述甘薯 羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示。
[0007] 2、含有所述检测引物的检测试剂盒。
[0008] 进一步，所熟检测试剂盒还包括内标基因检测引物，所述内标基因为甘薯泛素基 因 UBI和甘薯组蛋白H2B基因，所述甘薯泛素基因 UBI的检测引物如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所 不O
[0009] 3、利用所述检测试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)提取检测样品和对照样品总RNA，反转合成第一链CDNA，备用；
[0011] ⑵根据甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外 壳蛋白基因设计荧光定量PCR的检测引物和内标基因检测引物，然后以步骤（1)合成的第 一链cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
[0012] (3)比对检测样品和对照样品的Ct值计算甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70 基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的相对表达量。
[0013] 进一步，所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 所示。
[0014] 进一步，所述内标基因为甘薯泛素基因 UBI和甘薯组蛋白H2B基因。
[0015] 进一步，所述甘薯泛素基因 UBI的检测引物如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所 示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示。
[0016] 进一步，所述荧光定量PCR的扩增程序为95°C预变性IOmin ;95°C变性15s，60°C 退火lmin，50个热循环。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明公开了用于甘薯SPVD病毒病实时荧光定量PCR的 检测引物，该引物能够通过荧光定量检测甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯 羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的转录水平，能够同时检测甘薯褪绿矮化病毒SPCSV和 甘薯羽状斑驳病毒SPFMV感染。将检测引物构建成检测试剂盒后能够简单、高效、低成本检 测甘薯SPVD病毒病，并且灵敏度高于血清学检测。解决了现有检测手段复杂费时，周期长， 且对操作的实验室有一定要求的缺陷，具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图1为两种内参基因的溶解曲线（I. IbH2B基因，2IbUBI基因）。
[0020] 图2为6对荧光定量PCR引物的筛选（a :引物组合FSPCSV-1Q和RSPCSV-1Q检测结 果；b :引物组合FSPCSV-2Q和RSPCSV-2Q检测结果；c :引物组合FSPFMV-1Q+RSPFMV-1Q检 测结果；d :引物组合FSPFMV-2Q+RSPFMV-2Q检测结果；e :引物组合FSPFMV-3Q+RSPFMV-3Q 检测结果；f :引物组合FSPFMV-3Q+RSPFMV-2Q检测结果）。
[0021] 图3为荧光定量PCR检测结果仏说?]\^出说05￥，&表示(：198-1，13表示(：198-2， c 表示 0841-14-1，d 表示 0841-14-1，e 表示 0841-14-2, f 表示 0841-14-3, g 表示浙 255， h表示渝薯6号顶部幼嫩叶片，i表示渝薯6号底部老叶，j表示宁紫薯1号-1顶部幼嫩叶 片、k表不宁紫薯1号-1底部老叶，1表不宁紫薯1号-2, m表不1036-1，n表不1041-7, 〇 表示徐薯22)。
[0022] 图4为SPFMV和SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附检测结果（a表示C198-l，b 表示 C198-2, c 表示 0841-14-1，d 表示 0841-14-1，e 表示 0841-14-2, f 表示 0841-14-3, g 表示浙255, h表示渝薯6号顶部幼嫩叶片，i表示渝薯6号底部老叶，j表示宁紫薯1号-1 顶部幼嫩叶片、k表示宁紫薯1号-1底部老叶，1表示宁紫薯1号-2, m表示1036-1，n表 示1041-7, 〇表示徐薯22)。
【具体实施方式】
[0023] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0024] -、甘薯样品的采集
[0025] 于2013?2014年，从我国重庆市万州、北碚歇马、漕上基地田间采集甘薯品种/ 系渝薯6号、浙薯255、宁紫薯1号、徐薯22、C198、0841-14、1036-l、1041-7的顶部幼嫩叶片 和底部老叶共14份具有SPVD病毒病典型症状的植株，其主要症状表现为叶片畸形、扭曲、 褪绿、明脉及植株严重矮化等。同时取甘薯品种0841-14无明显病毒病症状、正常生长植株 1份（0841-14-3)作为对照。每份材料分别取上部幼嫩叶片和中部成熟叶片各3个叶片，叠 放后平均分为2份，1份于液氮中保存，用于总RNA提取；另1份放置于取样袋中，于取样当 日进行血清学检测。二、核酸提取及引物设计
[0026] 采用植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取总RNA，用DNase I (天根生化科技有限公司，北京）去除总RM中的基因组DNA，具体操作步骤参照说明书 进行。然后取I U g提取的总RNA为模板，采用PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa公 司）的Oligo dT-Adaptor Primer进行反转录（宝生生物工程有限公司，大连）合成第一 链cDNA，具体操作步骤参照说明书进行。
[0027] 然后根据甘薯裡绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV) 的热激蛋白70(Heat Shock 70)编码基因和甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)的外壳蛋白编码基因（CP基因）保守核苷酸序列设计克隆SPFMV外 壳蛋白和克隆和SPFMV热激蛋白70的引物，具体引物如下：
[0028] SPFMV 正向引物：5' _tct(a/g) (a/g)tga(g/a) (a/c) (a/g) (t/a/c)actgaatt(t/ c)aa(a/g)(g/a)atg_3'（SEQ ID NO. I) ;SPFMV 反向引物：5' -gcacacccctcattcc(t/c) aagaggttatg-3'（SEQ ID NO. 2)〇
[0029] SPFMV 热激蛋白 70 正向引物：5' -gacgg(g/t)ggtac(t/g)atgaa(g/a) gtccttcgaa-3'（SEQ ID NO. 3) ;SPFMV 热激蛋白 70 反向引物：5' -ggctcacaaac(c/a/t) ga (c/t)ttcataaacat~3, (SEQ ID NO. 4)〇
[0030] 四、克隆SPFMV外壳蛋白和和SPFMV热激蛋白70基因
[0031] 分别以 SEQ ID NO. 1 与 SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 4 为引物对， 合成的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为：（94°C预变性5min ;94°C变性 30s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，35个热循环；最后72°C延伸7min)。扩增完毕后，将 PCR扩增产物用质量分数为1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片断，然后将回收片段与 pEASY-T5载体（TransGen Biotech，北京，中国）连接，连接产物转化到大肠杆菌Transl-Tl 感受态细胞中，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。将挑选含有目的片断的克隆加 入到ImL Amp浓度为100 y g ? y L-1的LB培养基中37°C，200r ? min ―1震荡培养过夜，培养 后送上海英捷潍基生物技术有限公司（Irwritrogen，上海，中国）完成测序。将测序结果利 用Geneious 7. L 7和MEGA 6. 06软件进分析。
[0032] 五、荧光定量PCR特异检测引物的设计
[0033] 根据NCBI登录序列中SPCSV的热激蛋白70 (Heat Shock 70)基因和SPFMV的外 壳蛋白（Coat Protein，CP)基因的核苷酸序列，结合第四部分测序获得的序列，根据其核苷 酸序列的保守序列设计6对特异性检测引物，具体序列如表1所示：
[0034] 表1荧光定量PCR扩增的特异引物
【权利要求】
1. 用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测引物，其特征在于：所述检测引物包括甘 薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测 引物，所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO. 9和 SEQ ID NO. 10 所示。
2. 含有权利要求1所述检测引物的检测试剂盒。
3. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括内标基因 检测引物，所述内标基因为甘薯泛素基因 UBI和甘薯组蛋白H2B基因，所述甘薯泛素基因 UBI的检测引物如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测 引物如 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18 所示。
4. 利用权利要求2或3所述检测试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法，其特征在于：包 括如下步骤： (1) 提取检测样品和对照样品总RNA，反转合成第一链cDNA，备用； (2) 根据甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋 白基因设计荧光定量PCR的检测引物和内标基因检测引物，然后以步骤（1)合成的第一链 cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增； (3) 比对检测样品和对照样品的Ct值计算甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因 和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的相对表达量。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白 70基因的检测引物如SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV 外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述内标基因为甘薯泛素基因 UBI和甘 薯组蛋白H2B基因。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述甘薯泛素基因 UBI的检测引物如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO. 17和 SEQ ID NO. 18 所示。
8. 根据权利要求4?7任一项所述的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR的扩增程 序为95°C预变性10min ;95°C变性15s，60°C退火lmin，50个热循环。
【文档编号】C12N15/11GK104450977SQ201510004529
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】张凯, 王季春, 卢会翔, 唐道彬, 吕长文, 赵勇, 刘勋, 黄远新 申请人:西南大学