一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法
【专利摘要】本发明涉及了一种甘薯病毒苗茎尖脱毒及培养方法，所述方法包括以下步骤：(1)取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽；(2)剪取生长至1.5～2.0cm长的顶芽进行消毒；(3)从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接种培养，获得再生植株；(4)对步骤(3)所得再生植株经2～3次继代培养建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系；(5)对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。本发明提供的方法能快速建立其适用于大多数甘薯品种/品系的茎尖培养和脱毒苗快繁的培养体系。
【专利说明】_种甘署病毒苗的莲尖脱毒方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及甘薯茎尖分生组织的形态学结构和组织培养技术，即是涉及一种一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法。
【背景技术】
[0002]甘薯(Ipomoea batatas L.)是一种重要的粮食、饲料和工业原料作物，具有产量高、营养丰富、适应性强、稳定性好等优点。当前推广的甘薯品种，一般是有性杂交一代的无性系，在遗传上是高度杂合的，因此生产上利用薯块进行无性繁殖来保持优良种性的要求。甘薯生产中是以薯块留种并年年进行无性繁殖，种薯一旦受到病毒病的浸染，便造成病毒病的积累而蔓延，从而造成甘薯总产量降低、品质下降，甚至种性退化等严重问题，显然病毒病给甘薯生产带来巨大威胁，是当今现代农业高能源型甘薯产业化发展中必须高度重视的高危病毒病问题。
[0003]Morel和Martin早在1952年就利用分生组织培养获得大丽花和马铃薯脱毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技术体系。然而直至目前，对病毒在植物体内分布不均一性的机理还不十分清楚，通过大量的研宄认为，基本已经证实了茎尖分生组织并不是完全没有病毒，只是不带或很少带有病毒，在实际应用中依然是以几种假说作为理论依据。但就脱毒而言，茎尖仍然是植物脱毒培养并得以保持物种种性更为理想的外植体，在甘薯组织培养研宄中也是首选外植体。为此，利用茎尖脱毒仍然是甘薯生产中无性繁殖作物杂种一代无性系优势利用的主要途径。茎尖的叶原基个数直接影响到茎尖培养成苗率及其脱毒效果，不带叶原基的茎尖分生组织则成苗困难，而分离多个叶原基的茎尖分生组织又会对脱毒效果产生不利影响。
[0004]专利文献CN103190264A公开了一种马铃薯茎尖脱毒方法，包括以下步骤:1)将需要脱毒的原原种进行田间播种；2)植株生长期常规管理；3)在现蕾或开花期从马铃薯地里筛选健康的植株，做好标记，较其他植株提前半个月收获，每株筛选个大，薯型标准和健康的种薯单独收获和贮存；4)种薯发芽后，剪取幼芽进行病毒检测；5)将检测健康的种薯，重新催芽后剪取大芽经酒精和升汞杀菌处理后，放于常规MS固体培养基上做成茎段苗；6)将长高的茎段苗，剪取上部三分之一高度保种，剩余三分之二进行病毒检测；7)病毒检测合格后，按照常规方法进行快繁；通过本发明可以在相对短的周期内获得马铃薯脱毒试管苗，得到的脱毒试管苗健康，遗传基因稳定。但是该方法无法适用于大多数甘薯品种/品系的甘薯茎尖培养和脱毒苗快繁的培养体系。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种适用于多种甘薯品种/品系的甘薯病毒苗茎尖脱毒及培养方法，所述甘薯病毒为薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒。
[0006]为了实现上述目的，本发明提供的一种甘薯病毒苗茎尖脱毒及培养方法，包括以下步骤:
[0007](I)材料培养:取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽；
[0008](2)材料消毒:剪取生长至1.5?2.0cm长的顶芽进行消毒；
[0009](3)接种培养:从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接种培养，获得再生植株；
[0010](4)株系建立与病毒检测:对步骤(3)所得再生植株经2?3次继代培养建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系；
[0011](5)快速繁殖:对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
[0012]本发明所述步骤(I)具体为:选取收获已携带病毒的薯块，洗净表面后用30?35mg/kg赤霉素(GA3)浸种25?30min，用消毒湿砂覆埋于25?27°C黑暗催芽，当芽露出砂面后用38?40°C热处理7?8d。
[0013]本发明所述步骤(2)中，所述消毒具体为:先用体积分数为75%乙醇浸泡25?30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1 %的HgCl2浸泡8?lOmin，无菌水冲洗3?5遍。
[0014]本发明所述步骤(3)中，所述茎尖大小为0.22?0.35mm ;茎尖形态为突起态、半闭合态或闭合态；其中，半闭合态和闭合态的成苗培养效果好，突起态的脱毒效果好；
[0015]所述无菌剥离具体为:用镊子夹取消毒材料置于垫有湿润滤纸的无菌培养皿中，然后在双目体视镜下，一只手用一根解剖针按住茎尖的另一端，另一只手持解剖针纵向去掉包围在茎尖外层的几层幼叶，当接近茎尖生长点之下的第3?4个幼叶时，要求做到剥去一层/片幼叶的解剖针就应在酒精灯火焰上灼烧一次重新灭菌，同时并转移材料在滤纸上的位置，待无菌剥离至2个叶原基时，并再一次重新对解剖针进行灭菌，待针尖冷却后将茎尖分生组织横切下来，迅速将已经粘附到针尖上的茎尖接种到茎尖培养基上；
[0016]所述接种培养的培养基由以下成分组成:基本培养基MS, 0.8?1.4mg/L 6-节氨基腺嘌呤(BAP)，0.01?0.02mg/L α -萘乙酸(NAA);或基本培养基MS，0.2?0.8mg/L BAP，0.1 ?0.2mg/L3-吲哚乙酸(IAA)；
[0017]所述接种培养的培养条件为:温度25?30°C，光照强度1600LX，光照时数12?14h0
[0018]本发明所述步骤(4)中，所述检测具体为:以试管苗株系对巴西牵牛用涂抹法和嫁接法观察病毒引起的症状，以巴西牵牛为指示植物进行检测后确认无毒的试管苗株系再用硝酸纤维素膜酶联免疫检测法(NCM-ELISA)进行检测；其中，NCM-ELISA检测程序为:样品米集一在膜上点样一加入封阻液一冲洗一添加特异病毒抗体一冲洗一加入酶标抗体一冲洗一显色一终止反应，得到无紫色反应(阴性)的脱毒株系。
[0019]本发明所述步骤(5)中，所述快速繁殖的培养基由以下成分组成:MS基本培养基，
0.1 ?0.2mg/L IAA, 0.1 ?0.5mg/L GA3;
[0020]所述快速繁殖的条件为:温度28?30°C，光照时数12?16h。
[0021]作为优选方案，本发明所述方法包括以下步骤:
[0022](I)材料培养:选取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，洗净表面后用30?35mg/kg GA3浸种25?30min，用消毒湿砂覆埋于25?27°C黑暗催芽，当芽露出砂面后用38?40°C热处理7?8d ;
[0023](2)材料消毒:剪取生长旺盛的长1.5?2.0cm顶芽，在超净工作台上切去完全展开的叶片，然后消毒；消毒时将材料先用体积分数为75%乙醇浸泡25?30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1 %的HgCl2浸泡8?lOmin，无菌水冲洗3?5遍；
[0024](3)接种培养:在解剖镜下无菌剥离0.22?0.35mm大小的生长点带2个叶原基，接种在预先制备好的培养基中，培养基组成为:MS基本培养基+0.8?1.4mg/L BAP+0.01?0.02mg/LNAA+0.1 ?0.2mg/L GA3;或 MS 基本培养基 +0.2 ?0.8mg/L ΒΑΡ+0.1 ?0.2mg/LΙΑΑ+0.1?0.2mg/LGA3;培养条件为:培养温度26?28°C，光照强度1500?1600Lx，光照时数12?14h ；
[0025](4)株系建立与病毒检测:对来自不同品种/品系的茎尖初代培养建立的试管苗严格按株系序号进行继代培养建立株系，病毒检测先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牵牛植株叶片生长数日后观察引起的症状来鉴定，不出现症状得到无病毒的株系，再用NCM-ELISA法检测，其检测程序为:样品米集一在膜上点样一加入封阻液一冲洗一添加特异病毒抗体一冲洗一加入酶标抗体一冲洗一显色一终止反应，得到无紫色反应的脱毒株系;
[0026](5)快速繁殖:快速繁殖培养基组成为MS基本培养基+0.1?0.2mg/L ΙΑΑ+0.1?
0.511^/11^3;在28?30°C、12?16h/d条件下对步骤(4)所得脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
[0027]与现有技术相比，本发明提供的方法具有以下优势:
[0028]1、本发明提供的方法可针对不同品种/品系的甘薯病毒苗，适用于大多数甘薯品种/品系的甘薯茎尖培养和脱毒苗快繁的培养体系，可应用于多种甘薯良种和实生系，目前已应用成功的品种包括:徐薯18、南薯99、川薯101、鲁薯8号、渝薯2号、棉粉I号、北京553、南薯88、渝紫13、商丘52-7、潮薯I号、宁紫I号、胜利百号、苏薯I号、台农10号；品系包括:0936-16、1008-17、1011-1、1011-4、1013-7、1038-7、1041-3、1112-5、1127-3、1144-3、1173-6、I197-2、1202-1、1204-3、1213-21、1213-22、1213-23、1213-28、1213-34、1213-40、1214-3、1226-2、1246-4、1246-19、1272-6 ；
[0029]具体而言，成苗率(成苗数/接种数)在91.7?94.4 %的品种/品系为:渝薯 2 号、棉粉 I 号、绵薯早秋、徐薯 18、1213-21、1213-23、1213-28、1213-34、1213-40 ;在82.2?89.1 %的品种/品系为:南薯88、南薯99、北京553、鲁薯8号、苏薯I号、胜利百号、台农 10 号、0936-16、1011-1、1011-4、1013-7、1112-5、1127-3、1144-3、1173-6、1197-2 ；在72.2?79.6%的品种/品系为:川薯101、南瑞苕、商丘52_7、渝紫13、宁紫I号、潮薯
I号、1008-17、1038-7、1041-3、1202-1、1204-3、1213-22、1214-3、1226-2、1246-4、1246-19、1272-6 ；
[0030]上述材料为甘薯新品种育种优良亲本，利用该技术体系，可用于甘薯优良种质资源的保存、保护，为优良亲本的利用所必需。
[0031]2、本发明提供的方法采用两种检测方法:采用指示植物法是以试管苗株系涂抹法和嫁接法对巴西牵牛进行病毒检测，以及利用NCM-ELISA的血清学方法进行病毒检测。
[0032]3、本发明提供的方法是在甘薯脱毒研宄中，不同于一般采用2?4叶原基0.5?
1.5mm大小的茎尖，并结合温热或冷冻疗法处理后再进行离体培养。直至目前，国内外尚未见茎尖仅以2叶原基形态大小为外植体对成苗培养及其脱毒效果的相关报道，因此本发明公开了甘薯生长点所具有的2叶原基形态特征。
[0033]综上所述，本发明公开了甘薯茎尖2叶原基不同形态再生植株的成苗率及其脱毒效果，还公开了大多数甘薯品种/品系的茎尖培养和脱毒苗快繁的培养体系，同时也将对其它植物的脱毒培养具有技术方法上的借鉴作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0035]图1为本发明所述茎尖2叶原基形态，包括顶芽无菌剥离后露出的外观形态和三种茎尖叶原基形态的外植体示意图，其中，LP1表示第I叶原基，LP 2表示第2叶原基，AD表示生长锥。
[0036]图2为本发明所述三种形态茎尖初代培养的分化苗示意图，其中图a为突起态，图b为半闭合态，图c为闭合态。
[0037]图3为本发明所述三种形态茎尖成苗培养的再生植株示意图，其中，图a为突起态，图b为半闭合态，图c为闭合态。
[0038]图4为本发明薯块萌发苗与茎尖培养株系携带SPFMV与SPVG病毒的NCM-ELISA检测结果，其中，图a、b分别为薯块萌发苗携带的病毒的情况，图c、d分别为茎尖培养后株系携带的病毒的情况。
[0039]图5为本发明株系建立及其脱毒苗快繁示意图，其中，图a为茎段培养，图b为液态培养基快繁，图c为固态培养基快繁。
【具体实施方式】
[0040]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0041]实施例1
[0042]本实施例使用的甘薯品种为绵薯早秋，来源于西南大学薯类作物研宄所。
[0043]一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法，具体步骤如下:
[0044](I)材料培养:选取收获已携带甘薯羽状斑驳病毒的薯块，洗净表面后用32mg/kgGA3浸种28min，用消毒湿砂覆埋于26°C黑暗催芽，当芽露出砂面后用39°C热处理7d ；
[0045](2)材料消毒:剪取生长旺盛的长1.8cm顶芽，在超净工作台上切去完全展开的叶片，然后消毒；消毒时将材料先用体积分数为75%乙醇浸泡28s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1 %的HgCl2浸泡9min，无菌水冲洗4遍；
[0046](3)接种培养:在解剖镜下无菌剥离0.30mm大小的生长点带2个叶原基，接种在预先制备好的培养基中，培养基组成为:MS基本培养基+1.0mg/L BAP+0.01mg/LNAA+0.lmg/L 6八3;或 MS 基本培养基+0.5mg/L BAP+0.lmg/L IAA+0.lmg/L GA 3。培养条件为:培养温度27°C，光照强度1550Lx，光照时数13h ；
[0047](4)株系建立与病毒检测:对来自不同品种/品系的茎尖初代培养建立的试管苗严格按株系序号进行继代培养建立株系，病毒检测先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牵牛植株叶片生长数日后观察引起的症状来鉴定，不出现症状得到无病毒的株系，再用血清学方法NCM-ELISA检测，其检测程序:样品米集一在膜上点样一加入封阻液一冲洗一添加特异病毒抗体一冲洗一加入酶标抗体一冲洗一显色一终止反应，得到无紫色反应(阴性)的脱毒株系；
[0048](5)快速繁殖:快速繁殖培养基组成为MS基本培养基+0.lmg/L IM+0.lmg/L GA3;在29°C、15h/d条件下对步骤(4)所得脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
[0049]本实施例所得脱毒绵薯早秋成苗率(成苗数/接种总生长点数)为94.4%。
[0050]实施例2
[0051]本实施例使用的甘薯品种为南薯88，来源于西南大学薯类作物研宄所。
[0052]一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法，具体步骤如下:
[0053](I)材料培养:选取收获已携带甘薯G病毒的薯块，洗净表面后用30mg/kg Gk嚴种25min，用消毒湿砂覆埋于25°C黑暗催芽，当芽露出砂面后用38°C热处理7d ；
[0054](2)材料消毒:剪取生长旺盛的长1.5顶芽，在超净工作台上切去完全展开的叶片，然后消毒；消毒时将材料先用体积分数为75%乙醇浸泡25s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1 %的HgCl2浸泡8min，无菌水冲洗3遍；
[0055](3)接种培养:在解剖镜下无菌剥离0.22mm大小的生长点带2个叶原基，接种在预先制备好的培养基中，培养基组成为:MS基本培养基+0.8mg/L BAP+0.0 lmg/LNAA+0.lmg/L 6八3;或 MS 基本培养基+0.2mg/L BAP+0.lmg/L IAA+0.lmg/L GA 3。培养条件为:培养温度26°C，光照强度1500Lx，光照时数12h ；
[0056](4)株系建立与病毒检测:对来自不同品种/品系的茎尖初代培养建立的试管苗严格按株系序号进行继代培养建立株系，病毒检测先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牵牛植株叶片生长数日后观察引起的症状来鉴定，不出现症状得到无病毒的株系，再用血清学方法NCM-ELISA检测，其检测程序:样品米集一在膜上点样一加入封阻液一冲洗一添加特异病毒抗体一冲洗一加入酶标抗体一冲洗一显色一终止反应，得到无紫色反应(阴性)的脱毒株系；(5)快速繁殖:快速繁殖培养基组成为MS基本培养基+0.lmg/LIAA+0.lmg/L 6‘在28°C、ia/d条件下对步骤⑷所得脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
[0057]本实施例所得脱毒南薯88成苗率为82.2%。
[0058]实施例3
[0059]本实施例使用的甘薯品种为川薯101，来源于西南大学薯类作物研宄所。
[0060]一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法，具体步骤如下:
[0061](I)材料培养:选取收获已携带薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒的薯块，洗净表面后用35mg/kg GA3浸种30min，用消毒湿砂覆埋于27°C黑暗催芽，当芽露出砂面后用40°C热处理8d ；
[0062](2)材料消毒:剪取生长旺盛的长2.0cm顶芽，在超净工作台上切去完全展开的叶片，然后消毒；消毒时将材料先用体积分数为75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1%的HgCl2浸泡lOmin，无菌水冲洗5遍；
[0063](3)接种培养:在解剖镜下无菌剥离0.35mm大小的生长点带2个叶原基，接种在预先制备好的培养基中，培养基组成为:MS基本培养基+0.8?1.4mg/L BAP+0.02mg/LNAA+0.211^/11^3;或1^ 基本培养基 +0.2 ?(λ 8mg/L BAP+0.2mg/L IAA+0.2mg/L GA 3。培养条件为:培养温度28°C，光照强度1600Lx，光照时数14h ；
[0064](4)株系建立与病毒检测:对来自不同品种/品系的茎尖初代培养建立的试管苗严格按株系序号进行继代培养建立株系，病毒检测先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牵牛植株叶片生长数日后观察引起的症状来鉴定，不出现症状得到无病毒的株系，再用血清学方法NCM-ELISA检测，其检测程序:样品米集一在膜上点样一加入封阻液一冲洗一添加特异病毒抗体一冲洗一加入酶标抗体一冲洗一显色一终止反应，得到无紫色反应(阴性)的脱毒株系；
[0065](5)快速繁殖:快速繁殖培养基组成为MS基本培养基+0.2mg/L IAA+0.5mg/L GA3;在30°C、16h/d条件下对步骤(4)所得脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
[0066]本实施例所得脱毒川薯101成苗率为72%。
[0067]下文通过实验对本发明所述技术方案取得的效果进行说明。
[0068]1、本发明所述方法所得茎尖2叶原基形态(如图1所示)由第I叶原基和第2叶原基及生长锥组成一个完整的生长点，实质是一个植株的雏形，其成苗率因茎尖2叶原基形态差异而在培养时分化生长的表现也不同，(如图2、图3所示)初代培养初期突起态表现弱小，不及半闭合态或闭合态粗壮，闭合态和半闭合态有较高的成苗率，突起态成苗率较低，分别是 92.9%,88.9%和 46.rI %。
[0069]2、茎尖的不同叶原基形态在培养过程中发现，外植体形成“愈伤组织”与“芽”具有促进和抑制两个方面的作用，一般在诱导培养初期茎尖基部愈伤化程度适合时对芽生长是有利的。观察发现，茎尖接种到培养基后的I?3周，由肉眼隐约可见0.22?0.35_大小到形成清晰可见0.6?3.0mm以上大小的一团绿色与浅绿色的初代培养物，其绿色部分为茎尖的生长锥和2个叶原基逐渐生长发育为包裹紧密的微型小芽，浅绿色部分为包围在小芽周围的愈伤组织，由培养初期培养基中附加的激素成分诱导形成，外植体与培养基接触面适度的愈伤化对微小的茎尖器官组织培养的成活是有利的。经过培养至第4?5周，茎尖的生长与其愈伤组织的形成是同步性进行的，可见起源于原来带2个叶原基的茎尖经培养后长出了 3个小芽，实际上为I个顶芽和2个腋芽的外观形态表现，即已经形成具茎节、叶片和顶芽的地上部分植株雏形。第6周后，转入新配制的无附加激素成分的相同培养基中，雏形植株再经过继代培养后便完成甘薯植株再生过程。
[0070]3、本发明所述方法提供MS基本培养基附加不同的激素体积质量分数(如图2所示)都能诱导甘薯茎尖分生组织萌发产生再生植株，但不同培养基对同一品种/品系的茎尖成苗率的影响很大。激素种类中，BAP是影响甘薯成苗率的重要因子，与0.01mg/L NAA组合时以0.8?1.4mg/L为好；与0.lmg/L IAA组合时以0.2?0.8mg/L为好。若BAP为2.0mg/L的培养基上，几乎所有品种/品系都有不同程度的、颜色较淡的大块愈伤组织出现，在转移后成苗率较其它愈伤组织分化成苗率低；IAA是影响甘薯成苗率的次要因子，但对茎尖生长无明显差异，其浓度在0.1?0.2mg/L为宜；加有GA3的培养基所诱导成功的植株比无GA3的培养基诱导的植株长势强，其浓度在0.1?0.5mg/L。不同品种/品系的成苗培养最适培养基基本一致，为 MS+0.8 ?L 4mg/L BAP+0.0 lmg/L NAA+0.lmg/L GA3；MS+0.2 ?0.8mg/L BAP+0.lmg/LIAA+0.lmg/L GA3。
[0071]4、本发明所述方法提供的茎尖2叶原基处于突起，半闭合和闭合3种不同形态时未在突起态的株系中检测出病毒，而在半闭合态及闭合态的株系中检测出单一 SPFMV，及(如图4c、4d所示)SPVG与SPFMV进行复合浸染的两种病毒，单一病毒和复合病毒的阳性率，三形态茎尖建立株系的脱毒率分别为100 %，83.9 %和71.9 %，平均脱毒率为85.3%。所得结果分析认为，甘薯茎尖2叶原基相同大小的分生组织中，在其半闭合态和闭合态时已经受到病毒的浸染，但其叶原基处于突起态时并未检测出病原，可能原因是茎尖分生组织旺盛的分生能力或生理特异性阻挡了病毒的传递，也可能是来源于薯块萌发植株生理发育进程的差异性存在少量病毒滞留于半闭合态和闭合态的叶原基中。由此说明，可以利用无毒操作技术无菌剥离2叶原基突起态的茎尖进行培养，能获得100%的脱毒植株。
[0072]5、本发明所述方法提供的培养基对甘薯脱毒苗的单茎节有特殊效果。以MS为基本培养基，BAP配比NAA、IAA、GA^合中，NAA具有促进植株生长的良好作用，但其体积质量分数应小于0.05mg/L ;IAA也具有促进叶片数增加的效果，其体积质量分数为0.lmg/L较适合，同时加入0.lmg/L GAJi长势也有一定效果。(如图5a所示)培养基附加BAP体积质量分数应小于0.2mg/L，否则茎段也极易愈伤组织化，腋芽难以生长并转向愈伤组织形成，说明脱毒苗茎段对BAP较敏感，BAP不能促进腋芽的生长。
[0073]6、不同培养方式对脱毒苗生长有影响，(如图5b、5c所示)固体和液体培养基对甘薯脱毒苗的单茎节离体快繁，生长温度在28°C以上，光照时数12?16h/d，25d后其株高、叶片数、鲜重和节间长液体培养都显著优于固体培养。
[0074]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种甘薯病毒苗茎尖脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)材料培养:取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽； (2)材料消毒:剪取生长至1.5?2.0cm长的顶芽进行消毒； (3)接种培养:从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接种培养，获得再生植株； (4)株系建立与病毒检测:对步骤(3)所得再生植株经2?3次继代培养建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系； (5)快速繁殖:对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述消毒具体为:先用体积分数为75%的乙醇浸泡25?30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数0.1%的HgCl2浸泡8?lOmin，无菌水冲洗3?5遍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述茎尖大小为0.22?0.35mm。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述茎尖形态为突起态、半闭合态或闭合态。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述接种培养的培养基由以下成分组成:基本培养基MS，0.8?1.4mg/L BAP，0.01?0.02mg/L NAA ;或基本培养基MS，0.2 ?0.8mg/L BAP, 0.1 ?0.2mg/L ΙΑΑ。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述接种培养的培养条件为:温度25?30°C，光照强度1600Lx，光照时数12?14h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述检测具体为:以试管苗株系对巴西牵牛用涂抹法和嫁接法观察病毒引起的症状，以巴西牵牛为指示植物进行检测后确认无毒的试管苗株系再用NCM-ELISA法进行检测。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述快速繁殖的培养基由以下成分组成:MS 基本培养基，0.1 ?0.2mg/L IAA, 0.1 ?0.5mg/L GA30
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述快速繁殖的条件为:温度28?30°C，光照时数12?16h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)材料培养:选取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，洗净表面后用30?35mg/kg GA3浸种25?30min，用消毒湿砂覆埋于25?27°C黑暗催芽，当芽露出砂面后用38?40°C热处理7?8d ; (2)材料消毒:剪取生长旺盛的长1.5?2.0cm顶芽，在超净工作台上切去完全展开的叶片，然后消毒；消毒时将材料先用体积分数为75%的乙醇浸泡25?30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1 %的HgCl2浸泡8?lOmin，无菌水冲洗3?5遍； (3)接种培养:在解剖镜下无菌剥离0.22?0.35mm大小的生长点带2个叶原基，接种在预先制备好的培养基中，培养基组成为:MS基本培养基+0.8?1.4mg/L BAP+0.01?.0.02mg/L ΝΑΑ+0.1 ?0.2mg/L GA3;或 MS 基本培养基 +0.2 ?0.8mg/L ΒΑΡ+0.1 ?0.2mg/L IAA+0.1?0.2mg/L GA3;培养条件为:培养温度26?28°C，光照强度1500?1600Lx，光照时数12?14h ; (4)株系建立与病毒检测:对来自不同品种/品系的茎尖初代培养建立的试管苗严格按株系序号进行继代培养建立株系，病毒检测先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牵牛植株叶片生长数日后观察引起的症状来鉴定，不出现症状得到无病毒的株系，再用NCM-ELISA法检测，其检测程序为:样品米集一在膜上点样一加入封阻液一冲洗一添加特异病毒抗体一冲洗一加入酶标抗体一冲洗一显色一终止反应，得到无紫色反应的脱毒株系;(5)快速繁殖:快速繁殖培养基组成为MS基本培养基+0.1?0.2mg/L ΙΑΑ+0.1?.0.5mg/L 6^;在28?30°C、12?16h/d条件下对步骤(4)所得脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
【文档编号】A01H4/00GK104429953SQ201410671976
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】黄远新, 王季春, 张凯, 唐道彬, 何凤发, 吕长文, 赵勇, 刘勋 申请人:西南大学