专利名称：葡萄离体茎段的脱毒方法
技术领域：
本发明涉及果树生物技术领域，具体的说，涉及一种葡萄离体茎段的脱毒技术。
背景技术：
目前国内已报道葡萄病毒病主要有9种扇叶病、卷叶病、茎痘病、栓皮病、斑点病、脉坏死病、耳突病、星状花叶病和缩叶病。其中，扇叶病与卷叶病是我国葡萄生产中分布最广、危害最严重的病毒病种类。据调查，目前我国葡萄栽培区域内，85%以上的葡萄园普遍发病，给葡萄生产带来了极大的损失。郭德银等采用间接ELISA法，随机检测了 35个葡萄品种，带扇叶病毒率高达74.3%。何水涛等对国家葡萄种质资源圃(郑州)内39个品种共78株葡萄进行了 PAS-ELISA检测，带毒率为76. 9%。鉴于繁殖材料带病毒是葡萄病毒病的主要传播途径，因此，对葡萄繁殖材料进行病毒脱除，建立无病毒的葡萄原原种圃、母本园和苗圃等无病毒苗木的生产体系，以保证栽植材料健康无毒，是防治葡萄病毒病的关键。据报道，目前用于脱毒最有效的方法是“热处理并结合茎尖培养”。尚志华将转接后20天的组培苗置于光照1000-2500LX的培养箱内，起始温度设为34°C，以后每天升高 I0C，直到37°C (白天37°C，夜间25°C )，热处理40_60d后，剥取0. 5mm的茎尖，经检测的脱除率可达62. 5% ；张金文等用此方法对7个葡萄品种进行病毒脱除，将试管苗置于35-37°C 温度下热处理45-60d，结果发现葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱毒率高达92%。根据目前的报道，对葡萄栽植材料的脱毒虽然取得了很好的进展，但仍存在许多问题，主要为(1)用于脱毒的试管苗材料不耐热，脱毒过程中植株死亡，获得的微茎尖数量少；(2)需要将温度逐渐升高或昼夜变化，并同时控制湿度和光照，对研究环境及条件设施要求严格，通用性差；C3)程序繁杂，脱毒需要的时间长，因此培育葡萄无病毒苗木的周期也相对较长；(4)从试管材料的准备、生根到茎尖培养需要不同的培养基；(4)前人发表的一些文章虽然获得了较高的脱毒率，但并未与脱毒前材料的带毒情况作比较，因此其较高的脱毒率也有待进一步实验。针对这些问题，我们借助前人的经验开展了进一步的研究，旨在创建一种脱毒率高、操作方便简单、通用性强的高效脱毒技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄离体茎段的脱毒方法。此方法既不要求光照，也不要求频繁变温处理，操作简单、省时、省电、省工，效率高、成本低，对研究环境及条件设施要求不十分严格，只要具备组培条件的研究及教学单位均可应用。本发明所述的葡萄离体茎段的脱毒方法，包括如下步骤1)选择继代培养至茎半木质化的葡萄品种或相关砧木的试管苗，无菌条件下剪取单芽茎段接种在培养基中，置于22-28°C、2000-30001x培养室培养至刚露出小白根，得到葡萄离体茎段；
2)将葡萄离体茎段置于35-40°C的培养箱中，暗处理并同时进行热处理；3)热处理IOd后开始观察侧芽生长情况，当黄化嫩梢长至6-lOcm，在无菌条件下剥取0. 2-0. 8mm左右的微茎尖，置于培养基中培养，直至得到繁殖材料。其中，本发明的方法中，步骤1)和幻都采用同一种培养基，所述培养基是添加了 0. 1-0. 5mg/L IAA, 15_30mg/L 蔗糖，以及 4. 5-7. Omg/L 琼脂或明胶，pH 为 5. 8 的改良 B5 培养基。优选的，所述培养基是添加了 O.ang/L IAA，20mg/L蔗糖，5.0!^/1琼脂或明胶，？!1 为5.8的改良B5培养基。其中，IAA是吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid)的简称，生物学名称为生长素，是一种植物激素。其中，所述蔗糖可选用白砂糖、绵白糖等本领域常用蔗糖中的一种或多种。改良B5培养基的配方包括下表的各组分
权利要求
1.一种葡萄离体茎段的脱毒方法，包括如下步骤1)选择继代培养至茎半木质化的葡萄品种或相关砧木的试管苗，无菌条件下剪取单芽茎段接种在培养基中，置于22-28°c、2000-30001x培养室培养至刚露出小白根，得到葡萄离体茎段；2)将葡萄离体茎段置于35-40°C的培养箱中，暗处理并同时进行热处理；3)热处理IOd后开始观察侧芽生长情况，当黄化嫩梢长至6-lOcm，在无菌条件下剥取 0. 2-0. 8mm左右的微茎尖，置于培养基中培养，直至得到繁殖材料。
2.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，所述培养基是添加了0. 1-0. 5mg/L IAA, 15-30mg/L蔗糖，以及4. 5-7. Omg/L琼脂或明胶，pH为5. 8的改良B5培养基；其中，所述改良B5培养基包括以下组分KNO31250mg/L ；MgSO4 · 7H20125mg/L ；NaH2PO4 · H2O85. 4mg/L ；CaCl2113. 2mg/L (NH4)2S0467mg/L ；KI0.375mg/LH3BO41. 5mg/L ；MnSO4 · 4H205mg/L ；ZnSO4 · 7H201. Omg/L ；Na2MoO4 · 2H200.125mg/L ；CoCl2 · 6H200.0125mg/LCuSO4 · 5H200.0125mg/LNa2-EDTA37. 3mg/L ；FeSO4 · 7H2027. 8mg/L ；肌醇25mg/L ；；烟酸1. Omg/L ；盐酸吡哆醇1. Omg/L ；盐酸硫铵1Omg/Lο
3.如权利要求2所述的脱毒方法，其特征在于，所述培养基是添加了O.aiig/L IAA, 20mg/L蔗糖，5. Omg/L琼脂或明胶，pH为5. 8的改良B5培养基。
4.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤1)是置于23-27°C、 2000-25001x的培养室中培养；优选置于27°C、20001x的培养室中培养。
5.如权利要求1或4所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤1)中在培养室中的培养时间为5-10d，优选7d。
6.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤2)是置于37-39°C的培养箱进行热处理；优选置于38°C的培养箱进行热处理。
7.如权利要求1或6所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤2)的暗处理如下进行 将葡萄离体茎段置于有盖箱中，然后置于培养箱中，进行处理。
8.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，步骤幻中，当黄化嫩梢长至8-9cm，在无菌条件下剥取0. 5mm的微茎尖。
9.如权利要求1-8所述的脱毒方法的应用，其特征在于，用于葡萄品种及相关砧木的脱毒。
10.一种用于葡萄离体茎段脱毒的培养基，其特征在于，所述培养基是添加了 0. 1-0. 5mg/L IAA, 15_30mg/L 蔗糖，以及 4. 5-7. Omg/L 琼脂或明胶，pH 为 5. 8 的改良 B5 培养基；优选为添加了 0. 2mg/LIAA、20mg/L蔗糖，以及5. Omg/L琼脂，pH为5. 8的改良B5培养基；其中，所述改良B5培养基包括以下组分KNO31250mg/L ；MgSO4 · 7H20125mg/L ；NaH2PO4 · H2O85. 4mg/L ；CaCl2113. 2mg/L ；(NH4) 2S0467mg/L ；KI0. 375mg/LH3BO41. 5mg/L ；MnSO4 · 4H205mg/L ；ZnSO4 · 7H201. Omg/L ；Na2MoO4 · 2H200. 125mg/L ；CoCl2 · 6H200.0125mg/LCuSO4 · 5H200.0125mg/LNa2-EDTA37. 3mg/L ；FeSO4 · 7H2027. 8mg/L ；肌醇25mg/L ；烟酸1. Omg/L ；盐酸吡哆醇1. Omg/L ；盐酸硫铵1Omg/Lο
全文摘要
本发明涉及一种葡萄离体茎段的脱毒方法，包括如下步骤1)选择继代培养至茎半木质化的葡萄品种或相关砧木的试管苗，无菌条件下剪取单芽茎段接种在培养基中，置于22-28℃、2000-3000lx培养室培养至刚刚露出小白根，得到葡萄离体茎段；2)将葡萄离体茎段置于35-40℃的培养箱中，暗处理并同时进行热处理；3)热处理10d后开始观察侧芽生长情况，当黄化嫩梢长至6-10cm，在无菌条件下肉眼剥取0.2-0.8mm左右的微茎尖，置于培养基中培养，直至得到繁殖材料。本发明既不要求光照，也不要求频繁变温处理，操作简单、省时、省电、省工，效率高、成本低，对研究环境及条件设施要求不十分严格，只要具备组培条件的研究及教学单位均可应用。
文档编号A01H4/00GK102232358SQ201010168170
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月4日 优先权日2010年5月4日
发明者吴永杰, 吴雅琴, 李玉生, 程和禾, 赵艳华 申请人:河北省农林科学院昌黎果树研究所