专利名称：针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘薯病毒的基因和干涉载体，属于生物工程技术领域，特别是涉及针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体。
背景技术：
甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物，近年来甘薯的用途越来越受到人们的关注。甘薯病毒病是影响甘薯生产的重要限制因素之一，病毒病的感染可造成甘薯产量下降、品质变劣和种性退化，一般可减产30%_50%。甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle ri/YAs，SPFMV)、甘薯潜隐病毒potato latent ri/YAs，SPLV)和甘薯G病毒(5’呢对potato virus G, SPVG)是危害甘薯的三种主要病毒，这三种病毒分类上都属于马铃薯Y属(/^ij^irm)病毒。在田间这几种病毒常常混合侵染，对甘薯生产造成严重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用基因工程技术构建RNA干涉(RNAi)载体，培育抗病毒转基因甘薯是防治病毒病危害的最有效方法之一。经检索，目前还未发现利用RNA干涉技术防治甘薯病毒病危害的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服现有防治甘薯病毒病的缺点，提供一种针对三种甘薯病毒的融合基因，还提供了对三种病毒有明显干扰抑制作用的RNA干涉载体。本发明的技术方案
针对三种甘薯病毒的融合基因序列为SEQ1，命名为SPFLG。三种甘薯病毒的RNA干涉载体，其构建方法包括以下步骤
(1)引物设计根据三种甘薯病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物， 具体如下
SPFLG-XbaI 5' -CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3’， SPFLG-SpeI 5' -AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3'； SPFLG-KpnI 5'-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3，， SPFLG-ClaI 5' -AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3’ ；
(2)甘薯病毒RNA干涉载体构建
将权利要求1所述的SPFLG基因克隆到T载体上，命名为SPFLG-T，以SPFLG-T为模板， 分别以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI 为引物，进行 PCR 扩增，将获得的目的基因SPFLG分别用损al和RKpnl和CZaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiMntron载体的内含子两侧；然后利用损aI和^^I进行双酶切，回收含有反向重复目的基因的片段，将其克隆到中间载体PR0K219上，所述含有反向重复目的基因的片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pROKSPFLG ；用和历/7dIII酶切pROKSPFLG，回收包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子的目的片段，克隆到植物表达载体pBmi9上，命名为pBINSPFLG。所述PCR扩增反应程序为94 V预变性5min，94 V变性30s，58 V退火30s，72 °C延伸40s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。所述三种甘薯病毒为甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒。所述的RNA干涉载体在防治病毒甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒中的应用。本发明的积极有益效果
(1)本发明根据SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物，以质粒SPFLG-T为模板，将融合基因SPFLG以反向重复的方式克隆到pBlue MRIntron载体的内含子两侧，再将含有内含子的反向重复片段插入到中间载体pR0K219 上，将包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子目的片段克隆到植物表达载体PBIN19 上，成功构建了含有三种病毒CP基因保守区反向重复序列的RNA干涉载体。(2)将本发明的RNA干涉载体利用冻融直接转化法转入土壤农杆菌EHA105中，利用农杆菌浸润法测定了该载体对三种/^ij^irMM病毒的干扰作用。结果表明，构建的RNA 干涉载体对SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒有明显的干扰作用，农杆菌浸润后，三种病毒的含量明显减低，说明构建的RNAi载体能抑制三种甘薯病毒基因的表达。(3)本发明针对甘薯上普遍发生的三种病毒，成功构建了对三种病毒有明显干扰抑制作用的RNAi载体，为培育同时抗三种病毒的转基因甘薯奠定了基础。
图1 目的片段SPFLG的PCR扩增图。图中，M :DL2000分子量标记，1 SPFLG PCR扩增产物。图2 pROKSPFLG经损a I和式ot I酶切验证图。图中，M :DL2000分子量标记，1 pROKSPFLG经损aI和幻7/ I酶切的产物。图 3 :pBINSPFLG经^boRI 禾口历'/ dIII 酶切验证图。M :DL2000分子量标记，1 :pBINSPFLG经&0RI和历idIII酶切的产物。图4 甘薯叶片经农杆菌浸润前后SPFMV病毒含量的变化。图5 甘薯叶片经农杆菌浸润前后SPVG病毒含量的变化。图6 甘薯叶片经农杆菌浸润前后SPLV病毒含量的变化。图4、图5、图6中，横坐标表示浸润时间，纵坐标表示样品在0D405时的吸光值，代表病毒的含量，黑色实柱表示未处理的病毒含量，白色实柱表示处理后的病毒含量。
具体实施例方式实施例1 针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体 (一)材料与方法
1、SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒融合基因的设计与合成
分析SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒CP基因的保守区域，各选取200 bp左右的片段， 其中SPFMV CP基因保守区l^bp，位于其CP基因的第748-945bp处；SPLV CP基因保守区189bp，位于其CP基因的第691-879bp处；SPVG CP基因保守区l^bp，位于其CP基因的第868-1065bp处。按照SPFMV-SPLV-SPVG的顺序进行融合，作为完整的目的基因，命名为 SPFLG。为了便于载体的构建，在该基因的5 ‘端引入IhI位点，在其3 ‘端引入分el位点，并各加三个保护碱基，以使酶切位点更加有效。合成的基因长度为60;3bp，基因合成后克隆到T载体上，命名为SPFLG-T。基因全序列如下
1 CCTTCTAGAT ACGAGCTGCA TTCAACCACC CCTGCACGTG CAAAAGAAGC ACATTTACAG
61 ATGAAGGCAG CCGCGCTTAA GAATGCGAAA AATCGGTTGT TTGGTTTGGA CGGAAACGTC121TCCACGCAAGAAGAAGATACGGAGAGGCACACGACAACTGATGTTACTAGAAATATACAT181AACCTCTTAGGAATGAGGGGTGTGCAAACATCACGCACACCCATTCGCGCCAAGGAAGCA241TACTTCCAGATGAAAGCTGTAGCGCTCACAAATACACATCATCGGCTGTTCGGTCTGGAT301GGAAATGTCTCAACCACTGAGGAAAACACCGAGCGGCATACTGCAACAGATGTGGACCGG361AACATACACACACTACTTGGAATGCGTGGCATCCATTATGAGCTGCACTCGAACACTCCT421GTTCGGGCCAGAGAGGCACATATGCAAATGAAAGCAGCAGCACTTAAGAACGCACAAAAT481CGGTTGTTTGGTTTGGACGGAAACGTCTCCACGCAGGAAGAAGATACGGAGAGGCATACA541ACGACTGATGTTACAAGGAATATACATAACCTCTTGGGTATGAGGGGTGTGCAGACTAGT601ACT。注序列中划线部分分别代表IhI和分el的酶切位点。2、RNAi载体的构建 (1)引物的设计与合成
根据SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物，用于载体的构建，引物由上海生工生物工程有限公司合成，设计的两对引物如下 SPFLG-XbaI 5’-CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3’ ， SPFLG-SpeI 5，-AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3，， SPFLG-KpnI 5，-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3'， SPFLG-ClaI 5’-AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3’ 。注引物序列中的小写字母分别代表损al、分el、&7/7l和Cleil的酶切位点。(2)酶和试剂(盒)
大肠杆菌(fecAericAia co7i)DH5a菌株和农杆菌EHA105菌株由本实验室保存； UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)等购自上海生工生物工程有限公司；pMD18-T、DL2000 marker、dNTP、位-7 《酶、T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶等购自TaKaRa公司；其它常用试剂为国产分析纯。(3)三种甘薯病毒RNAi载体的构建
以质粒 SPFLG-T 为模板，分别以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI 为引物，进行 PCR扩增，PCR 反应体系为 50μ1，包括 5μ1 10XPCR buffer、2. 5 U Taq酶、 μ 浓度各为10mM&dNTP混合物、 μ 上游引物、 μ 下游引物，其中引物浓度均为ΙΟμΜ，用 μ SPFLG-T质粒作模板，用ddH20补足至50μ1。PCR扩增反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，30个循环，最后72°C延伸IOmin0 将获得的目的基因SPFLG分别用XbaY和分el RKpnl和Cla\酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiMntron载体的内含子两侧；经损al和^酶切后，回收含有反向重复目的基因的片段，将其克隆到中间载体PR0K219上，所述含有反向重复目的基因的片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pROKSPFLG -MEcoRl和历/ dIII酶切 pROKSPFLG后，回收包括35S启动子、反向重复片段、NOS终止子的目的片段，克隆到植物表达载体pBmi9上，命名为pBINSPFLG。(4) RNAi载体对三种病毒抑制效果的测定
利用直接冻融转化法将pBINSPFLG载体转入土壤农杆菌EHA105菌株中，取单菌落接种于:3ml LB培养基[含有卡那霉素(100mg/ml Kan)和利福平(100mg/ml Rif)]中，28°C 振荡培养过夜；取Iml活化后的菌液接入50ml LB培养基(含有100mg/ml Kan和100mg/ml Rif)中振荡培养至合适浓度(0D600约0. 8-1. 0) ； 4°C、4000rpm离心15min，沉淀用 MMA 缓冲液(1 Ommol/L MgCl2、10mmol/L 2-吗啉乙磺酸 MES、100 μ mol/L 乙酰丁香酮 AS)重悬，菌液终浓度为0D600约1. 0-2. O ；室温静置2 hr以上，用Iml注射器对合适苗龄的含有三种病毒的甘薯叶片进行浸润。分别选取浸润后O天、15天及30天的甘薯上部叶片，用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定浸润前后叶片中三种甘薯病毒含量的变化，处理和未处理的甘薯各取12株， 取其平均值。(二)结果与分析 URNAi载体的构建
以质粒 SPFLG-T 为模板，分别以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI为引物，进行PCR扩增，获得目的基因SPFLG (参见图1)，将目的基因分别用 Xbal和分el RKpnl和Clal酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧；经损al和^otI酶切后，回收目的片段，克隆至中间载体pR0K219上(参见图 2)，命名为pROKSPFLG ；经和历idIII酶切pROKSPFLG后，回收包括!35S启动子、反向重复片段、NOS终止子的目的片段，克隆至双元植物表达载体pBIN19上(参见图3)，命名为 pBINSPFLG。2、RNAi对三种病毒的抑制效果
分别选取浸润后O天、15天及30天的甘薯上部叶片，用ELISA检测浸润前后叶片中三种甘薯病毒含量的变化，处理和未处理的甘薯各取12株，取其平均值。结果表明农杆菌浸润后，三种病毒的含量明显降低，参见图4、5、6，图中可看出，在浸润后15天左右作用效果最明显，说明本发明构建的RNAi载体能抑制三种甘薯病毒基因的表达。
权利要求
1.针对三种甘薯病毒的融合基因，其特征在于，所述融合基因的序列为SEQ1，命名为 SPFLG。
2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述三种甘薯病毒为甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒。
3.三种甘薯病毒的RNA干涉载体，其特征在于，其构建方法包括以下步骤(1)引物设计根据三种甘薯病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物， 具体如下SPFLG-XbaI :5’-CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3’，SPFLG-SpeI :5，-AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3’ ；SPFLG-KpnI 5'-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3'，SPFLG-ClaI :5’-AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3’ ；(2)甘薯病毒RNA干涉载体构建将权利要求1所述的SPFLG基因克隆到T载体上，命名为SPFLG-T，以SPFLG-T为模板， 分别以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI 为引物，进行 PCR 扩增，将获得的目的基因SPFLG分别用损al和RKpnl和CZaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiMntron载体的内含子两侧；然后利用损aI和^^I进行双酶切，回收含有反向重复目的基因的片段，将其克隆到中间载体PR0K219上，所述含有反向重复目的基因的片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pROKSPFLG ；用和历/7dIII 酶切pROKSPFLG，回收包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子的目的片段，克隆到植物表达载体pBmi9上，命名为pBINSPFLG。
4.根据权利要求3所述的RNA干涉载体，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为 94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，30个循环，最后72°C延伸 IOmin0
5.根据权利要求3所述的RNA干涉载体，其特征在于，所述三种甘薯病毒为甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒。
6.权利要求3所述的RNA干涉载体在防治病毒甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体。针对三种甘薯病毒的融合基因序列为SEQ1，命名为SPFLG。其干涉载体构建时，先设计SPFLG-XbaI和SPFLG-SpeI以及SPFLG-KpnI和SPFLG-ClaI两对引物，将SPFLG基因克隆到T载体上，以SPFLG-T为模板，分别以两对引物进行PCR扩增，将获得的目的基因SPFLG分别用XbaI和SpeI及KpnI和ClaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlueNiRIntron载体的内含子两侧；然后利用XbaI和KpnI进行双酶切，回收目的基因的片段，将其克隆到中间载体pROK219上；用EcoRI和HindIII酶切pROKSPFLG，回收包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子的目的片段，克隆到植物表达载体pBIN19上，命名为pBINSPFLG。试验表明，本发明构建的RNA干涉载体对SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒有明显的干扰作用，为培育同时抗三种病毒的转基因甘薯奠定了基础。
文档编号C12N15/82GK102206661SQ20111007999
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者乔奇, 张德胜, 张振臣, 张磊, 田雨婷, 秦艳红, 郑文明 申请人:河南省农业科学院