专利名称：肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种手足口病的体外诊断试剂盒，尤其涉及肠道病毒CoxAie型/EV71 型/通用型核酸检测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。
背景技术：
手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征的一种急性传染病。绝大多数HFMD患者预后良好，一般可在5 7天痊愈，属于自限性疾病。 病毒还可以侵犯呼吸系统、中枢神经系统等引起脑炎、肺水肿、弛缓性麻痹、心肌炎等症状， 个别危重患儿可因多种原因导致死亡。该病全年均可发病，好发于夏秋季，常见于5岁以下的儿童。HFMD的主要传播途径是粪-口途径，亦可通过呼吸道传播。HFMD传染性强，易导致流行或暴发。HFMD分布极广泛，无严格地区性。HFMD全年均可发病，有明显的季节特点， 以夏秋季多见。引起HFMD的主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsacki evirus)A组的4型、5型、7型、9型、10型、16型；柯萨奇病毒B组的2型、5型； 部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16) 及肠道病毒71型(EV71)。人对引起HFMD的肠道病毒普遍易感，各年龄组均可感染发病，但以隐性感染为主，隐性感染与显性感染之比约为100 1。由于机体受病毒感染后，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同型病毒感染产生牢固的免疫力，因此，HFMD的患者主要为学龄前儿童，尤其是5岁以下儿童，占发病数90%以上。而大多数成人可携带病毒但不发病。1岁以内的儿童发生心肌炎、脑炎等重症的比例较1岁以上儿童高。中国手足口病流行，1981年上海首次报道手足口病；1983年天津发生CoxAie引起的手足口病暴发；1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71 ；1998年中国台湾地区129106例HFMD，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡；1999年以来，中国广东、福建、上海、重庆等地区报告局部流行EV71感染；2007年山东临沂流行以EV71为主的手足口病；2008 2009年安徽阜阳、河南、山东等地大规模流行。主要为CoxAie和EV71 共循环引起手足口病发，EV71在大部分省市为优势病毒。以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，在目前中国国内的临床诊断中应用最为广泛。在探针法的实时荧光PCR反应体系中，根据所检测病原体的多少，还可以分为单重或多重实时荧光PCR技术，反应体系中往往包括一对或多对特异性PCR引物及探针，通过研发过程中的条件摸索，探针及引物只与相对应的模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5'端标记有报告基团(R印orter，R)，如FAM、VIC、R0X等，3'端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3' -5'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号(
图1)。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。现有的手足口病的体外诊断试剂盒大多存在特异性和灵敏性较低、检测步骤繁琐等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明的主要目的提供是一种能够同时在同一反应管中分别检测出肠道病毒 EV71型、CoxAie或其它致手足口病的肠道病毒的三重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点。为了达到上述目的，本发明采用了这 样的技术方案一种肠道病毒CoxAie型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒，包括以下各组分 RT-PCR反应液、酶混合液、CoxA 16型/EV71型/通用型三重反应液、去RNA酶水。其中，所述的肠道病毒CoxAie型/EV71型/通用型反应液包括以下3组组分(1) 一对检测肠道病毒CoxA16型的引物，其碱基序列分别为SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示；一对检测肠道病毒CoxA16型探针，其碱基序列分别为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，其中，SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4的'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；(2) —对检测肠道病毒EV71型的引物，其碱基序列分别为SEQ IDNo. 5和SEQ ID No. 6所示；一条检测肠道病毒EV71型的探针，其碱基序列为SEQ ID No. 7所示；其中，该探针的'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；(3) —对检测肠道病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示；一条检测肠道病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQID No. 10所示；其中上述探针的'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果肠道病毒肠道病毒CoxA16型的引物及探针的配比分别为SEQ IDNo. 1 SEQ ID No. 2 SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4 = 400nM 400nM IOOnM IOOnM ；检测肠道病毒CoxA16型的引物及探针的配比分别为SEQ ID No. 5 SEQID No. 6 SEQ ID No. 7 = 600nM 600nM 200nM ；肠道病毒通用型引物的引物和探针的配比分别为SEQ ID No. 8 SEQ IDNo. 9 SEQ ID No. 10 = 500nM 500nM 400nM。表1肠道病毒CoxA16型、EV71型、通用型引物探针
权利要求
1.一种肠道病毒CoxAie型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分=RT-PCR反应液、酶混合液、CoxA16型/EV71型/通用型三重反应液和去RNA酶水。
2.按照权利要求所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的肠道病毒CoxAie型/EV71型 /通用型反应液包括以下3组组分组分(1)一对检测肠道病毒CoxA16型的引物，其碱基序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；一对检测肠道病毒CoxA16型探针，其碱基序列分别为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，其中，SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；组分—对检测肠道病毒EV71型的引物，其碱基序列分别为SEQID No. 5和SEQ ID No. 6所示；一条检测肠道病毒EV71型的探针，其碱基序列为SEQ ID No. 7所示；其中，SEQ ID No. 7的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；组分(3)—对检测肠道病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQID No. 8和SEQ ID No. 9所示；一条检测肠道病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQ ID No. 10所示；其中SEQ ID No. 10的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
3.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于组分(1)中引物及探针之间的配比为SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2 SEQ ID No. 3 SEQID No. 4 = 400nM 400nM IOOnM ΙΟΟηΜ。
4.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于组分( 中引物及探针之间的配比为SEQ ID No. 5 SEQ ID No. 6 SEQ ID No. 7 = 600nM 600nM 200nM。
5.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于组分(3)中各探针之间的配比为 SEQ ID No. 8 SEQ ID No. 9 SEQ ID No. 10 = 500nM 500nM 400nM。
6.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液包括去RNA 酶水、IOXPCR 缓冲液、25mM Mg2+UOmM dNTPs。
7.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液包括RNA酶抑制剂、Taq酶、逆转录酶、10X缓冲液、去RNA酶水。
8.按照权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于所述逆转录酶是M-MLV逆转录酶； 所述DNA聚合酶是热启动酶。
9.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于还含有肠道病毒CoxA16/EV71型/ 通用型阳性参考品。
10.权利要求1所述试剂盒在检测肠道病毒CoxAie型、EV71型或其它肠道病毒的应用，包括(1)提取样本的RNA；(2)准备以下组分=RT-PCR反应液12.5ul，酶混合液lul，CoxA16型/EV71型/通用型反应液如1，去RNA酶水2. 5ul, RNA样本5ul ；(3)RT-PCR扩增按照以下程序进行RT-PCR扩增 50 0C 30min 95 °C 5min
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒，其包括以下各组分RT-PCR反应液、酶混合液、CoxA16型/EV71型/通用型三重反应液和去RNA酶水。本发明肠道病毒CoxA16型/EV71型/通用型核酸检测试剂盒能够在同一反应管中同时检测出肠道病毒CoxA16型、EV71型或者其它肠道病毒，解决了现有体外检测试剂盒无法在同一反应管中同时检测与手足口病相关的肠道病毒的问题。本发明检测试剂盒特异性强、灵敏度高，还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点。
文档编号C12R1/93GK102154520SQ201110079878
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者严浩荣, 刘中华, 张旭, 李秀林, 王国强 申请人:江苏硕世生物科技有限公司