肠道病毒71型3cd嵌合病毒及其拯救方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种肠道病毒71型3⑶嵌合病毒及其拯救方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西 兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒，并于1959年首次提出HFMD命名。早期发现 的手足口病的病原体主要为CoxA16型，手足口病与EV71感染有关的报道开始于20世纪 70年代初，1972年EV71首次在美国确认。此后EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为 手足口病的主要病原体。其多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数 患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情进展较快，导致死亡。重 症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起。
[0003] 肠道病毒71型?V71)属于小RNA病毒科（Picornaradae)肠道病毒属 (Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71抗体在成人血清中的阳性率达到65% 以上，说明了这种病毒的广泛传播，每年春夏季温度升高时都会进入感染高峰期，流行趋势 从散发逐渐趋于有小型聚集性爆发。
[0004] 手足口病的相关科研工作起步较晚，发达国家拥有较好的科研平台，亚太地区为 主要流行区域，但对EV71的基础研究投入不够，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物， 对EV71进行有效的预防和控制。由于肠道病毒71型属于小RNA病毒科，所以其基因组的 人工操作较难，这给疫苗的制备增加了难度。
[0005] 因此目前对EV71的疫苗研究仍主要聚焦在传统的灭活疫苗上，而此类疫苗的免 疫效果一般较低；虽然能够诱导产生包括中和抗体在内的免疫反应，但不能诱导细胞毒T 淋巴细胞反应；诱导产生的免疫反应持续时间较短，需要多次接种；需要使用佐剂，制剂中 存在灭活剂，灭活剂对病毒抗原有影响；由于诱导的免疫反应水平较低，以及各个抗原成分 之间的疫苗应答不平衡，可能诱发疾病；一般不能通过自然途径接种，不易产生局部免疫反 应。由于以上问题的存在，亟需研发新型疫苗，既能保留完整的免疫原性，有效刺激免疫应 答，又能避免感染性。此类疫苗的研制，需要对病毒基因组中各基因编码区域的功能进行深 入研究和了解，这种深入了解还有助于筛选抗病毒药物的靶点研究。
[0006] 反向遗传学方法研究RNA病毒，是在质粒水平上来操作、研究RNA病毒，获得的拯 救病毒表型稳定，操作方便，为EV71的深入研究提供了一个很好的基础平台。但迄今还没 有合适的病毒作为疫苗研究的工具。
[0007] 现有技术中没有研究者做EV71拯救病毒的，主要是存在技术偏见EV71的反向遗 传学研究是无法实现的，此外由于EV71拯救病毒是一种新的病毒，所以在研究拯救方法时 就存在很大的不可预期性，如何克服这种不可预期性是现有技术中无法做到的。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是为了提供一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和应 用。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒，拉丁文学名：（Humanenterovirus713CD chimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市 武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201523。
[0011] 本发明病毒的形态特征描述：
[0012] 该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24~ 30nm，核酸为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的四种结构蛋白VPl~VP4构成原聚 体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最 终形成病毒的外壳。该病毒感染敏感细胞RD细胞后，形成的CPE特征为细胞变圆、固缩、折 光性增强，然后脱落。
[0013] 一种肠道病毒71型3⑶嵌合病毒的拯救方法，步骤如下：
[0014] (1)以SDLYl(GenBank，HM188481. 1)全长cDNA为PCR模板，引物 1 (序列见表 2， SEQIDNo. 1)为上游引物，引物5 (序列见表2,SEQIDNo. 5)为下游引物扩增3CD蛋白编 码区；
[0015] (2)以SDLY107(GenBank，JX244186. 1)全长cDNA为PCR模板，引物 6(序列见表 2，SEQIDNo. 6)为上游引物，引物4 (序列见表2,SEQIDNo. 4)为下游引物扩增3'UTR编 码区；
[0016] (3)采用融合PCR方法，以引物1，SEQIDNo. 1为上游引物，引物4,SEQIDNo. 4 为下游引物将两个片段连接起来得到融合片段3CD(l)-3'UTR(107);
[0017] (4)将（3)中融合PCR产物3CD(l)-3'UTR(107)克隆连接入pMD19-T载体，形成 pMD19-T-3CD(l)-3'UTR(107);
[0018] (5)将pMD19-T-SDLY107 质粒以及步骤⑷得到的pMD19-T-3CD(l)-3'UTR(107) 质粒分别进行HindIII和XbaI双酶切，回收酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组 病毒质粒口]\?19-1'-107(1-3〇));
[0019] (6)将步骤（5)得到的pMD19-T-107(l-3CD)进行质粒扩增，并使用HindIII和 XbaI双酶切，回收107 (1-3CD)，体外转录后转染入RD细胞，37°C、5% 0)2细胞培养箱中培 养，传代3次以上直至细胞病变稳定即为肠道病毒71型3⑶嵌合病毒。
[0020]所述步骤（5)、（6)中酶切的具体步骤如下：HindIII与XbaIFastDigestenzyme 各2.5yL，质粒（5中为pMD19-T-SDLY107质粒和pMD19-T-3CD(l)-3'UTR(107)质粒；6 中 为pMD19-T-107(l-3CD)质粒）<2.5yg，10XFastDigestGreenBuffer5yL，水补齐至 50y1，37°C酶切3-4h。
[0021] 所述步骤（5)中具体为：将pMD19-T-107(l-3⑶）进行质粒扩增后双酶切得到 107 (1-3⑶)、体外转录后进行RNA转染，RD细胞转染RNA后，37°C二氧化碳培养箱中培养以 期病毒的拯救，通过每日观察细胞病变发现拯救病毒颗粒的出现，当CPE达到90%病变时， 冻融一次（避免多次冻融）收获上清即为第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接种细胞培 养板中（优选取500y1接种24孔细胞培养板中），放入37°C二氧化碳培养箱中继续培养， 培养5天后未出现明显的CPE，冻融一次（避免多次冻融），10,OOOg离心IOmin收获上清，命 名为二代拯救病毒；继续上述步骤接种二代病毒，约36h后出现病变，72h后病变达到90 %，冻融三次收获病毒。反复操作传代3次以上直至细胞病变稳定即为拯救成功的病毒。
[0022] 上述肠道病毒71型3⑶嵌合病毒在制备疫苗中的应用。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024]EV71的3⑶作为一个前体蛋白在病毒的复制和致病中均发挥重要作用，因此嵌合 病毒株SDLY107 (1-3CD)的构建为研究3CD编码区在病毒致病机制中的作用、抗病毒药物研 究和疫苗研制均提供了研究平台。
【附图说明】
[0025] 一种肠道病毒71型3CD嵌合病毒，拉丁文学名：（Humanenterovirus713CD chimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：武汉市武昌珞 珈山武汉大学，保藏日期：2015年6月24,保藏编号：CCTCCNO.V201523。
[0026] 图1为pMD19-T-107全长质粒图；
[0027] 图2EV71全长克隆pcDNA3.I(+)-SDLY107构建模式示意图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0029] 1材料与方法
[0030] I. 1实验材料
[0031]I. I. 1细胞与病毒
[0032] 所用细胞为人横纹肌肉瘤细胞（rhabdomyosarcomacells，RD)。RD细胞生长 至对数生长期时接种病毒，待细胞病变至80%左右时，-40°C和室温之间反复冻融三次后 4°C10, OOOg离心10分钟收获，储存于_80°C冰箱中。
[0033]I. 1. 2实验试剂
[0034] 所用主要试剂为病毒RNA提取试剂盒（OMEGA,中国）、DNA胶回收试剂盒和质粒提 取试剂盒（0MEGA，中国）；逆转录试剂盒（T0Y0B0，日本）；体外转录试剂盒（Promega，美 国）；高效保真酶PrimeSTARGXLDNAPolymerase、pMD19_T(TaKaRa,中国）；限制性内切 酶、转染试剂（Thermo,美国）；细胞培养基、血清（HyClone，美国）；引物由上海生工生物工 程股份有限公司合成；测序由上海博尚生物技术公司完成。
[0035]1.2实验方法
[0036] L2. 1 扩增EV71SDLY107 与SDLYl株病毒的cDNA
[0037] 使用OMEGA公司的ViralRNAkit试剂盒提取SDLY107与SDLYl株病毒的RNA，使 用T0Y0B0 公司的ReverTraAceqPCRKit逆转录生成cDNA。
[0038] 1. 2. 2引物设计与RCR扩增
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