肠道病毒71型5’utr嵌合病毒及其拯救方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种肠道病毒71型5'UTR嵌合病毒及其拯救 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西 兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒，并于1959年首次提出HFMD命名。早期发现 的手足口病的病原体主要为CoxA16型，手足口病与EV71感染有关的报道开始于20世纪 70年代初，1972年EV71首次在美国确认。此后EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为 手足口病的主要病原体。其多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数 患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情进展较快，导致死亡。重 症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起。
[0003] 肠道病毒71型?V71)属于小RNA病毒科（Picornaradae)肠道病毒属 (Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71抗体在成人血清中的阳性率达到65% 以上，说明了这种病毒的广泛传播，每年春夏季温度升高时都会进入感染高峰期，流行趋势 从散发逐渐趋于有小型聚集性爆发。
[0004] 手足口病的相关科研工作起步较晚，发达国家拥有较好的科研平台，亚太地区为 主要流行区域，但对EV71的基础研究投入不够，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物， 对EV71进行有效的预防和控制。由于肠道病毒71型属于小RNA病毒科，所以其基因组的 人工操作较难，这给疫苗的制备增加了难度。
[0005] 因此目前对EV71的疫苗研究仍主要聚焦在传统的灭活疫苗上，而此类疫苗的免 疫效果一般较低；虽然能够诱导产生包括中和抗体在内的免疫反应，但不能诱导细胞毒T 淋巴细胞反应；诱导产生的免疫反应持续时间较短，需要多次接种；需要使用佐剂，制剂中 存在灭活剂，灭活剂对病毒抗原有影响；由于诱导的免疫反应水平较低，以及各个抗原成分 之间的疫苗应答不平衡，可能诱发疾病；一般不能通过自然途径接种，不易产生局部免疫反 应。由于以上问题的存在，亟需研发新型疫苗，既能保留完整的免疫原性，有效刺激免疫应 答，又能避免感染性。此类疫苗的研制，需要对病毒基因组中各基因编码区域的功能进行深 入研究和了解，这种深入了解还有助于筛选抗病毒药物的靶点研究。
[0006] 反向遗传学方法研究RNA病毒，是在质粒水平上来操作、研究RNA病毒，获得的拯 救病毒表型稳定，操作方便，为EV71的深入研究提供了一个很好的基础平台。但迄今还没 有合适的病毒作为疫苗研究的工具。
[0007] 现有技术中没有研究者做EV71拯救病毒的，主要是存在技术偏见EV71的反向遗 传学研究是无法实现的，此外由于EV71拯救病毒是一种新的病毒，所以在研究拯救方法时 就存在很大的不可预期性，如何克服这种不可预期性是现有技术中无法做到的。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是为了提供一种肠道病毒71型5'UTR嵌合病毒及其拯救方法和 应用。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 一种肠道病毒71型5'UTR嵌合病毒，拉丁文学名：（Humanenterovirus71 5'UTR chimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市 武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201524。
[0011] 本发明病毒的形态特征描述：
[0012] 该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24~ 30nm，核酸为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的四种结构蛋白VPl~VP4构成原聚 体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最 终形成病毒的外壳。
[0013] 一种肠道病毒71型5'UTR嵌合病毒的构建方法（模式图见图1)，步骤如下：
[0014] (1)以SDLYl(GenBank，HMl8848l. 1)全长cDNA为PCR模板，引物 5'UTR1F(序列 见表1，SEQIDNo. 1)为上游引物，引物5'UTRlR(序列见表1，SEQIDNo. 2)为下游引物 扩增SDLYl株的5'UTR;
[0015]⑵以SDLYl〇7(GenBank，JXM4186. 1)全长cDNA为PCR模板，引物VP4 1〇7F(序 列见表1，SEQIDNo. 3)为上游引物，引物VP4 107R(序列见表1，SEQIDNo. 4)为下游引 物扩增SDLY107的VP4;
[0016] (3)采用融合PCR方法，以5'UTR1F(SEQIDNo. 1)为上游引物，VP4 107R(SEQ IDNo. 4)为下游引物将两个片段连接起来；
[0017] (4)步骤（3)得到得融合片段以及pcDNA3.I(+)-SDLY107质粒（质粒pcDNA3. 1 (+) 为本研究室保存，pcDNA3.I(+)-SDLY107构建见下图）进行HindIII和BsiWI双酶切，回收 酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组病毒质粒pcDNA3. 1(+)-107 (1-5'UTR);
[0018] (5)将步骤⑷得到的pcDNA3. 1⑴-107 (1-5'UTR)进行质粒扩增、体外转录以及 RNA转染。
[0019] 所述步骤（4)中酶切的具体步骤如下：HindIII与BsiWI FastDigest enzyme各 2. 5yL，DNA10yg，IOXFastDigest Green Buffer5yL，水补齐至 50yl，37°C酶切 3-4h。
[0020] 所述步骤（5)中具体为：RD细胞转染重组RNA后，37°C二氧化碳培养箱中培养以 期病毒的拯救，通过每日观察细胞病变发现拯救病毒颗粒的出现，当CPE达到90%病变时， 冻融一次（避免多次冻融）收获上清即为第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接种细胞培 养板中（优选取500y1接种24孔细胞培养板中），放入37°C二氧化碳培养箱中继续培养， 培养3天后或出现明显的CPE时同样冻融一次（避免多次冻融），10,OOOg离心5min收获 上清，即为低二代拯救病毒；继续上述步骤接种二代病毒，约36h后出现病变，72h后病变达 到90%，冻融三次收获病毒。反复操作传代3次以上直至细胞病变稳定即为拯救成功的病 毒。
[0021] pcDNA3.I(+) -SDLY107 质粒构建过程如下：
[0022] 利用SDLY107株全基因组序列中固有的酶切位点（BsiWI，Bspl407I)，分三段扩增 EV71全长基因组。构建见图2
[0023] (1)根据SDLY107株全长cDNA作为扩增模板，以0RF107 F为上游引物（序列见 表1，SEQIDNo. 5)，以0RF107R为下游引物（序列见表1，SEQIDNo. 6)扩增EV71的大 部开放阅读框（BsiWI-Bspl407I)。将扩增片段 0RF(BsiWI-Bspl407I)与pcDNA3. 1(+)质 粒进行HindIII与XbaI双酶切。酶切片段回收后，进行T4连接获得pcDNA3.I(+)-ORF(Bs iWI-Bspl407I)。
[0024] (2)以SDLY107株全长cDNA为扩增模板，5 ^UTR107F(含有T7启动子）为 上游引物（序列见表1，SEQIDNo. 7)，VP4 107R为下游引物（序列见表1，SEQID No. 4)扩增EV71的5 '端（5 'UTR-BsiWI)。将扩增片段5 'UTR-BsiWI以及载体 pcDNA3.l(+)-0RF(BsiWI-Bspl407I)进行HindIII以及BsiWI酶切。酶切片段回收后，进行 T4 连接获得pcDNA3.I(+)-5'UTR-ORF(BsiWI-Bspl407I)。
[0025] (3)以3'UTRBspl407IF为上游引物（序列见表 1，SEQIDNo.8)，3'UTR52TR 为下游引物（序列见表1，SEQIDNo.9)扩增EV71的3'端（Bspl407I-3'UTR)。将扩增片 段Bspl407I-3'UTR以及载体pcDNA3. 1(+)-5'UTR-ORF(BsiWI-Bspl407I)进行Bspl407I 以及XbaI酶切。酶切片段回收后，进行T4连接获得全长EV71克隆pcDNA3.l(+)-SDLY107。
[0026] 表1:引物序列
[0029]上述肠道病毒71型5'UTR嵌合病毒在制备疫苗中的应用。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 非编码区的研究一直存在一个瓶颈问题，就是它无法像编码区的研究一样，可以 通过构建表达载体进而表达出相应的蛋白进行研究。反向遗传技术为非编码区的研究提供 了新的思路，我们构建的EV71的5'UTR区的嵌合毒株为研究EV71的5'UTR区在致病机制 中的作用提供了研究平台。
【附图说明】
[0032] 一种肠道病毒71型5'UTR嵌合病毒，拉丁文学名