Nok/styk1单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗体及其应用；特别涉及一种N0K/STYK1单克隆抗体及其应用， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] NOK基因是有明确功能的一个新的酪氨酸蛋白激酶（RTKs)家族成员（GeneBank 登录号：AY563053)，这与Ye等人报道的因为富含丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸残基而命名 的STYKl是同一个基因。N0K/STYK1基因全长2. 79kb，位于染色体12ql3. 2,cDNA全长为 1269bp，编码422个氨基酸的蛋白质，分子量约47. 6kD，同源性分析表明该蛋白属于受体型 酪氨酸蛋白激酶家族的一员。
[0003] 酪氨酸蛋白激酶（RTKs)受体介导着重要的信号通路，它能激活大多数的信号通 路，引起细胞的增殖、分化、迁移和代谢的改变等，在胚胎发育，代谢以及免疫系统中起着非 常重要的作用。目前研究表明，在超过一半的遗传性和散发肿瘤病例中，RTKs过量表达或 者是突变的形式与恶性肿瘤相关。
[0004]N0K/STYK1(NovelOncogenewithKinase-domain/alsoknownasSTYKl(a putativeserine/threonineandtyrosinereceptorproteinkinase))作为一个新的 受体蛋白激酶家族的成员，研究发现它能够转化NIH3T3细胞和小鼠前B细胞BaF3,并且在 裸鼠中注射表达NOK的BaF3细胞能够引起肿瘤的发生和迁移现象。在对一些细胞系的检 测中，也发现NOK在一些肿瘤细胞中高表达，如人子宫颈癌Hela细胞，人卵巢癌H08910细 胞以及人慢性髓性白细胞瘤K562细胞等。而在一些肿瘤细胞如人的表皮癌A431细胞中却 检测不到NOK的表达，提示NOK可能在某些肿瘤的发生中具有重要作用。研究发现，在乳腺 癌、肺癌、卵巢癌的恶性肿瘤标本中，NOK表达具有较高水平，说明NOK可能可以作为恶性肿 瘤早期诊断的一个标志。
[0005] 因此需要合适的单克隆抗体来研究复杂的N0K/STYK1活性，以便进一步帮助我们 理解其在肿瘤发生、发展中的作用及机理，为新的治疗策略提供设计，比如在肿瘤信号转导 中阻断N0K/STYK1信号通路，以此来控制及治疗肿瘤，或将N0K/STYK1作为新的靶标，预防 或判断疾病预后。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种N0K/STYK1单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可以特 异的识别N0K/STYK1蛋白。
[0007] -株杂交瘤细胞7G9,其保藏编号为CGMCCNo. 8163。
[0008] 由所述的杂交瘤细胞制备的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。
[0009] 上述抗体在制备检测NOK或STYKl蛋白的产品中的应用也属于本发明的保护范 围；
[0010] 所述产品具体为抗体。
[0011] 上述抗体在制备阻断NOK或STYKl信号通路的产品中的应用也属于本发明的保护 范围。
[0012] 上述抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0013] 上述应用中，所述癌为结肠癌、胃癌或乳腺癌；
[0014] 所述癌的癌细胞中高表达NOK或STYKl蛋白。
[0015] 本发明提供的单克隆抗体为深入研究N0K/STYK1蛋白在肿瘤发生、发展中的作用 及机理提供依据并奠定基础。
【附图说明】
[0016] 图1为Westernblot检测N0K/STYK1 (7G9)单抗与内源N0K/STYK1蛋白以及外源 N0K/STYK1蛋白的特异性结合。
[0017] 图2为N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在不同肿瘤细胞中的表达。
[0018] 图3为N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在乳腺癌变组织和乳腺癌旁组 织中的表达差异。
[0019] 图4为N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在结肠癌变组织和结肠癌旁组 织中的表达。
[0020] 图5为N0K/STYK1 (7G9)单抗检测内源N0K/STYK1蛋白在不同细胞系中的定位及 表达。
[0021] 图6为N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在乳腺癌变组织中的定位及表 达。
【具体实施方式】
[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 8-12周龄的雌性Balb/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0025] 骨髓瘤细胞（SP2/0)购自Abmart。
[0026]HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自JacksonImmunoResearch公司。
[0027] 人肾胚上皮细胞293T细胞购自ATCC。
[0028]MCF7购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号为TCHU74。
[0029]MDA-MB-231购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号为 TCHu104〇
[0030]SW480 购自ATCC，产品目录号为CCL-228?。
[0031]SW620 购自ATCC，产品目录号为CCL-227?。
[0032]HT-29购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号为TCHU103。
[0033]HCT116 购自ATCC，产品目录号为CCL-247?。
[0034]DLDl购自ATCC，产品目录号为CCL-221?。
[0035] 胃癌细胞803购自上海生博生物医药科技有限公司，产品目录号为pSC1038。
[0036]pcDNA3. 1-NOK/Flag质粒在文献"Ying-HuaLi,Yin-YinWang,Shan Zhong,Zhi-LiRongjYong-MingRen,Zhi-YongLi,Shu-PingZhang,Zhi-JieChang,and LiLiu.Transmembranehelixofnoveloncogenewithkinase-domain(NOK)influences itsoligomerizationandlimitstheactivationofRAS/MAPKsignaling.Molecules andCells. 27:39-45, 2009. "中公开过，公众可从清华大学获得。
[0037]pcDNA3. 1(+)购自DB。
[0038]RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司。
[0039] 实施例1、抗原的设计与合成
[0040] 一、抗原设计
[0041] 首先设计15个短肽，短肽的序列如表1所示。
[0042] 表1短肽序列
[0043]
[0045] 二、抗原的合成
[0046] 人工合成表1所不的15种短肽，并将编号为2, 3,1的短肽，编号为6,4, 5的短肽， 编号为7,8,9的短肽，编号为12,10,11的短肽，编号为14,15,13的短肽，分别按照从N端 到C端的顺序连接，并在各短肽间用GSGS作为连接做成一个融合抗原蛋白，共形成1-5号 共计5种混合肽段。
[0047] 实施例2、动物免疫
[0048]将实施例1制备的5种混合肽段作为抗原分别免疫小鼠，其中每种混合肽段免疫 一只小鼠，共计5只小鼠。具体步骤如下：
[0049] 分别将抗原（混合肽段）用PBS稀释后与等体积弗氏完全佐剂乳化混匀（注射蛋 白剂量为80iig/只），对8-12周龄的雌性Balb/C小鼠进行腹腔注射。14天后，用PBS稀释 相同的抗原并与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化混匀（注射蛋白剂量为40yg/只）后对 小鼠皮下注射。随后，每隔7天对小鼠进行腹腔注射加强免疫1次（40yg抗原与弗氏不完 全佐剂乳化混匀）。在共计第4次免疫后7d，通过眼眶采血对各小鼠采血20ul，通过ELISA 方法鉴定免疫血清效价，取免疫效价较高的2号混合肽段免疫的小鼠的脾脏用于下述的杂 交瘤细胞融合实验。
[0050] 实施例3、融合和单抗的筛选
[0051] 一、杂交瘤细胞的获得
[0052] 将免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0)进行融合,融合后的细胞 平铺于半固体培养基上进行培养，10-14天后挑取融合后的单克隆移至96孔板进行培养， 经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的 孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆，具体方法如下：
[0053] 将有限稀释的细胞在96孔板中进行培养，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克 隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值较高的单克隆再有限稀释接 入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，即认为此 为单克隆，细胞株构建成功，最终获得12株阳性单克隆杂交瘤细胞。
[0054] 将筛选得到的阳性单克隆杂交瘤细胞扩大培养，细胞数按IX106-2XIO6/管进行 冻存。同时收集细胞进行下述的腹水抗体的制备。
[0055] 二、腹水抗体的制备
[0056] 采用动物体内生产单抗的方法。每只8-12周龄的雌性Balb/C小鼠腹腔注射灭菌 液体石蜡〇. 5ml，7-14天后可以供腹腔注射步骤一得到的各单克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔 注射IXIO6个杂交瘤细胞。7-10天后观察小鼠腹水生产情况，如腹部明显膨大，即可抽取 腹水。腹水采集后离心除去油脂和沉淀，并用ProteinG柱纯化得到各腹水抗体，同时收集 ProteinG柱的流穿溶液。
[0057] 三、腹水抗体效价的测定
[0058] 采用间接ELISA法测定腹水抗体的效价，具体步骤如下：
[0059]( -）将实验用的抗原（2号混合肽段）按适当浓度溶解于包被液（50mM Na2CO3(pH9. 6))中，加入到96孔ELISA板中，4°C孵育过夜。
[0060](二）抛干液体并用300iiL清洗液（含0? 03 %Tween-20的0?IM Tris-HCl(pH7. 5))洗涤三次。
[0061](三）每个样品中加入300iiL的封闭液（用清洗液配成的含有3%的BSA，％代 表g/100ml)，室温封闭lh。
[0062](四）每个样品孔中加稀释好的步骤二的腹水抗体100yl，并进行倍比稀释，37°C孵育lh。
[0063](五）抛干液体，用清洗液洗涤三次。
[0064](六）每个样品孔中加稀释好的HRP标记的二抗（购自Abmart，货号为 M21001) 100iil，37°C孵育lh。
[0065](七）抛干液体，用清洗液洗涤三次。
[0066] (八）用300iiL洗涤液浸泡5-10min，抛干残留液体。
[0067](九）用清洗液洗涤5次后，抛干残存液体。
[0068](十）每个样品孔中加100Ul底物，显色，待最大的稀释度的孔有轻微着色之后加 入终止