反应液，用ELISA检测仪测定OD值，计算出各腹水抗体的ELISA效价，ELISA效价显 示如表2。
[0069]四、抗原表位的判断
[0070] 2 号混合肽段为YTRGAISSTQGSGSQRSGPQGIAPGSGSAAIKTADDEA(从N端到C端），采 用步骤三的ELISA方法分别包被SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5、SEQIDNo. 63条多肽对产生 的腹水抗体进行鉴定其对应的表位，发现其与AAIKTADDEA(SEQIDNo. 5)呈阳性反应，据此 判断该抗体针对的抗原表位为AAIKTADDEA(SEQIDNo. 5)。
[0071] 纯化得到的腹水抗体的抗原表位以及ELISA效价如表2所示。表2中，抗体标注 号表示获取抗体的单克隆杂交瘤细胞株的编号。抗原表位表示所制备的抗体能够识别的抗 原肽段，ELISA效价表示ELISA实验时抗体的稀释倍数。
[0072]表2腹水抗体的抗原表位的判断以及ELISA效价测定
[0073]
[0074] 五、为最终确定能够识别N0K/STYK1的特异性抗体的阳性细胞株，进一步将12个 腹水抗体进行westernblotting检测，二抗为GoatantiMouse-HRP(购自Abmart公司， 货号M21001)。
[0075] Westernblotting检测抗体的特异性结果为有3个腹水抗体能识别细胞裂解液 中的N0K/STYK1蛋白，其中7131-1-1M12/7G9_120307号杂交瘤细胞产生的抗体识别特异性 和亲和力最高。
[0076] 六、将步骤二收集的7131-1-1M12/7G9_120307号杂交瘤细胞株的腹水、ProteinG 柱纯化后的抗体（N0K/STYK1单抗）以及流穿溶液按照步骤三的间接ELISA法精确测定各 样品的效价，结果如表3所示。
[0077] 表3ELISA检测数据
[0078]
[0079]表3中，K表示1000 ;PC表示正对照（positivecontrol);NC表示负对照 (negativecontrol)〇
[0080] 表3表明，纯化后大部分抗体被保留下来并且维持了抗体活性。
[0081] 七、单抗浓度测定
[0082] 紫外分光光度法测定7131-1-1M12/7G9_120307(以下简称7G9)在280nm和260nm 处的吸光度值A280和A260。
[0083] 蛋白含量按照下列公式计算：蛋白质含量（g/L) =I. 45XA280-0. 74XA260。
[0084] N0K/STYK1单抗的浓度为3mg/mL。
[0085] 产N0K/STYK1单抗的杂交瘤细胞7G9已于2013年9月6日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo. 8163。
[0086] 下述实施例中将杂交瘤细胞7G9产生的单克隆抗体记作N0K/STYK1 (7G9)单抗。
[0087] 实施例4、N0K/STYK1单抗的检测
[0088] 一、Westernblot检测N0K/STYK1(7G9)单抗与内源N0K/STYK1蛋白以及外源NOK/ STYKl蛋白的特异性结合
[0089] 分别将插入N0K/STYK1基因的pcDNA3. 1-N0K/Flag质粒和pcDNA3. 1 (+)转染人肾 胚上皮细胞293T细胞，得到转N0K/STYK1-Flag基因和转空载体的细胞，转染后24小时，将 转N0K/STYK1基因和转空载体的细胞用RIPA细胞裂解液裂解，得到细胞裂解液，离心，得上 清。同时用RIPA细胞裂解液裂解MCF7细胞和MDA-MB-231细胞，离心，得上清。
[0090] 分别将得到的以上四种上清进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上；用TBST稀释制 备的5g/100ml脱脂奶粉室温封闭2小时，加入用上述5g/100ml脱脂奶粉按体积比I:1000 稀释的实施例1中ProteinG柱纯化得到的N0K/STYK1(7G9)单抗，4°C过夜孵育；TBST清洗 膜3次，每次5min;再加入用TBST按I:10000稀释制备的HRP标记的山羊抗小鼠IgG后， 室温孵育2小时；TBST清洗膜5次，每次5min;在暗室进行底物（SuperSignalWestPico ChemiluminescentSubstrate,购自赛默飞世尔公司，产品目录号为1856136)显色曝光，检 测结果如图1所示。
[0091] 图1中，NOK- Flag代表转N0K/STYK1基因的细胞，pcDNA3. 1代表转空载体的细 胞。
[0092] 图1表明，N0K/STYK1 (7G9)单抗可以特异的检测到内源的N0K/STYK1 (MCF7细胞 产生的N0K/STYK1)以及外转的N0K/STYK1 (转N0K/STYK1基因的细胞产生的N0K/STYK1)， 而在转pcDNA3. 1(+)的293T细胞（转空载体细胞）并未检测到目的条带，表明NOK/ STYKl(7G9)能特异性的结合N0K/STYK1，在MDA-MB-231细胞中未能检测到目的蛋白条带， 表明N0K/STYK1在该细胞中表达量相对较低。
[0093] 二、N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在不同肿瘤细胞中的表达
[0094] 取不同的结肠癌细胞系SW480、SW620、HT-29、HCT116和DLDl以及乳腺癌细胞系 MCF7和MDA-MB-231，培养后裂解，得到全蛋白并定量一致后经SDS-PAGE电泳，采用步骤一 的方法进行WesternBlot检测，同时以P-actin作为内参。
[0095]westernblotting检测结果如图2所不。
[0096] 图2表明，N0K/STYK1蛋白在结肠癌和乳腺癌细胞系中均有表达，并且与结肠癌细 胞系SW480、DLDl以及乳腺癌细胞系MDA-MB-231相比，N0K/STYK1蛋白在三种结肠癌细胞 系SW620、HT-29和HCT116以及乳腺癌细胞MCF7中表达量明显较高。
[0097] 三、N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达 差异
[0098] 取人体乳腺的乳腺癌变组织和乳腺癌旁组织细胞按照步骤一的方法，并调整不同 稀释度的N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在乳腺癌变组织和乳腺癌旁组织中的 表达差异。
[0099] westernblot检测结果如图3所不。
[0100] 图3中，Normal为乳腺癌旁组织；Cancer为乳腺癌变组织。
[0101]图 3 表明，在N0K/STYK1(7G9)单抗分别以 1:500、1:1000、1:5000 以及 1:10000 比 例进行稀释的条件下，可以检测到N0K/STYK1蛋白在乳腺癌变组织中的表达要显著高于乳 腺癌旁组织。
[0102] 四、N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在结肠癌组织中的表达
[0103] 取6个样本（患有结肠癌病人）的结肠癌变组织和结肠癌旁组织按照步骤一的方 法，用N0K/STYK1(7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在结肠癌组织中的表达。
[0104] westernblot检测结果如图4所不。
[0105] 图4中，Normal为结肠癌旁组织；Cancer为结肠癌变组织。
[0106]图4表明，与结肠癌旁组织相比，N0K/STYK1在一半的结肠癌变组织样本中表现为 高表达，在另一半结肠癌变组织样本中表达未见显著差异。根据此结果可以初步判定NOK/ STYKl高表达与结肠癌的发生存在相关性，可作为潜在的辅助诊断标志。如要进一步判断 其在结肠癌中的诊断意义需进一步在大量样本中进行检测，然后根据临床分型，确定NOK/ STYKl与结肠癌的关系，最终确定N0K/STYK1是否可以作为早期诊断的标志物的结肠癌的 类型。
[0107] 五、N0K/STYK1 (7G9)单抗检测内源N0K/STYK1蛋白在不同细胞系中的定位及表达
[0108] 免疫荧光标记检测N0K/STYK1蛋白在三种不同细胞系（结肠癌细胞HT-29、胃癌细 胞803以及乳腺癌细胞MCF7)中的定位，结果如图5所示。
[0109] 图5中，DAPI代表用DAPI染色细胞核，N0K/STYK1代表用TRITC红色荧光标记的 N0K/STYK1 蛋白。
[0110] 图5表明，N0K/STYK1蛋白在这三种肿瘤细胞系中主要定位在细胞质基质，并且有 一定的聚集颗粒形成。
[0111] 六、利用N0K/STYK1 (7G9)单抗检测N0K/STYK1蛋白在乳腺癌组织中的定位及表达
[0112] 取患乳腺癌病人的乳腺癌变组织，进行石蜡包埋并制作组织切片。对组织切片 进行免疫组化分析，具体方法参考PV-6000/PV-6001/PV-6002/PV-6004Polink-lHRPDAB DetectionSystemOne-steppolymerdetectionsystemforMouse,RabbitandRat antibodies试剂盒（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）的说明书，一抗同免疫荧光染 色用的N0K/STYK1 (7G9)，二抗为PV-6002。结果如图6所示。
[0113] 图6中，蓝色表示细胞核，黄色表示内源N0K/STYK1。
[0114] 图6表明，N0K/STYK1 (7G9)单抗能够检测到内源N0K/STYK1蛋白在乳腺癌变组织 中高表达。由此推测，N0K/STYK1蛋白和其它的酪氨酸激酶类似，对于肿瘤尤其是乳腺癌的 发生可能有一定的影响。
【主权项】
1. 一株杂交瘤细胞7G9,其保藏编号为CGMCC No. 8163。2. 由权利要求1所述的杂交瘤细胞制备的单克隆抗体。3. 权利要求2所述的抗体在制备检测NOK或STYKl蛋白的产品中的应用。4. 权利要求2所述的抗体在制备阻断NOK或STYKl信号通路的产品中的应用。5. 权利要求2所述的抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌为结肠癌、胃癌或乳腺癌。
【专利摘要】本发明公开了一种NOK/STYK1单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可以特异的识别NOK/STYK1蛋白。本发明公开的一株杂交瘤细胞7G9，其保藏编号为CGMCC？No.8163。本发明公开的单克隆抗体为深入研究NOK/STYK1蛋白在肿瘤发生、发展中的作用及机理提供依据并奠定基础。CGMCC No816320130906
【IPC分类】G01N33/573, C12N5/20, A61P35/00, A61K39/395, G01N33/577, C07K16/40
【公开号】CN105087496
【申请号】CN201410200484
【发明人】王银银, 常智杰, 孙小军
【申请人】清华大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月13日