收集和使用胎盘脐血干细胞的方法

收集和使用胎盘脐血干细胞的方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2007年05月11日和发明名称为"收集和使用胎盘脐血干细胞 的方法"的200780024901. 2号发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2006年5月11日提交的60/799734号美国临时申请的优先权。前述 临时申请的公开内容通过引用全部引入本申请。
技术领域
[0003] 本发明的主题涉及收集胎盘脐血干细胞的高效方法和使用收集的干细胞的方法。
【背景技术】
[0004] 1.本发明的领域
[0005] 本发明的主题涉及从胎盘收集干细胞，其中详细设计了一种临床上可行的、方便 和高效的新方法。特别是，本发明描述了一个新的发现，即通过机械搏动灌注收集的残留胎 盘脐血细胞与由常规的针/注射器吸取或重力引流收集方式获得的胎盘脐血细胞相比更 富含原始造血干细胞表型，因而使得脐血细胞能够用于再生的医学目的。使用所描述的方 法从单个胎盘获得的干细胞数的增加也可以改善异源造血干细胞移植的结果和避免为了 补偿来自单个供体移植物的干细胞的量不足而使用来自不同供体的两元或三元的脐带血 移植物。
[0006] 2?【背景技术】的描述
[0007] 脐血收集方法和成人的脐血移植
[0008] 脐带CB细胞对于针对造血系统恶性肿瘤和骨髓衰竭综合征进行异源HSC移 植是很有前途的HSC的来源（Kurtzberg等，1996;Wagner等，1996;Gluckman等，1997 ; Rubinstein等，1998)。其显著的优势包括快速地获取在全国范围的CB银行中储存的CB细 胞，及由于与匹配的无关供体（unrelateddonor)移植物相比很少发生严重的移植物抗宿 主病（GVHD) (Barker等，2002)，可以接受1-2个人类白血病抗原失配的移植物。CB细胞使 得病人能够在没有另外合适的匹配供体的情况下（特别是在少数族群的病人中）选择异源 移植作为造血系统恶性肿瘤的治疗方法。尽管具有以上的优势，CB在成人中的应用由于细 胞（包括CD34+细胞和祖细胞）数目的不足而受到限制。采用低水平总有核细胞计数的CB 移植导致嗜中性细胞和血小板的移植后植入（engraftment)显著延迟或植入失败（Wagner 等，2002 ;Laughlin等，2004)。已知的采集CB的过程包括通过重力从分娩的胎盘排出血液 和通过静脉穿刺将血液排到收集袋或注射器中。
[0009] 由于CB供应甚至几乎不足以进行单次的使用或者新近使用来自两个不同供体的 二元CB供应，因此成人CB移植一般仅在没有合适的无关供体的时候在临床研究的基础上 进行。实际上，仅20-40ml的回收量并不少见，而因此这些CB细胞甚至没有被使用或储存 (Lasky等，2002;George等，2006)。在这种情况下，由于没有可以在最初采集后对CB细胞 进行补充收集的标准化补充方法，大量的未收集的CB细胞仍保留在胎盘中并被丢弃了。为 了扩大将来的CB银行供体库，研究改进的CB采集方法（包括如何在常规的CB采集后收集 遗留的剩余CB细胞）是重要的（Harris等，1994)。更重要的是，从同一胎盘获得更大量的CB细胞可以储存足以用于多项用途的CB细胞量，包括备份或移植物工程（如，体外扩增和 过继性免疫治疗）。
[0010] 当前关于HSC可塑性和组织再生的认识
[0011] 在过去的十年内，在人体内鉴定出了许多类型的具有复制、自我更新和分化能力 的干细胞。全能干细胞能够形成每一种类型的体细胞，且这些细胞处在早期胚胎中，是所谓 的人ES细胞。多能干细胞能够发育成内胚层、中胚层或外胚层。组织特异性干细胞仅用于 产生特定的组织。例如，造血干细胞（HSC)负责产生所有类型的血细胞，但不负责产生其它 的组织类型，且它们在成人体内的持续存在提供了修复能力。但是，研究者发现，象被认为 负责产生不同类型的造血祖细胞的成体HSC那样的细胞甚至也产生不同组织或器官的细 胞，如神经细胞或肌肉细胞。
[0012] 关于成体HSC的转分化的探索研究仍然存在争议，且还在进行着活跃的研究工 作。相反，许多临床病例报告了在BM移植或心脏移植后非造血细胞发生的证据。寻找BM 移植后BM向脑转分化的追溯研究显示了神经生成（neuropoiesis)的证据，在长期情况中 检测到星形细胞和小胶质细胞而没有细胞融合（Cogle等，2004)。其它的报道提到了在BM 移植之后在成骨细胞、肝细胞、胃肠（GI)道上皮细胞、间质中，在外周血干细胞移植之后在 角质形成细胞/肝细胞/GI道/皮肤上皮细胞中，和在心脏移植之后在带或不带内皮细胞 的心肌细胞中，检测到大百分范围的供体细胞（Hruban等，1993 !Theise等，2000!Korbling 等，2002;Muller等，2002 ;0kamoto等，2002;Quaini等，2002)。
[0013] 作为成体干细胞来源的脐血细胞
[0014] 虽然人ES细胞可以在体外分化和扩增以产生不同类型的祖细胞，但其在病人中 的应用最近受到了多种伦理问题的阻碍。另外，必须要解决胚胎干细胞源的祖细胞的纯度 问题。与此相反，源自造血组织（包括骨髓和脐带CB细胞）的成体干细胞群被发现能够在 受到适当的刺激时分化成外胚层或内胚层（Eglitis和Mezey，1997 !Brazelton等，2000 ; Mezey等，2000 ;Sanchez_Ramos等，2001 ;Chen等，2005)。特别是，由于CB源的干细胞是从 通常被丢弃的胎盘中收集，因而不需要在采集细胞时对主体造成组织损伤，因此它们与其 它来源相比具有更进一步的优势。与BM细胞相比，CB为带有幼稚免疫状态和相对未缩短 的端粒长度的原始个体发生。
[0015] 在关于是否存在真正多能的体干细胞（somaticstemcell)的争论中，源自CB和 胎盘的细胞由于包含用于潜在临床应用的令人感兴趣的性质而日益受到关注。最近，CB已 被证明包含异质细胞群并被认为是多能干细胞源（Goodwin等，2001 ;Sanchez-Ramos等， 2001;Bicknese等，2002 ;Sanchez-Ramos，2002 ;Zigova等，2002)。其他人报道，在谱系阳性 细胞耗竭（lineagepositivecelldepletion)后从一周时间的CB细胞悬浮培养中分离 的粘附细胞群被证明表现外胚层和内胚层特征的免疫组织化学证据（McGuckin等，2004)。 现有一系列的对患有神经退行性疾病克拉勃脑白质营养不良的儿童成功地进行CB移植的 报道（Escolar等，2005)。
[0016] 本发明人推测，在CB干细胞中发现的这些独特的特征可能是由于最近公开的一 种新兴的概念，即，妊娠胎盘可能是胚胎发育过程中的造血生境（niche) (Gekas等，2005 ; Ottersbach和Dzierzak，2005)。可以简单地假设，足月的胎盘也可能包含粘附到血管生境 的残余原始干细胞，或者可能由于与"出生（birth) "相关的应激，从胎儿BM或肝脏释放的、 已经迀移到胎盘生境中的循环干细胞的数目可能增加。因此，本发明人推测，通过本发明获 得的源自胎盘的CB细胞可能包含更多的自胚胎发生以来作为残余干细胞沉积在胎盘血管 床生境中的原始干细胞（ES细胞样细胞）。
[0017] 包括ES细胞样细胞和原始HSC的原始CB细胞的分离和选择
[0018] 为使用胚胎、造血和神经干细胞的基因表达谱的比较分析鉴别共同的干细胞标志 物，仅一个基因得到确认（可能是由于技术困难MFortunel等，2003)。因此，识别和选择 干细胞可能仍需要几个标志物以将这些细胞分离开来。可以用于区别干细胞的特性之一 是不存在分化标志物。这一方法已广泛地用于HSC领域以进行干细胞的富集，从而用于治 疗。这一"谱系阴性（Lin-)"特性是许多干细胞群的共同性质（Cai等，2004b)。为进一步 从Lin-CB细胞富集干细胞群，已经有报道，⑶133+标志物在生长因子刺激下显示出高增殖 潜力（Forraz等，2004)。其他人报道，⑶133+/⑶34-细胞亚群可能代表更原始的干细胞， 因为它们不在甲基纤维素中产生集落形成细胞（CFC)，而表现出最高的SCID再植细胞频率 (Kuci等，2003)。如阶段特异性胚胎抗原（SSEA)-3、SSEA-4、TRA-l-60和TRA-1-81的胚胎 干细胞标志物仅在ES细胞上表达，ES细胞已广泛用于与FACS分析（其可从市场得到）相 容的多能干细胞和抗体的鉴定。新近Kucia等人描述了携带Lin-/⑶45-/CXCR4+/⑶133+/ ⑶34+表型的称为"极小胚胎样（VSEL)干细胞"的原始干细胞群（Kucia等，2006)。这些细 胞对于胚胎转录因子〇ct-4和Nanog也是阳性的。
[0019] 可选择地，利用一般代谢标志物的存在的方法也已用于识别和分离干细胞。已 被描述的代谢标志物中的一种是醛脱氢酶（ALDH) (Takebe等，2001)。ALDH的荧光底 物-Aldefluor(StemCell)-已被用于在神经干细胞（Cai等，2004b;Corti等，2006)和 HSC(Storms等，1999)中证明ALDH活性的增加。这种非毒性的、活体标记方法也可以用于 识别其它干细胞群（Cai等，2004a)。此外，若丹明摄取和Hoechst染料标记已被用于从BM、 CB、间充质、肌肉和成人脑选择干细胞群（Kim等，2002 ;Bhattacharya等，2003;Migishima 等，2003 ;Parmar等，2003)。由Hoechst染料33342的低摄取证明的侧群（SP)代表了最 高的自我更新能力和多能性。Hoechst染料的摄取通过膜转运体ABCG2调节，因而SP群由 ABCG2蛋白的表达限定（Zhou等，2001;Scharenberg等，2002)。ABCG2蛋白也在神经干细 胞中特异性地表达，且在前体细胞分化时表达下降（Cai等，2002)。
[0020] 人类造血细胞谱系的外胚层细胞转分化的证据
[0021] 自从BM间质源的祖细胞被首次报道在小鼠中分化成肌肉、神经胶质和肝细胞以 来，现在有越来越多的关于这些细胞分化成神经细胞的报道（Azizi等，1998 !Ferrari等， 1998 ,Petersen等，1999)。已经报道了在用视黄酸、表皮生长因子（EGF)或脑源神经营养 因子（BDNF)刺激后，在源自人和啮齿动物BM间质细胞的细胞中诱导神经元特异性蛋白质 的体外证据，如巢蛋白（nestin)、神经元特异性核蛋白（NeuN)和胶质纤维酸性蛋白（GFAP) (Sanchez-Ramos等，2000)。在非间充质造血祖细胞中，已有几个报告显示，包括分离的 CD133+细胞的人CB单核细胞在暴露于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和hEGF后被诱导 体外表达神经元和神经胶质标志物，如(6-微管蛋白III、GFAP，且在暴露于视黄酸和神经 生长因子（NGF)后还表达Musashi-1 (Sanchez-Ramos等，2001;Bicknese等，2002) 〇
[0022] 造血细胞谱系的内胚层细胞转分化的证据
[0023] 原先，在小鼠模型中肝细胞被认为是由注入的BM细胞转化的（Lagasse等，2000)， 但后来在特定的肝脏再生模型中发现它是由细胞融合引起的（Wang等，2003b)。其他人也 发现，BMHSC来源的骨髓单核细胞是肝细胞融合伴体的主要来源（Camargo等，2004)。通 过在谱系阳性细胞耗竭过程后进行一周悬浮培养分离的CB细胞形成了粘附细胞群，其被 发现在用肝细胞生长培养基进一步孵育后表达肝细胞的标志物（McGuckin等，2005)。已经 报道了在CB⑶34+⑶38-⑶7-移植后用0：14处理的免疫缺陷小鼠肝脏中肝细胞样细胞发 育的体内证据（Wang等，2003a)，且新近在使用胎绵羊的非损伤模型中，通过利用人HSC的 胎绵羊BM重建产生了人肝细胞，人HSC包括源自BM、外周血或CB的任一种的⑶34+/Lin-、 CD34-/Lin-、CD34+/Lin-/CD38-、CD34-/Lin-/CD38-、CD34+/Lin-/CD133+、CD34+/Lin-/ CD133-(Almeida_Porada等，2004)。

【发明内容】

[0024] 本发明的主题涉及从胎盘收集脐血（CB)源的干细胞的新方法。在本发明的一种 实施方式中，可以通过搏动机械胎盘灌注（PMPP)方法进行胎盘灌注。PMPP可以与常规的收 集方法组合，通常是静脉穿刺（用针和注射器抽吸脐带脉管系统）或重力引流，或者不进行 预先的收集。PMPP可以用含抗凝血剂的器官灌注溶液进行以将脐血细胞冲出，然后收集所 获得的含干细胞的灌注液。这一方法不需要在分娩后进行任何制备或将抗凝血剂注入胎盘 中来防止凝结。离体的胎盘可以在灌注之前通过例如置于冰上进行冷却。如果灌注是在胎 盘离体的一个小时之内进行，胎盘不需要在灌注之前进行冷却。如果胎盘在进行灌注之前 经过制备或注射了抗凝血剂，当前描述的方法仍可以进行。如果脐血细胞首先使用常规方 法收集，通过PMPP获得的剩余脐血细胞可以添加到该初始收集物中。PMPP获得的脐血细胞 也可以作为备份细胞储存或储存用于将来的细胞移植工程和再生性医学目的。不需要立即 将脐血干细胞从胎盘中去除产生的便利性和不需要进行任何进一步的制备而将其直接置 于冰上运送到中心实验室的能力使得这一方法对于在当前建立的脐血细胞银行系统中应 用具有潜在的吸引力。
[0025] -种实施方式包括从离体的非放血或部分放血的哺乳动物胎盘收集脐血干细胞 的方法。其它的实施方式可以包括用灌注溶液（例如，至少第一体积的灌注溶液）对哺乳动 物的胎盘进行胎盘灌注以产生包含脐血干细胞的灌注液；收集包含脐血干细胞的灌注液； 和从灌注液分离脐血干细胞以产生分离的脐血干细胞。灌注可以包括用一个或多个体积的 灌注溶液（例如，1-3个体积的灌注溶液）进行灌注。
[0026] 在某些实施方式中，灌注包括用压力介导的灌注溶液的液流灌注非放血或部分放 血的哺乳动物胎盘。在特定的实施方式中，压力介导的灌注溶液的液流包括灌注溶液的脉 动流。在某些实施方式中，压力介导的灌注溶液的液流包括一个或多个正压介导的灌注溶 液的液流或负压介导的灌注溶液的液流。
[0027] 在某些实施方式中，该方法包括例如通过搏动灌注用压力介导的灌注液的液流灌 注非放血或部分放血的哺乳动物胎盘，其中灌注是在足以产生基本上无脐血干细胞的哺乳 动物胎盘的条件下进行的。在进一步的实施方式中，胎盘灌注是使用蠕动栗进行的。
[0028] -般，该方法包括分离存在于离体胎盘的脐血中的干细胞。分离的干细胞可以包 括胚胎干细胞（ES)样干细胞、造血干细胞、间充质干细胞或其组合。其它可以通过该方法 获得的脐血细胞包括T-细胞、单核细胞、树突细胞和B细胞。
[0029] 在其它的实施方式中，该方法可以进一步包括：在灌注前，从哺乳动物供体分离哺 乳动物胎盘以获得离体的哺乳动物胎盘；和冷却离体的哺乳动物胎盘以获得冷却的哺乳动 物胎盘。
[0030] 在几种实施方式中，离体胎盘在取得后、灌注前在冰上冷却或保存。在某些实施方 式中，冷却的离体胎盘在进行灌注之前保持在从大约> 〇°C到大约6°C或者大约1°C到大约 4°C范围的温度下，只要不使胎盘冻结即可。在其它实施方式中，胎盘在进行灌注之前保持 在大约4°C到大约KTC之间的温度下4小时。在一种实施方式中，胎盘在进行灌注之前保 持在4°C。在特定的实施方式中，离体的冷却胎盘在取得后、灌注前保持最多大约40小时的 时间。
[0031] 在某些实施方式中，该方法不需要在灌注之前向胎盘中施用或注射抗凝血剂。在 一种实施方式中，胎盘在灌注之前不施用或注射抗凝血剂。
[0032] 在某些实施方式中，灌注溶液包括生理相容溶液Belzer(非人类使用HffiM