织、肌肉组织、肝脏、皮 肤、神经组织、骨组织、上皮、间质或内皮中的一种或多种。
[0099] 附图简要说明
[0100] 下面参照附图对本发明进行详细的说明，附图中：
[0101] 图1.搏动机械胎盘灌注（PMPP)与单独静脉穿刺相比能使每个胎盘的总单核细胞 计数（静脉穿刺部分加上PMPP部分）增加为1. 5倍。图形表现了通过静脉穿刺方法（实 心黑色部分）及随后的机械胎盘灌注方法（条纹图案部分）获得的8个源自胎盘的CB样 品的分析结果。各棒下方的阿拉伯数字表示表1中显示的样品号（图1)。原始数据在表3 中给出。
[0102] 图2.通过PMPP方法获得的CD34+细胞部分的百分数与静脉穿刺部分的百分数相 比具有4. 9倍的增加。
[0103] 图3.静脉穿刺部分和PMPP部分的⑶34+细胞计数分别为7. 4X106±5. 9X106(平 均值土S.D.) (8 个病人的范围：1. 1-18.2X106)和 28.8X106±37X106(平均值土S.D.) (范围：1. 6-116XIO6)，表明PMPP部分的总⑶34+细胞具有3. 9倍的增加。
[0104] 图4.静脉穿刺和PMPP部分中的⑶34+/⑶38-细胞的平均百分数分别为 0.32±0. 17% (平均值土S.D.)(范围：0.04-0.66)和 4.4±4. 1% (平均值土S.D.)(范 围：1. 3-14)，表明PMPP部分与静脉穿刺部分相比⑶34+/⑶38-细胞群百分数具有13-14倍 的增加。
[0105] 图5.静脉穿刺和PMPP部分中的⑶34+/⑶38-细胞的绝对数分别为 1.7±1.5X106(平均值土S.D.)(范围：0? 12-5.2)和 17±22X106(平均值土S.D.)(范围： 0. 86-65)(图5)，表明PMPP部分包含10倍多的⑶34+/⑶38-细胞。
[0106] 图6.静脉穿刺和PMPP部分中的⑶133+细胞百分数分别为0.55±0. 8% (平均值 ±3.0.)(范围：〇-2.5)和2.4±2.0%(平均值±3.0.)(范围：0.5-6.8)，表明在卩]\0^部 分中⑶133+细胞百分数的4倍的富集。
[0107] 图7.静脉穿刺和PMPP部分中的⑶133+细胞数分别为0. 98±0. 8XIO6 (平均值 土S.D.)(范围：0-2. 3)和 6. 3±0. 8X106(平均值土S.D.)(范围：0? 55-11. 2)。PMPP部分 中的⑶133+细胞群以6. 3倍高的水平显著富集。
[0108] 图8A和8B.静脉穿刺和PMPP部分中的⑶34+/⑶38+细胞的平均百分数和绝对 数分别为 1.34±0.6% (平均值土S.D.)(范围：0.26-2),6. 1±5. 1X106(平均值土S.D.) (范围：1.0-16.2)和 3.5±1.6% (平均值土S.D.)(范围：0.82-6)，11.9±15X106(平均 值土S.D.)(范围：0? 78-50)，表明PMPP产生⑶34+/⑶38+百分数和绝对数分别有2. 6倍和 1.95倍的增加。
[0109] 图9A和9B.静脉穿刺和搏动机械胎盘灌注部分中的⑶133+/⑶34-细胞的平均百 分数和绝对数分别为0.37±0.7% (平均值土S.D.)(范围：0-2)，0.36±0.7X106(平均值 土S.D.)(范围：0-1.9)和 1. 16±1.5% (平均值土S.D.)(范围：0-5)，2.4±3.3X106(平 均值土S.D.)(范围：0-9. 9)，表明PMPP部分具有3倍的⑶133+/⑶34-富集和6倍多的 CD133+/CD34-细胞数。
[0110] 图IOA和10B.静脉穿刺和搏动机械胎盘灌注部分中的⑶133+/⑶34+细胞的平均 百分数和绝对数分别为〇.62±0.5% (平均值土S.D.)(范围：0-0.6)，0.68±0.6X106(平 均值土S.D.)(范围：0-1. 89)和I. 26±0. 8 % (平均值土S.D.)(范围：0? 35-2. 9)， 4. 0±5. 6X106(平均值土S.D.)(范围：0? 35-16. 5)，表明PMPP部分具有 2 倍的CD133+/ ⑶34+细胞富集和⑶133+/⑶34+绝对细胞数5. 9倍的增加。
【具体实施方式】
[0111] 在下面的详细说明中，本发明的方法可以以多种不同的变型形式进行，可以理解， 在不脱离本发明的范围的情况下可以采用其它的实施方式和进行合理的变化。因此下面的 详细说明并不是限制性的，且本发明的范围由所附的权利要求限定。
[0112] 虽然下面描述了多个不连续的实施方式，但可以理解，这些仅是非限制性的实施 例，任一给定的本发明的实施方式可以包括一个给出的实施方式的某些特征和/或另一给 出的实施方式的某些特征。
[0113] 收集脐血干细胞的方法描述为可以包括用灌注溶液灌注（例如，搏动灌注）离体 的非放血或部分放血的哺乳动物胎盘以产生包含脐血干细胞的灌注液；收集包含脐血干细 胞的灌注液；和从灌注液分离脐血干细胞以产生分离的脐血干细胞，或者该方法由以上步 骤组成。
[0114] 另外，一种方法描述为其中灌注液（例如，由搏动灌注获得）加上用常规放血方法 从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致 从一个胎盘获得的总单核细胞计数1. 5倍的增加。
[0115] 进一步的方法描述为其中灌注液（例如，由搏动灌注获得）加上用常规放血方法 从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致 所获得的CD34+细胞百分数至少2倍的增加、> 2倍的增加至10倍的增加、4倍的增加至6 倍的增加或5. 5倍的增加。
[0116] -种方法描述为其中灌注液（例如，由搏动灌注获得）加上用常规放血方法从脐 带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致所获 得的总⑶34+细胞4. 9倍的增加。
[0117] 并且，一种方法描述为其中灌注液（例如，由搏动灌注获得）加上用常规放血方法 从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致 所获得的CD34+/CD38-细胞群百分数至少5倍的增加、> 5倍的增加至20倍的增加、12倍 的增加至18倍的增加或14. 8倍的增加。
[0118] -种方法描述为其中灌注液（例如，由搏动灌注获得）加上用常规放血方法从脐 带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致收集 到至少5倍多、5倍至20倍多、10倍至15倍多或11倍多的⑶34+/⑶38-细胞。
[0119] 进一步的方法描述为其中灌注液（例如，由搏动灌注获得）加上用常规放血方法 从脐带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致 所获得的⑶133+细胞百分数至少2倍、2倍至10倍、4倍至8倍或5倍的富集。
[0120] -种方法描述为其中灌注液（例如，由搏动灌注获得）加上用常规放血方法从脐 带脉管系统吸取的脐血与单独采用针和注射器从脐带脉管系统吸取的脐血相比导致获得 至少3倍、3倍至15倍、5倍至19倍或7倍的⑶133+细胞群。
[0121] I?定义
[0122] 下面的定义用于提供对说明书和权利要求的清晰和一致的理解，包括给出的这些 术语的范围。
[0123] 灌注。术语"灌注（动词）"或"灌注（名词）"指的是诱导流体流横越或通过非 放血或部分放血的胎盘的行为，优选流体以足够的力或压力通过非放血或部分放血的胎盘 从而从器官或组织移除任何残留的细胞（例如，非粘附细胞）。这里所用的术语"灌注液" 指的是在通过器官或组织后收集的流体。在优选的实施方式中，灌注液包含一种或多种抗 凝血剂。灌注溶液的液流可以包括压力介导的灌注溶液的液流。压力介导的溶液的液流可 以包括正或负压力介导的溶液的液流。压力介导的溶液的液流可以包括溶液的脉动流。
[0124] 灌注可以包括以至少第一体积的灌注溶液灌注约10分钟至约1小时、约15分钟 至约45分钟或约20分钟至约30分钟的时间
[0125] 灌注可以包括在开放或封闭的刚性或可变形容器中灌注非放血或部分放血的胎 盘。容器可以包含一定体积的灌注溶液以使得非放血或部分放血的离体胎盘在灌注过程中 浸没在容器中包含的灌注溶液中，从而所述体积的灌注溶液和容器中包含的灌注溶液在分 离脐血干细胞之前合并在一起。浸没的离体胎盘和周围的灌注溶液可以处于大气压力下或 者可以施加正和/或负压力。
[0126] 灌注可以包括使用脉动栗或蠕动栗以例如，大约15次搏动/分钟至大约90次搏 动/分钟和大约15mmHg至大约90mmHg的收缩压、或者大约60次搏动/分钟和大约30mmHg 至大约70mmHg的收缩压使非放血或部分放血的胎盘承受灌注溶液的脉动流。
[0127] 用于推动或拉动灌注溶液通过哺乳动物胎盘的压力源足以由加压系统（例如，蠕 动或脉动栗或装置）产生溶液的液流。蠕动栗送系统的使用有助于在被诱导流过胎盘的溶 液中保持无菌状态。对实际的压力水平或栗送速率进行调整以使脐血从部分放血或非放血 的胎盘的移除最优化。
[0128] 灌注溶液。术语"灌注溶液"意指包含足以维持脐血细胞（包含干细胞）的生存力 的抗凝血剂的任何生理相容的溶液或介质。合适的灌注溶液可以包括RPMI(RoswellPark MemorialInstitute)培养基，任选包含葡糖酸盐和/或肝素，例如对于1升的总体积包含 1000U的肝素；和BelzerMPS，任选包含肝素，例如对于600-750ml的总体积包含2000U的 肝素，或者合适的灌注溶液可以由上述物质组成。其它的合适的灌注溶液是本领域普通技 术人员已知的且可以很容易地选择和使用。灌注可以包括用至少第一体积的灌注溶液灌 注。灌注可以在约4°C-约27°C的温度下（例如，在室温下）进行。
[0129] 第一体积。术语"第一体积"意指用于灌注非放血或部分放血的离体哺乳动物胎 盘的灌注溶液的体积。灌注溶液的第一体积可以包括约250ml灌注溶液至约2升、约400ml 至约1. 5升、约500ml至约1. 2升、约600ml至约1升和约600ml至约750ml灌注溶液，或 者灌注溶液的第一体积可以由以上体积的灌注溶液组成。
[0130] 压力介导的液流。术语"压力介导的液流"意指由正或负压力诱导的灌注溶液的 液流。
[0131] 负压力。术语"负压力"意指低于大气压力的压力，即低于一个大气压的压力。
[0132] 正压力。术语"正压力"意指处于或高于一个大气压的压力，即大于或等于一个大 气压的压力。
[0133] 放血的胎盘。术语"放血的胎盘"意指所有循环血已被移除或抽取（即，使变得无 血）的离体胎盘。
[0134] 非放血的。术语"非放血的胎盘"意指未移除或抽取循环血的离体胎盘。
[0135] 部分放血的。术语"部分放血的胎盘"意指一部分循环血已被移除或抽取的离体 胎盘。
[0136] 干细胞。这里所用的术语"干细胞"指的是可以无限复制以形成组织和器官 的特化细胞（specializedcell)的种细胞（mastercell)。干细胞是发育上多能的 (pluripotent)或多能性（multipotent)细胞。干细胞可以分裂产生两个子干细胞，或者 一个子干细胞和一个祖（"过渡"）细胞，然后祖细胞增殖成为组织的成熟的、完全成形的细 胞。这里所用的"干细胞"，除非另外说明，包括"祖细胞"。
[0137] 造血干细胞是稀少的原始血细胞祖先，其具有自身复制能力，从而维持连续的再 生细胞源和进行分化，以产生各种形态学上可识别的血细胞系的前体。这些前体是不成熟 的血细胞，其不能自身复制且必定分化成成熟的血细胞，包括红细胞系细胞、淋巴样细胞和 髓样细胞。在骨髓微环境中，干细胞自我增殖并在一生中活跃地保持持续产生所有成熟血 细胞系。
[0138] ⑶34+细胞确定为可在骨髓、外周血或新生儿脐带血中识别的最早的造血干细胞。 本发明的补充剂和培养基特别适合于支持CD34+细胞和骨髓系细胞的扩增，包括BFU-E细 胞、红细胞、CFU-MEG细胞、巨核细胞、CFU-GM细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸 性细胞和嗜碱性细胞。在发育的较早阶段，骨髓系细胞表达CD34+标志物蛋白。在发育的 较晚阶段，骨髓系细胞不表达可检测水平的CD34+标志物蛋白。
[0139] 脐血干细胞是否表达⑶34+标志物蛋白可以由本领域普通技术人员使用公知的 技术（如荧光活化细胞分选）进行确定。
[0140] "⑶34+造血细胞"或"⑶34+细胞"是表达⑶34+表面标志物蛋白的造血细胞。这 些细胞包括，但不限于造血干细胞、骨髓祖细胞或前体细胞、红系祖细胞或前体细胞和淋巴 样祖细胞或前体细胞。
[0141]CD34+细胞可以使用本领域普通技术人员公知的方法从收集的脐血和/或灌 注液中分离以产生分离的脐血干细胞。本领域普通技术人员可以获得各种系统。例如， MicroCELLectorSystem?(AppliedImmuneSciences)、MiniMacsSystem(Miltenvi Biotec)、StemSep?system(StemCellTechnologies)可以用于分离CD34+。为大规模制 备富含⑶34+细胞的细胞制剂，本领域普通技术人员可以获得由BaxterHealthcare和 CellPro在市场上销售的系统。
[0142] 术语"造血干细胞"和"多能造血干细胞"指的是可以产生任何类型的造血祖细 胞或前体细胞（包括骨髓祖细胞或前体细胞、红系祖细胞或前体细胞和淋巴样祖细胞或前 体细胞）的细胞。造血干细胞显示⑶34+/⑶33-/⑶38-表型或⑶34+/HLD-DR-/⑶38-表 型（Daley，J.P?等，Focus18 : 62-67(1996) ;Pimentel，E.编辑，HandbookofGrowth FactorsV01.Ill：HematopoieticGrowthFactorsandCytokines，pp.1-2，CRCPress， BocaRaton，Fla.，1994)〇
[0143] I.进行或不进行在先常规CB采集的收集胎盘CB细胞的方法
[0144] 采用广泛用于肾维持的WatersRM3搏动灌注装置（WatersMedicalSystems， Rochester，MN)利用搏动灌注技术进行CB采集的方法的概念验证小型试验获得了成功。 所述装置最初设计用于提高在移植之前进行储存的肾的即时功能（immediatefunction)。 灌注溶液由具有葡糖酸盐和对于1升的总体积具有1000U肝素的RPMI(RoswellPark MemorialInstitute)培养基或者BelzerMPS加上 1000-2000U肝素（具有 2000U肝素钠 的600-750mlBelzerMPS)组成。目前，已利用狒狒胎盘证明了该方法的可行性及成功地 灌注和移除全部的残留胎盘CB。当常规静脉穿刺加上机械灌注时，与单独的静脉穿刺方法 相比，收集的绝对总单核细胞计数、集落形成细胞（CFC)计数、CD34+和CD34+/CD38-百分 数及计数为大约2倍高。
[0145] 在通过搏动机械灌注进行的有利的狒狒CB收集的基础上，该方法在人类胎盘上 进行测试。按照马里兰大学伦理审查委员会（InstitutionalReviewBoard)批准的临床方 案，对来自7个正常阴道分娩和一个剖腹产的36-41周胎盘进行8例CB收集。首先在脐带被 夹住和婴儿生出而胎盘仍在子宫中时，就利用针/注射器通过静脉穿刺进行部分CB收集以 吸取最大可能的量。这一方法用于经阴道生产和剖腹产两种情况以使CB收集的收率最大 化，且它是广泛用于常规CB收集的几种方法中的一种。将18号针头装到30或60ml的注射