器上且吸取的CB材料立即转移到包含5000U肝素溶液的50ml锥形管中。收集的CB立即与 肝素混合以防止凝结，并储存在冰柜中。通过这一过程收集的平均CB体积为59± 18ml(平 均值土S.D.)(范围：40-90ml)。接着，胎盘例行地娩出并直接置于无菌隔离袋（3MHealth CareSt.Paul，MN)中。如果胎盘需要表观检验，则将胎盘置于无菌托盘上并在完成检查时 转移到无菌隔离袋中。胎盘也在无菌袋中称重。无菌袋紧密封闭并置于三重袋隔离（triple bagisolation)中，并且不进行任何操作而保持在冰柜中直到开始胎盘灌注。胎盘在分娩 后6. 25-39小时之间进行灌注。胎盘可以在离体后在约-3°C至约15°C、约-8°C至约KTC、 约-2°C至约6°C或约0°C至约6°C的温度下冷却，只要不使得胎盘被冻结即可。冷却的胎盘 可以在灌注之前在发生冻结之上的温度下（例如，从约> 〇°C至约15°C、约> 0°C至约KTC 或约2°C至约6°C)维持约30分钟至约60小时、约1小时至约50小时、约6小时至约40 小时、约10小时至约40小时、约15小时至约40小时或约20小时至约40小时的时间。
[0146] 为进行搏动机械胎盘灌注（PMPP)，将胎盘置于无菌场上并进行检查以确定胎盘中 是否存在任何破口或裂缝。然后，检查脐带以寻找2条脐动脉和1条脐静脉。两条脐动脉 中的一条或多条和脐静脉被插管以利于灌注。首先，将6mm的直管插入脐静脉中并用〇-形 丝带绑扎定位，然后，两条动脉各插入2mm直管并用〇-形丝带绑扎定位。将胎盘置于灌注 回路（WatersRM3肾灌注栗）上，其在1°C至27°C的温度下用BelzerMPS加上1000-2000U 肝素（具有2000U肝素钠的600-750mlBelzerMPS)进行起动前灌注。BelzerMPS是FDA 批准的用于维持死者捐献的移植器官的器官灌注液（Gage等，1997)。搏动机械灌注以60 次搏动/分钟进行且收缩压在30-70mmHg之间。完成灌注的平均时间为26分钟（范围： 20-30分钟）。为确定胎盘灌注的完成，我们将胎盘组织颜色从暗蓝色变成纯白色作为胎盘 中的血管内容物全部排空的标志。
[0147] 八个CB样品使用静脉穿刺和机械胎盘灌注方法从相同的对象进行收集，且其定 量描述总结于表1中。通过静脉穿刺收集的平均CB体积如上所述。由搏动机械胎盘灌注 方法获得的平均CB体积不能进行测量，因为灌注液和CB最后混在一起。采集的胎盘的平 均孕期为38. 6周（范围：36-41周）且平均胎盘直径和厚度大小为20XIcm(17-22Xlcm)。 胎盘从一例剖腹产（样品1)和7例阴道分娩（样品2-8)获得。从胎盘分娩到开始灌注的 平均时间为17小时（平均值）（6. 25-39小时），且胎盘灌注的持续时间小于每胎盘30分 钟（平均26分钟，范围：20-30分钟）（表1)。在3个胎盘（样品3、5和6)中发现存在血 栓形成，且其占总胎盘面积的大约5%、10%和7%，而在其它对象中未见到血栓形成。这些 胎盘在4°C温度的热绝缘柜中包裹于冰中19-39小时直到灌注开始。总的说来，对于每一个 测试的胎盘（包括具有血栓形成的胎盘）进行机械灌注都没有困难，且没有观察到由于搏 动机械灌注导致的气压性损伤。
[0148] 表1.从8个胎盘收集的脐血的特征
[0149]
[0150] 2.由PMPP收集溶液与常规脐血采集方法的比较分析
[0151] CB单核细胞分离
[0152] 由胎盘脉管系统的静脉穿刺获得的CB细胞首先用Iscove改良Dulbecco 培养基（MDM)进行1 : 5的稀释，且单核细胞通过以前描述（Takebe等，2002)的 Ficoll-Hypaque(SigmaDiagnostic，StLouis，MO)密度梯度离心进行分离。包含单核细 胞的层被轻轻地吸出，细胞用PBS溶液清洗两次并通过血细胞计数器计数。细胞存活率通 过台盼蓝排除法确定。通过PMPP获得的CB细胞与由静脉穿刺获得的细胞类似地进行处 理。但是，这些细胞混在大量的灌注液中^50-800ml总体积）。这一灌注液等分到大约几 打（severaldozen) 50ml锥形管中，该锥形管一起以1800rpm离心20分钟以获得血沉棕黄 层。然后，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心从细胞中进一步分离单核细胞。CB细胞如上所 述进行清洗和计数。
[0153] 流式细胞仪分析
[0154]单核细胞用包括抗人 CD38-FITC、CD34-APC(BDPharmingen，SanJose，CA)、 AC133-PE(MiltenyiBiotech，Auburn，CA)的单克隆抗体染色并按照制造商的说明用 Facstar-plus(BectonDickinson)进行分析。对于各样品采用合适的抗体平行地进行同型 对照。
[0155] CD34+细胞选择
[0156] 由Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得的等分CB单核细胞按照制造商的说明用 ⑶34祖细胞分离试剂盒（MiltenyiBiotec)通过磁性细胞分离方法进一步分离以富集 CD34+细胞群。纯化细胞数和存活率通过血细胞计数器和台盼蓝排除试验确定。CD34+细 胞的富集通过流式细胞分析确定，且各批次的分离显示了高于90%的CD34+细胞纯度和通 过台盼蓝排除法确定的高于95%的存活率。
[0157]甲基纤维素集落形成单位分析
[0158] 纯化的CBCD34+细胞（3XIO3每板）如以前描述的方法（Takebe等，2002)接种 到35-_培养皿中。细胞按照制造商的说明在包括Imln?M、l%甲基纤维素、BSA、2-巯基 乙醇、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、SCF、GM-CSF、IL-3、IL-6、G-CSF和红细胞生成素的 商购培养基MethoCult(StemCellTechnology，Vancouver，Canada)中进行培养。在第 14 天，集落（大于50个细胞）由重复的培养皿进行计数。
[0159] 表2.由静脉穿刺方法和机械胎盘灌注方法获得的包含配对样品的3个CB样品的 集落形成单位的总结
[0160]
[0161 ]CFU-GM:集落形成单位-粒细胞巨噬细胞
[0162]CFU-GEMM:集落形成单位-粒细胞，红细胞，单核细胞
[0163]BFU-E:爆发集落形成单位-红系
[0164]a和b:配对T-检验显示在静脉穿刺和机械胎盘灌注之间有统计学显著差异（p < 0. 05)
[0165] *VP:静脉穿刺方法
[0166] **PL:PMPP方法
[0167]
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