：（Humanenterovirus71 5'UTR chimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：武汉市武昌珞 珈山武汉大学，保藏日期：2015年6月24,保藏编号：CCTCCNO.V201524。
[0033] 图1重组病毒构建模式图；
[0034] 图2EV71全长克隆pcDNA3.I(+)-SDLY107构建模式示意图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0036] 1材料与方法
[0037] I. 1实验材料
[0038]I.I. 1细胞与病毒
[0039] 所用细胞为人横纹肌肉瘤细胞（rhabdomyosarcomacells，RD)。RD细胞生长 至对数生长期时接种病毒，待细胞病变至80%左右时，-40°C和室温之间反复冻融三次后 4°C10,OOOg离心10分钟收获，储存于_80°C冰箱中。
[0040]I. 1. 2实验试剂
[0041] 所用主要试剂为病毒RNA提取试剂盒（OMEGA,中国）、DNA胶回收试剂盒和质粒提 取试剂盒（0MEGA，中国）；逆转录试剂盒（T0Y0B0，日本）；体外转录试剂盒（Promega，美 国）；高效保真酶PrimeSTARGXLDNAPolymerase、pMD19_T(TaKaRa,中国）；限制性内切 酶、转染试剂（Thermo,美国）；细胞培养基、血清（HyClone，美国）；引物由上海生工生物工 程股份有限公司合成；测序由上海博尚生物技术公司完成。
[0042] 1. 2实验方法
[0043]L2. 1 扩增EV71SDLY107 与SDLYl株病毒的cDNA
[0044] 使用OMEGA公司的ViralRNAkit试剂盒提取SDLY107与SDLYl株病毒的RNA，使 用T0Y0B0 公司的ReverTraAceqPCRKit逆转录生成cDNA。
[0045] L 2. 2引物设计与RCR扩增
[0046] 病毒株SDLY107和SDLYl为本课题组分离自山东的手足口病患儿，SDLY107为死 亡患儿分离株，经鉴定为强毒株（细胞病变快而强，动物病理特征明显），SDLYl分离自轻症 患儿，经鉴定为弱毒株，毒株均已经进行全序列分析。
[0047]PCR扩增VP4 (107)-5'UTR(I)
[0048]引物见表1。使用引物5'UTR1F，（SEQIDNo. 1)、5'UTR1R(SEQIDNo. 2)，以SDLYl 株cDNA为模板，扩增 5'UTR非编码区；使用引物VP4107F(SEQIDNo. 3)、VP4107R(SEQID No. 4)，以SDLY107株cDNA为模板，扩增107病毒的VP4编码区；使用引物5'UTR1F(SEQID No.I)、VP4107R(SEQIDNo. 4)，以扩增获得的SDLYl株 5'UTR与SDLY107 株VP4 为模板进 行重叠PCR，获得重组PCR产物5'UTR(I)-VP4 (107)。
[0049]I. 2. 3pcDNA3. 1 (+)-107(1_5'UTR)的构建
[0050]将pcDNA3.I(+) -SDLY107 质粒以及上述融合片段 5'UTR(I) -VP4 (107)进行 HindIII和BsiWI双酶切：HindIII与BsiWIFastDigestenzyme各 2. 5y1，DNAlOyg， IOXFastDigestGreenBuffer5yl，水补齐至50yl，37°C酶切4h。酶切片段回收后，进 行T4连接获得重组病毒质粒pcDNA3. 1 (+) -107 (1-5,UTR)。
[0051] 1. 2. 4重组107(1-5'UTR)全长的获得及体外转录
[0052] 使用XbaI和HindIII对pcDNA3. 1(+)-107 (1-5,UTR)进行双酶切，使其线性化，并 回收 107 (1-5'UTR)。使用Promega公司生产的RiboMAXIIILargeScaleRNAProduction Systems-T7试剂盒进行体外转录，并使用OMEGA公司的RNA提取试剂盒对RNA进行提取。
[0053] 1. 2. 5转染与拯救病毒
[0054]按照转染试剂ThermoScientificTurboFect使用方法，将IUg的 107 (1-5'UTR) 全长RNA转染入刚铺满单层的RD细胞，约72h小时后收获细胞，置-40°C和室温冻融一次后 (避免反复冻融），接种至刚铺满单层的RD细胞，每孔200y1。再次培养72h后收获细胞并 冻融一次，接种至刚铺满单层的RD细胞。全程观察细胞病变情况，并设置阴性及SDLY107、 SDLYl株作为对照。
[0055] 1. 2. 6重组病毒的鉴定
[0056] 提取拯救病毒SDLY107 (1-5'UTR)的RNA，逆转录生成cDNA，PCR扩增5'UTR非编 码区后回收，送上海博尚生物技术公司测序进行鉴定。
[0057] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种肠道病毒 71 型 5' UTR 嵌合病毒，Human enterovirus 71 5' UTR chimeric virus，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏 日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC NO. V201524。2. 如权利要求1所述的肠道病毒71型5'UTR嵌合病毒的拯救方法，其特征是，步骤如 下： (1) 以SDLYl全长cDNA为模板，5'UTRlF为上游引物，5'UTRlR为下游引物扩增SDLYl 株的5' UTR ; (2) 以SDLY107全长cDNA为模板，VP4107F为上游引物，VP4107R为下游引物扩增 SDLY107 的 VP4 ; (3) 以5' UTRlF为上游引物，VP4107R为下游引物将步骤（1)和步骤（2)得到的两个 片段连接起来； (4) 将步骤（3)得到的融合片段以及pcDNA3. I (+) -SDLY107质粒进行HindIII 和BsiWI双酶切，回收酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组病毒质粒 pcDNA3. 1(+)-107 (1-5, UTR); (5) 将步骤⑷得到的pcDNA3. 1⑴-107 (1-5' UTR)进行质粒扩增、体外转录以及RNA 转染，传代培养至细胞病变稳定即为拯救成功的病毒。3. 如权利要求2所述的的拯救方法，其特征是，所述步骤（4)中酶切的具体步骤如下： HindIII 与BsiWI FastDigest enzyme各2.5 y L，DNAlO y g，10XFastDigest Green Buffer 5 1^，水补齐至50^1，37°(：酶切3-411。4. 如权利要求2所述的的拯救方法，其特征是，所述步骤（5)中传代培养具体为：RD细 胞转染重组RNA后，37°C二氧化碳培养箱中培养以期病毒的拯救，当CPE达到90%病变时， 冻融一次收获上清即为第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接种细胞培养板中（优选取 500 y 1接种24孔细胞培养板中），放入37°C二氧化碳培养箱中继续培养，培养至出现明显 的CPE时冻融一次，10, OOOg离心5min收获上清，即为低二代拯救病毒；继续上述步骤接种 二代病毒，冻融三次收获病毒，反复操作传代3次以上直至细胞病变稳定即为拯救成功的 病毒。5. 如权利要求1所述的肠道病毒71型5' UTR嵌合病毒在制备疫苗中的应用。6. 如权利要求1所述的肠道病毒71型3CD嵌合病毒在制备抗病毒药物中的应用。
【专利摘要】一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，拉丁文学名：(Human？enterovirus？71？5’UTR？chimeric？virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC？NO.V201524。非编码区的研究一直存在一个瓶颈问题，就是它无法像编码区的研究一样，可以通过构建表达载体进而表达出相应的蛋白进行研究。反向遗传技术为非编码区的研究提供了新的思路，我们构建的EV71的5’UTR区的嵌合毒株为研究EV71的5’UTR区在致病机制中的作用提供了研究平台。CCTCC NO. V20152420150624
【IPC分类】A61K39/125, C12R1/93, C12N7/01, A61P31/14, C12N15/85
【公开号】CN105087504
【申请号】CN201510439325
【发明人】温红玲, 郝树彬, 孙乐乐, 李静, 乔乔, 马英伟, 庄志超, 王志玉
【申请人】山东大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月23日