专利名称：一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法
技术领域：
本发明属于复合型微生物絮凝剂的制备领域，特别涉及一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法。
背景技术：
絮凝剂广泛应用与于污水处理、食品生产及生物发酵等工业领域，但目前广泛使用的无机和有机高分子絮凝剂的残留物通常会引起环境污染问题，甚至对人类具有致癌、 致畸等毒性作用，已被许多国家禁止或限量使用，因而需要开发高效、安全无毒、不污染环境的新型絮凝剂。生物絮凝剂主要是由微生物在特定培养条件下所分泌产生的具有絮凝活性的高分子生物聚合物，具有安全无毒、对环境友好等优点。目前，美国、英国、日本等国家对生物絮凝剂进行了研究，筛选出多种絮凝剂产生菌，并在絮凝条件、机理、产絮凝剂的基因控制、 絮凝剂的纯化、性质及应用方面进行了系列工作。微生物絮凝剂对不同的悬浮物有不同的絮凝作用，目前微生物絮凝剂用于对水体富营养化的研究较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法该方法简便快捷，成本低，沙雷细菌(Serratia)和芽孢杆菌(Bacillus)对一般的抗生素均无抗性，易于灭活，保证了使用的生态安全性；制得的絮凝剂用量少，稳定性强，易于保存，可以有效的絮凝蓝藻水样，絮凝率可达92%，具有良好的应用前景。本发明的一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法，包括将沙雷细菌Serratia和芽孢杆菌Bacillus (市售)分别接入灭菌的营养肉汤培养基中进行培养，24小时后分别取ImL沙雷细菌和芽孢杆菌的菌液接入灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，培养72h后将该发酵液作为种子液，在培养温度为35°C、摇床转速为 160rpm、培养基初始pH为8.0、种子液接种量为10ml/L的条件下进行复合培养72h后，将发酵液进行离心分离，取上清液即得复合型微生物絮凝剂。所述营养肉汤培养基的组成为蛋白胨10g，牛肉浸出粉4. Og，NaCl 5.0g，酵母浸出粉3. Og,蒸馏水IL ；pH为7. 0 7. 2。所述营养肉汤培养基于115°C灭菌30min。所述发酵培养基的组成为葡萄糖20g，K2HPO4 5g, KH2PO4 3g, NaCl 0. 3g，尿素 0. 3g，酵母膏 0. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，蒸馏水 IL ；pH 为 7. 5 8. 5。所述发酵培养基中葡萄糖于115°C灭菌30min，其它成分于121°C灭菌20min。沙雷细菌Serratia，菌落白色，圆形，凸面，菌落边缘整齐，周生鞭毛，运动，细胞为杆状，革兰氏反应呈阴性。芽孢杆菌Bacillus菌落黄色，圆形，凸面，菌落边缘整齐。革兰氏染色后用电子显微镜以及扫描电镜观察发现，菌株为杆状，革兰氏反应呈阳性，侧生鞭毛。
有益效果(1)本发明简便快捷，成本低，沙雷细菌(Serratia)和芽孢杆菌(Bacillus)对一般的抗生素均无抗性，易于灭活，保证了使用的生态安全性；(2)制得的絮凝剂产量高，用量少，稳定性强，易于保存，能有效的利用于实际水样，可以有效的絮凝蓝藻水样，絮凝率可达92%，具有良好的应用前景。
图1(1)为沙雷细菌(Serratia)的扫描电镜，(2)为芽孢杆菌(Bacillus)的扫描电镜；图2为沙雷细菌(Serratia)和芽孢杆菌(Bacillus)在不同时间下的生长曲线；图3 (1)为不同培养温度对复合型微生物絮凝剂絮凝性的影响；(2)为不同摇床转速对复合型微生物絮凝剂絮凝性的影响；(3)为不同培养基初始PH对复合型微生物絮凝剂絮凝性的影响；(4)为不同菌液用量对复合型微生物絮凝剂絮凝性的影响；(5)为不同接种量对复合型微生物絮凝剂絮凝性的影响；(6)为不同1 % CaCl2溶液的投加量对复合型微生物絮凝剂絮凝性的影响；(7)为不同pH对复合型微生物絮凝剂絮凝性的影响；图4为复合型微生物絮凝剂在不同作用时间下对蓝藻水样的絮凝效果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1絮凝性测定方法向150mL烧杯中加入0. 4g高岭土，加水80ml蒸馏水，调节pH 为4. 5，加入4mL的质量分数为1 % CaCl2溶液和1. 5mL复合菌群发酵液，然后加蒸馏水至 100mL。常温下用恒温磁力搅拌器在200r/min的条件下搅拌2min，常温下静置5min。吸取 50mL处的上清液，用紫外可见分光光度计(752型)在550nm的波长下测定光密度值ODi， 同时以2mL未接种的新鲜发酵培养基代替复合菌群发酵液，其它操作条件完全相同的实验作为对照，测得光密度值0队。絮凝率计算公式为
絮凝率％ =⑴队-⑶丨)o/o OD0高效絮凝菌的筛选与鉴定(1)菌株从活性污泥中筛选，将分离获得的各菌株分别接入装有发酵培养基 (50mL)的锥形瓶(250mL)中，置于摇床中于30°C、150r/min培养64h，取上清液进行絮凝活性测试，接种菌落在超净工作台中进行；
(2)微生物絮凝 剂产生菌的初筛在IOOmL小烧杯中加入0. 2g高岭土，40ml蒸馏水、2mll% CaClyK溶液、2ml菌体发酵上清液，然后加水至50mL，均摇后静止15min，同时以不加菌的培养基的高岭土悬浊液为对照或以高岭土悬浊液为对照，用分光光度计在550nm 处测上清液的吸光度；(3)微生物絮凝剂产生菌的复筛复筛要比初筛精确，具体过程如下将絮凝活性较好的菌株接种到盛有50mL培养基的250mL锥形瓶中，150r/min，30°C培养64h后测絮凝活性。最佳培养条件的摸索(1)在6个250ml锥形瓶中分别加入50ml发酵培养基，调节pH为7. 0，分别加入 ImL沙雷细菌Serratia和芽孢杆菌Bacillus的种子液。分别在20°C、25°C、30°C、35°C、 40°C，摇床转速均为150rpm的立式双层摇床中进行复合培养，得复合菌群XLl。72h后，分别取2ml发酵液上清液，测定其絮凝率；(2)分别取摇床转速为 l20rpm、140rpm、l60rpm、l80rpm、200rpm、22Orpm,在 35°C 下恒温培养72h，分别测定絮凝率；(3)调节培养基初始 pH 分别为 5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5,9. 0，接入复
合菌群XLl，在35°C、160rpm下培养72h，测产生絮凝剂的絮凝率；(4)将培养基初始pH调为8. 0，接入复合菌群XLl在35°C、160rpm下培养72h。分别在IOOml高岭土悬浮液中加入0. 5mL、l. OmLU. 5mL、2. OmL,2. 5mL复合菌群XLl发酵液的
上清液，测定各自絮凝率；(5)将培养基初始pH调为8. 0，分别在5个装有50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中加入0. 5mL、l. OmLU. 5mL、2. OmL,2. 5mL复合菌群XLl的种子液，在35°C、160rpm下培养 72h后，各自取1. 5mL发酵液上清液，测定其絮凝率；(6)将复合菌群XLl在培养基初始pH为8. O、培养温度为35°C、摇床转速为 160rpm、接种量为Iml的条件下进行发酵培养72h后，分别取1. 5mL上清液，分别加入OmL、 lmL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mLl% CaCl2溶液的IOOml高岭土悬浮液中，测各自的絮凝率；(7)将复合菌群XLl按以上试验所取得的最佳条件下进行发酵培养72h后，取 1.5ml 上清液和 4mll% CaCl2 溶液分别加入 pH 为 3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. O 的高岭土标准悬浮液中，并测定各自絮凝率；(8)把复合菌群XLl按照以上试验的最佳培养条件进行培养后，取1.5mL上清液加入pH为4. 5、加入4. Oml 1% CaCl2溶液的高岭土悬浮液中，用恒温磁力搅拌器以200rpm搅拌2min，然后分别取静置时间为3min、6min、9min、12min、15min、18min、21min为检测时间点，测定此时的吸光度。并以加入新鲜培养基的高岭土悬浮液的吸光度作对比，确定各个时间点的絮凝率。最优方案确定为将沙雷细菌Serratia和芽孢杆菌Bacillus分别接入灭菌的营养肉汤培养基中进行培养，24小时后分别取ImL沙雷细菌和芽孢杆菌的菌液接入灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，培养72h后将该发酵液作为种子液，在培养温度为35°C、摇床转速为160rpm、培养基初始PH为8. O、种子液接种量为10ml/L的条件下进行复合培养72h后，将发酵液进行离心分离，取上清液即得复合型微生物絮凝剂。
富集培养基为葡萄糖10g，K2HPO4 5. Og,尿素0. 5g，酵母膏0. 5g，水1. 0L, pH7. 0 7. 2。其发酵培养基为葡萄糖20g，K2HPO4 5g，KH2PO4 3g，NaCl 0. 3g，尿素0. 3g，酵母膏0. 6g， MgSO4 · 7H20 0. 5g,蒸馏水 1. 0L, pH7. 5 8. 5。固体培养基为蛋白胨10g，牛肉膏5. 0g，NaCl 5. 0g，琼脂18g，水1. 0L，pH7. 0 7. 2。实际应用测试 取44. 5ml对数生长期的蓝藻水样于IOOmL烧杯中，加入2mL的质量分数为1 % CaCl2溶液和0. 75mL复合菌群发酵液的上清液，常温下用恒温磁力搅拌器在200r/min的条件下搅拌2min，然后把蓝藻水样放入蓝藻光照培养箱中进行光照培养，24h后测定该絮凝剂对蓝藻水样的絮凝率。用血细胞计数法来计算絮凝率。絮凝率计算公式为絮凝率/(%)=[(对照样中藻液的细胞密度-上清液的细胞密度)/对照样中藻液的细胞密度]X100经测定复合菌群XLl所产絮凝剂对对数生长期的蓝藻水样的絮凝率可达到92%。结果表明，应用该复合菌群培养的复合型微生物絮凝剂絮凝蓝藻水体，控制蓝藻水华，缓解水体的富营养化是可行的。
权利要求
1.一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法，包括将沙雷细菌(Serratia)和芽孢杆菌(Bacillus)分别接入灭菌的营养肉汤培养基中进行培养，24小时后分别取ImL沙雷细菌和芽孢杆菌的菌液接入灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，培养72h后将该发酵液作为种子液，在培养温度为35°C、摇床转速为160rpm、培养基初始PH为8. 0、种子液接种量为10ml/L的条件下进行复合培养72h后，将发酵液进行离心分离，取上清液即得复合型微生物絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于所述营养肉汤培养基的组成为蛋白胨10g，牛肉浸出粉4. 0g, NaCl 5. 0g，酵母浸出粉3. Og,蒸馏水IL ；pH为7. 0 7. 2。
3.根据权利要求2所述的一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于所述营养肉汤培养基于115°C灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为葡萄糖20g，K2HPO4 5g, KH2PO4 3g,NaCl 0.38，尿素0.38， 酵母膏 0. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，蒸馏水 IL ；pH 为 7. 5 8. 5。
5.根据权利要求4所述的一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养基中葡萄糖于115°C灭菌30min，其它成分于121°C灭菌20min。
全文摘要
本发明涉及一种用于蓝藻水华的复合型微生物絮凝剂的制备方法，包括将沙雷细菌Serratia和芽孢杆菌Bacillus分别接入灭菌的营养肉汤培养基中进行培养，24小时后分别取1mL和的菌液接入灭菌的发酵培养基中进行发酵培养，培养72h后将该发酵液作为种子液，在培养温度为35℃、摇床转速为160rpm、培养基初始pH为8.0、种子液接种量为10ml/L的条件下进行复合培养72h后，将发酵液进行离心分离，取上清液即得复合型微生物絮凝剂。本发明简便快捷，成本低；制得的絮凝剂用量少，稳定性强，易于保存，可以有效的絮凝蓝藻水样，絮凝率可达92％，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/425GK102220404SQ20111007906
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月30日 优先权日2011年3月30日
发明者夏莉莉, 赵晓祥 申请人:东华大学