专利名称：一种核酸的检测方法和一种试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种核酸的检测方法，ー种采用该方法进行核酸检测的试剂盒，及所述检测方法和所述试剂盒在检验检疫中的应用。
背景技术：
分子诊断是现代生物分析的前沿技术，检测特定核酸序列是生物分析的重要内容。常规的分子鉴定有多种技术方法，如荧光定量PCR(Qi Y. Appl Environ Microbiol,2001,67(8) :3720-3727)、RFLP (限制性酶切片段长度多态性，S. R. Klee. J. AppliedMicrobiology. 2006，100，1364-5072)、基因芯片、测序等。但这些方法操作复杂，一般需借助大型昂贵的仪器设备，耗时较长，难以普及推广。对于需要快速鉴定诊断的某 些致病性微生物(生物武器)，如炭疽杆菌，尤其难以满足需要。因此，发展ー种快速便捷、廉价高效、不需要复杂设备，为医护现场提供诊断的分析手段具有非常重大的现实意义。金纳米颗粒(AuNP)是直径为I-IOOnm的胶体，其以良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、量子效应、光学效应以及独特的生物亲和性，广泛用于光学、电学、成像的生物分子标记(HorisbergerM. Scanning Electron M icroscopy 11,1981:9-31)。金纳米颗粒具有很高的消光系数，颗粒直径为13nm的金纳米颗粒在520nm波长左右有尖锐的吸收峰，其自组装聚集导致吸收峰明显改变，这种表面等离子共振效应(SPR, Surface PlasmonResonance)可显示颜色的变化。同时，金纳米颗粒具有广泛的生物亲和性，DNA分子可以偶联到金纳米颗粒上，參与其自组装过程，最終影响金纳米颗粒溶液(或称胶体金溶液)的物理特性，如颜色、吸光度等。Mirkin发现通过DNA特异性杂交可使AuNP-DNA颗粒自组装团聚，进而出现胶体溶液颜色的变化，从而开创了 AuNP用于生物检测的先河(Mirkin CA. Nature, 1996,382(6592) =607-609)。AuNP与巯基修饰的短链DNA偶联成为检测探针，当溶液中存在长短一致的目标互补DNA时，金納米颗粒发生有序、可逆的团聚反应，形成ニ维、三维的网状团聚结构,颜色可从宝石红色变成紫蓝色(Elghanian R. Science, 1997,277(22) :1078-1081)。这种聚集后溶液颜色从宝石红到紫蓝色的肉眼可观察的颜色变化为生物分析检测提供了ー种快速、简便的方法，AuNP在生物检测中显示诱人的应用前景。ssDNA (单链DNA)和dsDNA (双链DNA)对AuNP具有不同的吸附能力，ssDNA可吸附至带负电荷的金纳米颗粒表面，吸附ssDNA的AuNP处于稳定状态，免受电解质盐离子引起的聚集反应(Li H. PNAS，2004，101 (39) =14036-14039)，Li据此设计AuNP聚集反应的核酸杂交比色检测方法。针对心率失常相关靶基因，先进行常规的PCR，获得双链产物。随后加入胶体金溶液及一定的探针(probes),变性退火。如有特异性祀核酸的扩增,胶体金溶液由宝石红色变成紫蓝色，反之，保持其原来宝石红色(Li H. J. Am. Chem. Soc.，2004，216 10958-10961)。此法是ー种核酸检测新思路，非交联的方式不需要对AuNP和探针进行共价修饰。但实际操作中，探针与PCR产物的比例不易掌握，对未知浓度样本需要大量事先测试或对PCR产物纯化、定量，从而难以实际推广应用。近来，利用金纳米颗粒的SPR效应与PCR技术的结合产生了ー种Nano-PCR的检测方法。Cai利用寡核苷酸探针偶联金纳米颗粒，替代常规引物，利用PCR技术对HIV gpl40的外显子序列进行扩增。通过肉眼比色进行检测，快速简便(Miao Cai. Nano Res. 2010, 3 557-563)。但由于技术方法本身的局限性，顔色变化并不明显，实际应用性有限。因此，需要开发ー种简便易行、颜色变化明显的核酸检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供ー种快速简便、肉眼即可观察到显著颜色变化的核酸检测方法及利用该方法进行核酸检测的试剂盒和该方法与该试剂盒在检验检疫中的应用。本发明的发明人在研究中发现，现有技术利用金纳米颗粒进行核酸检 测的方法中的颜色变化并不显著，其主要原因在于探针与待测核酸之间的结合效率低，从而使得探针上的金纳米颗粒的SPR效应不强。增加探针与待测核酸之间的结合效率的方法有很多，但是有些方法本身很繁琐，并不适用于快速简便的进行检测，另外，有些方法需要对每次检测的体系进行摸索和优化，才能得到较好的效果，因此，这些方法都不具备实际应用的便利性。本发明的发明人发现，利用不对称PCR代替现有技术中的常规PCR，能够制得单链含量较高的待测核酸，并提高探针与待测核酸之间的杂交效率，从而能够进一歩的增强探针中金纳米颗粒的SPR效应，使溶液发生显著的颜色变化。本发明提供ー种核酸的检测方法，其特征在于，该方法包括提供待测核酸，在不对称PCR的反应条件下，在PCR缓冲溶液中，使待测核酸与能够扩增靶核酸的ー对弓I物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸接触，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合，通过观测得到的混合物的顔色或颜色变化，判断待测核酸中是否含有靶核酸。本发明还提供一种采用上述的检测方法进行核酸检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括(I)能够扩增靶核酸的ー对引物，所述ー对引物为上游引物和下游引物，且上游引物和下游引物的摩尔比满足不对称PCR反应要求，一对引物独立存放或以混合物的形式存放；(2)相对于所述ー对引物或其混合物独立存放的所述含有探针分子的液体。此外，本发明还提供上述方法或上述试剂盒在检验检疫中的应用。根据本发明的方法对已知的含有炭疽杆菌基因组DNA片段的待测核酸进行检测首先以待测核酸为模板进行不对称PCR，然后将该不对称PCR的产物与含有靶向该炭疽杆菌基因组中特定的DNA片段的探针分子的液体(杂交液)混合，能够在2分钟之内，观测到明显的颜色变化，而对已知的不含有炭疽杆菌基因组DNA片段的待测核酸进行检测，却观察不到任何的颜色变化。由此可见，本发明提供的方法是ー种快速简便、敏感特异、不需要额外的设备、直接用肉眼观测的核酸检测方法。并且，即使用于50 μ L不对称PCR反应的模板核酸的量仅为O. Olng,取5 μ L的不对称PCR的产物与10 μ L探针浓度为I. 5 μ M的含有探针的液体混合，也能够观察到明显的颜色变化，说明本发明的方法灵敏度很高，且对操作条件的要求并不苛刻。除了能够检测炭疽杆菌以外，通过该方法对小鼠β-actin以及霍乱弧菌的DNA片段进行检测的效果也都十分明显，说明本发明的方法具有一定的普适性。
图I为本发明一种实施方式中所用的金纳米颗粒的TEM图；图2为本发明一种实施方式中不对称PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；图3为本发明一种实施方式中不对称PCR产物与含有探针的液体混合后颜色变化的结果；图4为本发明一种实施方式中对检测方法的敏感性进行测试的结果；图5为本发明一种实施方式中对检测方法的特异性进行测试的结果 ；图6为本发明另ー种实施方式中不对称PCR产物与含有探针的液体混合后颜色变化的结果；图7为本发明再一种实施方式中不对称PCR产物与含有探针的液体混合后颜色变化的結果。
具体实施例方式本发明提供了ー种核酸的检测方法，其特征在于，该方法包括提供待测核酸，在不对称PCR的反应条件下，在PCR缓冲溶液中，使待测核酸与能够扩增靶核酸的ー对引物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸接触，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合，通过观测得到的混合物的顔色或颜色变化，判断待测核酸中是否含有靶核酸。所述待测核酸可以为任何核酸样品，例如，从待测样本中提取出来的核酸样品、PCR扩增得到的核酸样品或通过人工合成得到的核酸样品。根据本发明，所述不对称PCR(asymmetric PCR)为本领域公知的概念,是用不等量的ー对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA的方法。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，在PCR反应初期，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA，不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量。本发明中，沿用非限制性引物和限制性引物的概念，并且，所述非限制性引物和限制性引物为能够扩增靶核酸的ー对引物。根据本发明，所述不对称PCR的反应条件可以为本领域常规的反应条件，根据待测核酸的不同，反应条件相应的有所差别，由于在检测时，不知道待测核酸中是否含有靶核酸，因此不对称PCR可能发生，也可能不会发生，但是，无论待测核酸中是否含有靶核酸，都要进行同样的不对称PCR的操作。因此，需要特别说明的是，本发明中，所述进行不对称PCR反应或进行常规PCR反应并不意指一定能够实现扩增，而是指加入的组分和反应条件都符合不对称PCR的要求，或整个体系进行了不对称PCR或常规PCR的反应过程。根据本发明，所述不对称PCR的反应条件包括，预变性温度可以为90_98°C，变性温度可以为90-98°C，退火温度可以为40-60°C，延伸温度可以为70-75°C，循环数优选为大于10，进ー步优选为30-40 ;所述能够扩增靶核酸的一对引物包括限制性引物和非限制性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩尔比根据不同的靶核酸有所不同，本发明对限制性引物和非限制性引物的摩尔比没有特别的限定，只要能够满足不对称PCR反应要求即可，优选地，所述限制性引物和非限制性引物的摩尔比为I : 5-240，进ー步优选为I 10-100;所述限制性引物和非限制性引物具体序列的选择可以通过本领域公知的方法，根据所述祀核酸进行设计和优化，例如可以利用生物学软件Primer Premier、Oligo、DNAMAN等辅助进行设计。根据本发明，不对称PCR反应中加入的各种组分可与本领域现有技术相同，其中，所述PCR缓冲溶液指的是与DNA聚合酶的反应条件相对应的缓冲溶液，一般地，PCR缓冲溶液都随商品化酶附送，所述PCR缓冲溶液加入的体积根据不同的DNA聚合酶自带的PCR缓冲溶液的浓度而定，通常以所述接触所得产物的体积为基准，所述PCR缓冲溶液加入的体积为5-50%，如本发明中，所述酶附送的PCR缓冲溶液为2XPCR缓冲溶液，因此，加入的体积为接触所得产物的体积的50%。PCR缓冲溶液的pH值优选为8. 5-9. 5，进ー步优选为8. 5-8. 8，所述待测核酸的加入量可以在ー个较宽泛的范围内变化，以能够扩增出足够下一歩与含有探针的液体进行混合并呈现出明显的颜色变化为准。所述待测核酸的加入量可以为O. OOl-lOOOnM，根据本发明，待测核酸可以为短的人工合成片段，PCR 扩增产物，也可以为长的基因组DNA，若待测核酸为短的人工合成片段或PCR扩增产物，优选终浓度为O. Ol-IOnM,若待测核酸为基因组DNA，则优选终浓度为10_300nM，因此，总的来说，所述待测核酸的终浓度优选为0. 01-300nM，一般地，也可以以重量计，以50 μ I体积的不对称PCR反应体系为例，所述待测核酸的优选加入量为IOpg-I μ g,进ー步优选为0. Ing-IOOng0所述DNA聚合酶的种类和加入量均可与现有技术相同，例如加入的终浓度为0. 01-0. 2U/y L，优选为0. 02-0. 03U/ μ L,如本发明中使用了 Promega PCR Master mix (2x)扩增系统,聚合酶的终浓度为0. 025U/ μし一般地，所述三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(即4XdNTP)中每种核苷酸的加入量均可为常规值，例如可以为50-500 μ M，进ー步优选为100-300 μ Μ，如本发明中dNTP的终浓度为200 μ M0在满足上述比例的前提下，所述能够扩增靶核酸的ー对引物的加入量，即ー对引物的总量根据不同的靶标有所不同，根据本发明优选为0. 1-10μΜ，进ー步优选为0. 3-3 μ M0根据本发明，将接触所得产物与含有探针分子的液体的混合优选在无机盐MX存在下进行，其中，M为Na和/或K，X为Cl、Br或I中的ー种或多种，所述MX优选为NaCl，且优选地，无机盐MX的加入量使得所述混合物中MX的终浓度为0. 5-1M，最优选为0. 8-1M。本发明的发明人发现，所述混合物中存在上述浓度范围内的氯化钠能够使得当待测核酸含有靶核酸时，检测体系出现极为明显的颜色变化。根据本发明，由于PCR缓冲溶液中也可能含有MX，因此，此处的MX的总浓度也包括PCR缓冲溶液中的MX，但是一般地，PCR缓冲溶液中MX的含量较低，尤其是当只取一部分不对称PCR的产物与含有探针的液体进行混合的时候，由PCR缓冲溶液中引入的MX的量是很少的，因此大多可忽略不计，此处所述MX主要为混合时另外加入的MX,或者MX可以预先与含有探针的液体混合。根据本发明，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合的条件极为宽松，包括，温度以不低于10°c为好，因为太低的温度造成分子布朗运动明显降低，不利于核酸的杂交，温度的上限低于杂交序列的Tm值，一般的，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合的温度可以为15-55°C，优选为20-50°C，最优选为室温，即22_25°C ;将接触所得产物与含有探针分子的液体混合的时间可以为1-60分钟，优选为3-10分钟。本领域技术人员可以明了，此处所述混合的时间为能够观察到颜色变化的最短时间，即使混合时间比上述时间更长，一祥能够实现本发明，并且颜色变化更为明显。
根据本发明，以所述混合物的体积为基准，所述含有探针分子的液体中探针分子的浓度优选为500-1500nM，进ー步优选为600_1000nM，如果为长期储存可以以更高的浓度作为储存液，如以所述含有探针分子的液体的体积为基准，所述探针分子的浓度可以为2_4 u M0根据本发明，所述含有探针分子的液体中的探针分子可包括多种偶联物，每种偶联物由一种纳米颗粒与ー种或多种寡核苷酸形成，每种寡核苷酸的至少部分均与靶核酸的一条链的一部分互补。优选地，至少两种寡核苷酸的至少部分与靶核酸的同一条链的一部分互补；所述寡核苷酸的至少部分与靶核酸互补是指，寡核苷酸可以完全与靶核酸中一部分互补，也可以是寡核苷酸中一部分与靶核酸中的一部分互补，而另一部分不互补，例如，寡核苷酸中靠近纳米颗粒的部分与靶核酸不互补，而远离纳米颗粒的部分与靶核酸互补，互补的程度以二者能够形成稳定的杂交体为准。本发明的实质是为了提高探针与靶核酸之间的结合能力，进而增强探针上金纳米颗粒之间的SPR效应，因此，远离纳米颗粒的部分与靶核酸互补是为了增强探针与靶核酸之间的结合能力，而靠近纳米颗粒的部分与靶核酸可 以不互补则是为了避免可能存在的，由于寡核苷酸的位阻或刚性所导致的探针上的金納米颗粒之间的SPR效应变弱。在本发明的发明宗g的引导下，本领域技术人员能够根据实际情况，对探针，即寡核苷酸序列及其与纳米颗粒的连接方式进行适当的调整和改变，以便能更好的实现本发明，这些内容应视为属于本发明的范围内。所述偶联物，S卩，将纳米颗粒与寡核苷酸进行偶联所得的产物，偶联为本领域公知的概念，即，两个化学实体(或単位)结合生成ー个分子的有机化学反应，所述偶联的方法可以为本领域公知的方法，如，当纳米颗粒为金纳米颗粒时，可将寡核苷酸的5’末端进行巯基修饰(如5’末端碱基上的C6位置)，然后与金纳米颗粒接触，通过形成稳定的Au-S键将二者偶联在一起。5’末端为巯基修饰的寡核苷酸可以通过本领域常规的合成方法得到，如用DNA合成仪进行固相合成，也可以通过商购获得。根据本发明，所述探针分子可以为两种偶联物，也可以为多种偶联物，一种偶联物中可以含有ー种纳米颗粒和ー种寡核苷酸，也可以含有ー种纳米颗粒和多种寡核苷酸，优选地，所述含有探针分子的液体中的探针分子包括两种偶联物，每种偶联物为ー种纳米颗粒与ー种寡核苷酸的偶联物，两种偶联物中的纳米颗粒相同，寡核苷酸不相同，且两种偶联物的摩尔比为I : O. 8-1. 2，由于制备偶联物的过程一致，相对投料量相同，制得的两种偶联物的浓度是基本一致的，因此，在实际应用中，只要取相同体积的两种的偶联物进行混合，二者的摩尔比即能符合上述比例，可以不进行严格的測定，当然，也可以通过測定260nm或520nm处的吸光度值来确定，来精确计算两种偶联物的摩尔比，本发明实施例中通过测定OD值精确控制二者的摩尔数满足上述要求，且比例为I : I。根据本发明，对所述寡核苷酸的长度没有特别的限定，优选地，所述寡核苷酸的长度为10-50个核苷酸，进ー步优选为15-25个核苷酸，在上述范围内可以获得最佳的偶联效率。寡核苷酸探针的设计原则包括，寡核苷酸的3’端，优选不含有多个C或G，寡核苷酸的序列优选不存在潜在的自身互补或形成发夹结构的能力等。根据本发明，在满足上述要求的前提下，对所述偶联物中的纳米颗粒的颗粒直径没有特别的限定，优选地，所述偶联物中的纳米颗粒的颗粒直径为5-100nm，优选为10_20nm。
根据本发明的实质，只要能够通过相对空间距离的变化产生颜色变化的纳米颗粒均可以用于本发明，目前，所述偶联物中的纳米颗粒优选为金纳米颗粒，进ー步优选为颗粒直径约为13nm的金纳米颗粒。本发明中，选择粒径约为13nm的金纳米颗粒的原因是制备方法简便、稳定；粒径差异小，形貌一致，稳定性好；颗粒在520nm处有尖鋭狭窄的吸收峰，一旦峰值偏移，SPR效应导致的颜色变化明显，肉眼容易辨别。但是本发明并不限于这ー种纳米颗粒。根据本发明，所述靶核酸可以为任何生物物种的核酸或其核酸中的一部分，尤其通过对核酸中特征序列部分的检测，可以确定待测核酸中是否含有某种物种的核酸。在应用于有害病毒和细菌的检验检疫时，所述靶核酸可以为炭疽杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌、野兔热杆菌、伤寒杆菌、布氏杆菌、天花病毒、黄热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、班疹伤寒立克次体、肉毒杆菌毒素、鸟疫衣原体、肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌中至少ー种的基因组中的至少一部分。优选地，所述靶核酸为炭疽杆菌、霍乱弧菌的基因组中的至少一部分。根据本发明的实质，本发明适用的靶核酸并不限 于以上所述物种，为了验证体系的可能性，本发明的发明人首先选取了管家基因，小鼠的β -肌动蛋白(β -actin)，作为研究対象，因为管家基因的研究结果对其他基因具有普遍的指导意义，这也是研究新体系的一般模式。此外，本领域技术人员可以预见，当检验的目的为待测样品中是否含有某些有害病毒或细菌而不必知道具体含有的是哪几种时，可以同时加入多个探针进行检测，只要出现阳性结果，则表明必然含有某几种致病病毒(或病菌)中的至少ー种。例如，所述靶核酸的序列可以为炭疽杆菌基因组DNA(或其中的序列片段)，所述限制性引物的序列如SEQ ID NO :1所示，所述非限制性引物的序列如SEQ ID NO :2所示，且限制性引物与非限制性引物的摩尔比为I : 10-100，更优选的比例根据扩增的靶标序列的不同而不同，且对于特定的靶标序列，更优选地比例可以通过常规的试验方法得到；所述探针为金纳米颗粒与寡核苷酸形成的两种偶联物，第一偶联物为金纳米颗粒与SEQ ID NO 3所示的寡核苷酸形成的偶联物，第二偶联物为金纳米颗粒与SEQ ID NO :4所示的寡核苷酸形成的偶联物，且第一偶联物与第二偶联物的摩尔比为I : O. 8-1. 2，进ー步优选为I : I。根据本发明，所述检测的方法可以为分光光度法和/或目视比色法，优选地，目视比色法即通过肉眼看出顔色的变化，并且不需要额外的仪器设备，能够满足快速、便捷的要求。偶联物如果未结合靶核酸，其最大吸收峰在524nm处，如果结合了靶核酸，引发SPR效应，则最大吸收峰发生红移(red-shift)，文献报道最大吸收峰飘移7nm以上吋，肉眼可分辨。本发明中，对于不同靶标核酸的检测，其最大吸收峰的位置不同，如对于小鼠β-actin进行检测时，其最大吸收峰飘移至575nm，肉眼很容易分辨，而对于炭疽杆菌基因组DNA进行检测时，其最大吸收峰飘移至537nm，肉眼也能够十分明显的分辨；由于偶联物与靶核酸结合，金纳米颗粒会团聚从而导致由于单分散性金纳米颗粒有效浓度的減少造成的吸收峰強度的降低，一般地，2-10分钟内能够观察到明显的颜色变化，当把偶联物与靶核酸的混合物放置过夜或更长时间后，团聚的金纳米颗粒会发生沉淀，因而溶液顔色已经不是紫蓝色，而是逐渐变得澄清，因此上清液的最大吸收峰波长会随时间发生变化，最大吸收峰强度也会进ー步降低，直至无法检测到。由此可以看出，在偶联物与靶核酸结合的初期，能够通过肉眼观察到明显的红-蓝颜色转化，当结合的时间较长后，则能通过肉眼观察到明显的溶液变澄清的现象，即，只要待测核酸中含有足够检出量的靶核酸，根据本发明的检测方法就可以通过肉眼十分清晰 的观察到顔色的变化，从而判读检测結果。本发明还提供了一种采用上述的检测方法进行核酸检测的试剂盒，其特征在干，该试剂盒包括(I)能够扩增靶核酸的ー对引物，所述ー对引物为限制性引物和非选择性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩尔比满足不对称PCR反应要求，具体的，所述限制性引物和非限制性引物的摩尔比为I : 5-240，进ー步优选为I : 10-100 ; —对引物独立存放或以混合物的形式存放，优选地，以混合物的形式存放；(2)相对于所述ー对引物或其混合物独立存放的上述含有探针分子的液体。其中，所述试剂盒中各个组分的量可以根据实际应用进行调整。根据本发明，由于DNA聚合酶、PCR缓冲溶液和4X dNTP为本领域常规的试剂，并且DNA聚合酶的存放条件相对较苛刻，因此，所述试剂盒中优选不包括上述组分，当然也可以包括上述组分PCR缓冲溶液、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸中的ー种或多种，其中，DNA聚合酶独立存放，进ー步优选为独立低温存放；其他组分各自独立存放或以ー种或多种组分的混合物的形式存放。上述组分的相对量，浓度等可以与前文描述相同，在此不再赘述。本发明所述的方法和所述的试剂盒可以应用于检验检疫领域，尤其适用于需要快速进行检测的场合，如车站、机场、海关等。下面，通过实施例对本发明进行更详细的说明。由于本发明的方法具有普适性，因此，选取具有代表性的几种靶核酸进行检测，包括小鼠的β-actin基因，其基因的NCBI Genbank号为NM_007393. 2 ;小鼠β-actin基因的一部分，如 SEQ ID NO 5 所示5’ -CTT CTC TTT GAT GTC ACG CAT ATG GAA TCC TGT GGCATC-3’;炭疽杆菌的基因组DNA中的特定序列片段，其NCBI Genbank号为AF_360750. I ;以及霍乱弧菌的CTX-A基因，其NCBI Genbank号为EU_546136. I。其中，炭疽杆菌基因组DNA和霍乱弧菌基因组DNA由军事医学科学院惠赠。其中，测试用TEM为TECNAI公司的G2 F30透射电镜；紫外可见分光光度计为微量紫外可见-荧光分光光度计e-spect ;寡核苷酸序列(包括常规的和5’巯基修饰的)委托Invitrogen公司进行合成；Nap_5纯化柱购自GE公司；所用DNA聚合酶为Promega DNA聚合酶，所用PCR缓冲液为Promega聚合酶附带的Promega PCR Mix (2 X)缓冲液；用于克隆小鼠β -actin基因序列及其中片段的不对称PCR和常规PCR的程序为94°C, 2min ；94°C，20sec ；55°C,20sec ；70°C,20sec ；32 个循环，70°C，3min，用于克隆炭疽杆菌中的序列片段的不对称 PCR 的程序为 940C，3min ；94°C，30sec ；40°C，30sec ；72°C, 30sec ；40 个循环，72°C，5min ;用于克隆霍乱弧菌CTX-A基因的不对称PCR的程序为94°C，3min ;94°C，25sec ；60°C，20sec ；72°C,25sec ；40cycles ;72°C，5min ;使用 Promega 的总 RNA提取试剂盒从小鼠肝脏中分离得到小鼠的总RNA，然后通过反转录得到cDNA。本发明实施例中所用常规化学试剂均为分析纯，所述纳米级水通过美国Mi 11 ipore公司的Mi 11 i_Q超纯水系统得到,其他的分子生物学操作參考试剂附带的说明书和《分子克隆》(第三版)进行。制备例I
本制备例用于合成颗粒直径约为13nm的金纳米颗粒。采用经典的氯金酸-柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒。所有玻璃容器用王水浸泡，然后用纳米级水漂洗浄，干燥备用。在50mL三角烧瓶中，加入40mL的纳米级水及O. 4mL、lg/mL的HAuC14(氯金酸)，用磁力搅拌器剧烈搅拌均匀，加热至沸腾。随后快速一次性加入I. 2mL、lg/mL的柠檬酸钠，溶液逐步从浅黄至深红。继续加热15分钟，随后停止加热，继续搅拌自然降温至室温。密闭溶液并在4°C避光保存，用紫外-可见光分光光度计在520nm处测量最大吸收峰，计算浓度为3nM。取IOyL样品滴加铜网，真空抽干，用透射电镜(TEM)表征，结果如图I所示，纳米金颗粒的粒径约为13nm，圆型，均匀一致，单分散性良好。制备例2根据小鼠β-actin的cDNA序列，选择合适的杂交位点，并据此设计限制性引物 P1、非限制性引物P2及寡核苷酸Oligol和01igo2，用于后续的分子杂交，序列分别如下Pl :5，-GAT GCC ACA GGA TTC CAT A-3’ (SEQ ID NO 6)；P2 :5’ -CTT CTC TTT GAT GTC ACG CA-3’ (SEQ ID NO 7)；Oligol :5，-TGC GTG ACA TCA AAG AGA AG-3’ (SEQ ID NO 8)；01igo2 :5，-GAT GCC ACA GGA TTC CAT A-3’ (SEQ ID NO 9)；其中，用于偶联的Oligol和01igo2的5’端碱基的C6被巯基修饰。需要说明的是，本发明实施例中所用的探针中的寡核苷酸均为商购的5’端碱基的C6位置上进行巯基修饰的寡核苷酸。制备例3本制备例用于制备含有探针的液体。将50D巯基修饰的寡核苷酸干粉溶于80 μ L的ニ硫化物裂解液(170mM磷酸缓冲液，pH8. O)中，待完全溶解后得到寡核苷酸的溶液，将其分成4管，每管20μし将DTT(ニ硫苏糖醇)也溶于ニ硫化物裂解液中，得到新鮮配制的O. IM的DTT溶液。加SOyL的上述DTT溶液至20 μ L的上述寡核苷酸的溶液中，得到100 μ LDNA的DTT还原液，用铝箔将其包裹置于室温反应I小时，每半小时涡旋振荡5秒。与此同时，用至少IOmL以上的纳米级纯水预洗Nap-5纯化柱备用。将反应后的100 μ L的DNA的DTT还原液上样到Nap-5纯化柱中，加入400 μ L的Milli-Q水洗柱，最后加入500 μ L的Milli-Q水洗脱，得到含巯基的寡核苷酸样品，收集样品于I. 5mL的离心管中，用紫外可见光分光光度计测定OD26tl值进行定量。在9000 X g，4°C下离心15分钟，浓缩金纳米颗粒(Au-NPs)至17nM，按照含巯基的寡核苷酸Au-NPs = 200 I的比例(摩尔比)混合。用铝箔将其包裹，低速水平振摇，室温下振摇16小时或37°C下振摇8小吋。随后将溶液调为NaCl浓度为O. 1M、磷酸盐浓度为IOmM的磷酸缓冲液(pH = 7. O)，室温孵育40小时继续偶联。将所得偶联物在HOOOrpm离心25-40分钟，移去上清；用含有O. IM的NaCl、IOmM磷酸盐的磷酸缓冲液(pH = 7. O)重悬、离心3次，洗涤沉淀，充分去除未结合的单链DNA。偶联物最后溶于O. 3M的NaCl、0. 01重量％的叠氮化钠、IOmM磷酸盐的磷酸缓冲液(pH = 7. O)中，4°C下避光保存。正常功能化的纳米金顔色同修饰前ー样为宝石红，无颗粒聚集。根据上述方法分别制得含有探针Probel和Probe2的液体,探针Probel和Probe2分别为Oligol和01igo2与金纳米颗粒的偶联物(即上述巯基修饰的寡核苷酸干粉分别为Oligol和01igo2的干粉)，且以含有探针的液体的体积为基准，所述Probel和Probe2的浓度均为I. 5 μ Μ。实施例I进行不对称PCR，建立50 μ L的不对称PCR反应体系，加样如表I所示。表I
组分终浓度
模板Ing/ μ L 4 XdNTP每种 200 μ M
Promega PCR MixIX
Promega DNA 聚合酶O. 025U/ μ L
PlO. 02 μ M
Ρ2O. 6μΜ
ddH20全 50 μ L其中，模板可以为小鼠的cDNA ;也可以为小鼠cDNA中的一段，如SEQ ID NO :5所示序列的DNA。本实施例中模板为SEQ ID NO :5所示序列的DNA，通过商购得到。实施例2进行不对称PCR，加样体系如表2所示。表 2
组分终浓度
模板Ing/ μ L
4 XdNTP每种 200 μ M
Promega PCR MixIX
Promega DNA 聚合酶O. 025U/ μ L
PlO. 01 μ M
Ρ2O. 6μΜ
ddH20至 50 μ L其中，本实施例中模板为SEQ ID NO5所示序列的DNA。实施例3
进行不对称PCR，加样体系如表3所示。表权利要求
1.ー种核酸的检测方法，其特征在于，该方法包括提供待测核酸，在不对称PCR的反应条件下，在PCR缓冲溶液中，使待测核酸与能够扩增靶核酸的ー对引物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸接触，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合，通过观测得到的混合物的顔色或颜色变化，判断待测核酸中是否含有靶核酸。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其中，不对称PCR的反应条件包括，预变性温度为90-98°C，变性温度为90-98°C，退火温度为40_60°C，延伸温度为70_75°C，循环数大于10 ；所述能够扩增靶核酸的一对引物包括限制性引物和非限制性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩尔比为I : 5-240。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，循环数为30-40;且限制性引物和非限制性引物的摩尔比为I : 10-100。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的检测方法，其中，以所述接触所得产物的体积为基准，所述PCR缓冲溶液加入的体积为5-50%，且PCR缓冲溶液的pH值为8. 5-9. 5，所述待测核酸的加入量为O. OOl-lOOOnM，所述DNA聚合酶的加入量为0. 01-0. 2U/y L，所述三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸各自的加入量为50-500 μ Μ，所述能够扩增靶核酸的ー对引物的加入量为 0. 1-5 μ Mo
5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，以所述接触所得产物的体积为基准，所述待测核酸的加入量为l_300nM，所述DNA聚合酶的加入量为0. 01-0. IU/ μ L，所述三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸各自的加入量为100-300 μ Μ，所述能够扩增靶核酸的ー对引物的加入量为O. 3_3 u Mo
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的检测方法，其中，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合在无机盐MX存在下进行，M为Na和/或K，X为Cl、Br或I中的一种或多种，无机盐MX的加入量使得所述混合物中无机盐MX的浓度为0. 5-1. 5摩尔/升。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的检测方法，其中，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合的条件包括，温度不低于10°c，时间为1-60分钟。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的检测方法，其中，以所述混合物的体积为基准，所述含有探针分子的液体中探针分子的浓度为500-1500nM。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的检测方法，其中，所述含有探针分子的液体中的探针分子包括多种偶联物，每种偶联物由一种纳米颗粒与ー种或多种寡核苷酸形成，每种寡核苷酸中的至少部分均与靶核酸的一条链的一部分互补。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，所述含有探针分子的液体中的探针分子包括两种偶联物，每种偶联物为ー种纳米颗粒与ー种寡核苷酸的偶联物，两种偶联物中的纳米颗粒相同，寡核苷酸不相同，且两种偶联物的摩尔比为I : 0.8-1.2。
11.根据权利要求9或10所述的检测方法，其中，所述寡核苷酸的长度为10-50个核苷酸。
12.根据权利要求9-11中任意一项所述的检测方法，其中，所述偶联物中的纳米颗粒的颗粒直径为5-100纳米。
13.根据权利要求9-12中任意一项所述的检测方法，其中，所述偶联物中的纳米颗粒为金纳米颗粒。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的检测方法，其中，所述靶核酸为炭疽杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌、野兔热杆菌、伤寒杆菌、布氏杆菌、天花病毒、黄热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、班疹伤寒立克次体、肉毒杆菌毒素、鸟疫衣原体、肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌中至少ー种的基因组中的至少一部分。
15.根据权利要求14所述的检测方法，其中，所述靶核酸为炭疽杆菌基因组DNA，所述限制性引物的序列如SEQ ID NO :1所示，所述非限制性引物的序列如SEQ ID NO :2所示，且限制性引物与非限制性引物的摩尔比为I : 10-100 ;所述探针为金纳米颗粒与寡核苷酸形成的两种偶联物，第一偶联物为金纳米颗粒与SEQ ID NO :3所示的寡核苷酸形成的偶联物，第二偶联物为金纳米颗粒与SEQ ID NO :4所示的寡核苷酸形成的偶联物，且第一偶联物与第二偶联物的摩尔比为I : O. 8-1.2。
16.根据权利要求1-15中任意一项所述的检测方法，其中，所述检测的方法为目视比色法。
17.ー种采用权利要求1-16中任意一项所述的检测方法进行核酸检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括 (1)能够扩增靶核酸的ー对引物，所述ー对引物为限制性引物和非限制性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩尔比满足不对称PCR反应要求，一对引物独立存放或以混合物的形式存放； (2)相对于所述ー对引物或其混合物独立存放的所述含有探针分子的液体。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，所述限制性引物和非限制性引物的摩尔比为 I 5-240。
19.根据权利要求17或18所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括PCR缓冲溶液、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸中的ー种或多种，其中，DNA聚合酶独立存放，其他组分各自独立存放或以ー种或多种组分的混合物的形式存放。
20.权利要求1-16中任意一项所述的方法或权利要求17-19中任意一项所述的试剂盒在检验检疫中的应用。
全文摘要
本发明提供一种核酸的检测方法，其特征在于，该方法包括提供待测核酸，在不对称PCR的反应条件下，在PCR缓冲溶液中，使待测核酸与能够扩增靶核酸的一对引物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸接触，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合，通过观测得到的混合物的颜色或颜色变化，判断待测核酸中是否含有靶核酸。本发明还提供一种采用上述检测方法进行核酸检测的试剂盒，以及该检测方法和试剂盒在检验检疫中的应用。本发明提供的方法是一种快速简便、敏感特异、不需要额外的设备、直接用肉眼观测的核酸检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102719520SQ20111007866
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月30日 优先权日2011年3月30日
发明者刘艳华, 徐一, 梁兴杰, 车志军, 邓华, 马晓溦 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局, 国家纳米科学中心