专利名称：一种基因芯片制备方法及检测方法
技术领域：
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及的是一种可以快速检测鉴别禽流感病毒主要亚型及同时可检测新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒的基因芯片。
背景技术：
目前对于鉴别禽流感(Avian influenza, Al)亚型及新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、鸡减蛋综合症病毒(EDS-76)的检测主要是血清学和PCR方法。血清学方法特异性好，是禽流感亚型鉴别及新城疫、鸡减蛋综合症的常用方法，但操作过程较为繁琐费时，并且禽流感变异较快亚型众多，用已知HA亚型的抗血清无法检出新出现的亚型，所以该方法无法达到快速准确检测的要求。PCR技术灵敏度高并且快速，相对于传统方法而言大大缩短了检测过程，在此方法基础上发展起来的荧光PCR、荧光RT- PCR又进一步提高了灵敏度，但其缺点是容易出现假阳性以及一次反应只能鉴别少数几种病原，所以也无法通过一次反应快速鉴别禽流感亚型的要求。尤其对于检验检疫部门，有时会要求同时检测几种不同的病原，在这种情况下，建立一种快速准确而且又能同时检测几种不同病原的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴别禽流感病毒通用型及区分禽流感病毒亚型H4、H5、 H6、H7、H9、Nl、N2、N9，同时又能检测新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒的基因芯片的制造方法及其使用方法。本发明的技术方案如下
一种基因芯片，其中，所述基因芯片的基质膜上固定有用于鉴别禽流感通用型及区分 H4、H5、H6、H7、H9、NU N2, N9亚型，同时又能检测新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒的特异性探针；
禽流感病毒通用型特异性探针序列如SEQ NO. 1所示；禽流感病毒H4特异性探针序列如SEQ NO. 2所示；禽流感病毒H5特异性探针序列如SEQ NO. 3所示；禽流感病毒H6特异性探针序列如SEQ NO. 4所示；禽流感病毒H7特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO. 5飞所示；禽流感病毒H9特异性探针序列如SEQ N0. 7所示；禽流感病毒m特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO. 8、所示；禽流感病毒N2特异性探针序列如SEQ NO. 10所示；禽流感病毒N2特异性探针序列包括2条，分别如SEQ N0. 11_12所示；新城疫病毒NDV特异性探针序列包括2条，分别如SEQ N0. 13-14所示；鸡减蛋综合症病毒EDS-76特异性探针序列如SEQ N0. 15所示。所述的基因芯片，其中，所述特异性探针的5’端标记15-30 Poly T。所述的基因芯片，其中，所述基质膜为硅晶片、玻璃或高分子。一种上述的基因芯片的制备方法，其中，包括以下步骤
51、在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml、H4、H5、H6、H7、H9、Ni、N2、N9以及NDV、 EDS-76基因序列，利用生物信息学软件I^rimer Express 2. 0设计特异性探针；
52、合成特异性探针；53、使用DR.Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥IOmin ；每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照；
54、用紫外交联仪照射基因芯片7 10分钟，照射能量为1.2J，以固定特异性探针，最后依次用Milli-Q水和95%乙醇洗涤，干燥。所述的基因芯片的制备方法，其中，所述S2步骤还包括在特异性探针的5’端标记15-30 Poly T，以使特异性探针固定在基质膜上。所述的基因芯片的制备方法，其中，所述阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为 (MH2O。一种上述的基因芯片的检测方法，其中，包括以下步骤
51、检测病原特异性弓I物设计在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml、H4、H5、H6、H7、 H9、N1、N2、N9以及NDV、EDS_76基因序列，利用生物信息学软件I^rimer Express 2. O设计病原特异性引物；并在每种病原对应引物对的上游引物标记生物素biotin ；
52、核酸提取使用DNA/RNA磁珠提取试剂盒提取待测样品的核酸，获取下一步核酸扩增用的模板；
53、进行PCR扩增使用OneStep RT-PCR试剂盒，按照试剂盒说明书上的步骤进行PCR 扩增；
54、杂交取S3步骤的PCR扩增的产物20μ L与200 μ L的DR.杂交缓冲液充分混合， 沸水变性6 min，迅速转移至冰上10 min ；将上述混合物转移至基因芯片室内，平铺均勻，避免在底部产生气泡，振动温箱中杂交45-60 min，杂交温度为47°C ；弃去杂交液，用DR.洗涤液洗涤三次；于杂交室中加0.2 μ L Str印-AP和200 μ L封闭液的混合液，室温反应30 min，弃去封闭液，以DR.洗涤液重复洗涤三次，吸除芯片上残留的水分；
55、显色每个基因芯片室加4μ L NBT/BCIP和196 μ L DR.检测液的混合液，将芯片置于暗室中反应5-10 min，弃去检测液，用水冲洗至杂交点清晰为止；
56、读取结果利用芯片反应仪扫描读取结果。所述的基因芯片的检测方法，其中，所述S3步骤中，PCR扩增的反应条件分别为 500C 30 min, 940C 3 min, 94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 40 s，72°C 10 min, 35 个循环。所述的基因芯片的检测方法，其中，步骤S3中，进行PCR扩增所用的引物为禽流感病毒通用型特异性引物、禽流感病毒各亚型的特异性引物、新城疫病毒的特异性引物或鸡减蛋综合症病毒特意性引物。本发明的有益效果本发明可以在一块芯片室内同时进行禽流感病毒通用性筛选、鉴别H4、H5、H6、H7、H9、Nl、N2、N9等亚型以及新城疫病毒和鸡减蛋综合症病毒的检测。 采样时可以从咽肛拭子、蛋制品及肉类中直接获取，经对样品提取核酸后经PCR反应扩增靶基因用于杂交。基因芯片具有准确性高、特异性强、高通量的优点，可以快速、精确、批量检测送检样品。此外，基因芯片方法所采用的探针序列较短，只有靶基因完全与之配对时才能杂交显示，提高了检测的准确性；直接对样品提取核酸通过PCR扩增靶基因，可以省去常规方法中的对细菌病毒分离培养的繁琐步骤；基因芯片方法可以在微小载体上布满大量检测探针，具有高通量的优势。本发明中所阐述的方法经应用于人工制备阳性样品和口岸送检样品，发现可以快速、精确、特异性的鉴别以上病原。
图1是本发明禽流感各亚型及NDV、EDS-76杂交结果。图2是本发明实施例中使用本发明基因芯片检测禽流感病毒通用型的结果图。图3是本发明实施例中使用本发明基因芯片检测禽流感病毒亚型的结果图。图4是实施例中荧光定量PCR检测禽流感病毒通用型的结果图。图5是实施例中荧光定量？0 检测禽流感病毒!15、!16、!17、!19的结果图。
具体实施例方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。本发明基因芯片的制备方法的具体步骤如下
51、设计检测病原的特异性探针在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml、H4、H5、H6、 H7、H9、Ni、N2、N9以及NDV、EDS-76基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2.0 设计特异性探针；
52、特异性探针合成由上海超世生物科技公司合成；
53、特异性探针处理在探针的5’端标记15-30Poly T，以使特异性探针很好固定在基质膜上；基质膜的材料可以为硅晶片，玻璃或高分子；
54、点样使用DR.Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥10 min ；每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照；其中，阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH20 ；
55、固定用紫外交联仪照射基因芯片疒10min，照射用紫外线波长为254 nm，照射能量为1. 2J，以固定特异性探针，最后依次用Milli-Q水和95%乙醇洗涤，干燥。本发明基因芯片的检测方法的具体步骤如下
51、检测病原特异性引物设计在GenBank上分别选取选取禽流感病毒的Ml、H4、H5、 H6、H7、H9、Ni、N2、N9以及NDV、EDS-76基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2.0设计特异性引物；其中每种病原对应引物对的上游引物标记生物素biotin ；
52、核酸提取使用DNA/RNA磁珠提取试剂盒提取待测样品的核酸，获取下一步核酸扩增用的模板；
53、进行PCR扩增使用OneStep RT-PCR试剂盒，按照试剂盒说明书上的步骤进行PCR 扩增，反应条件分别为 50°C 30 min, 94°C 3 min, 94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 40s，72°C 10 min，;35个循环；
54、杂交取待测样品核酸的PCR产物各20μ L与200 μ L的DR.杂交缓冲液(DR.为台湾晶宇公司所开发的诊断性生物芯片一种产品系列简称)充分混合，沸水变性6 min，迅速转移至冰上10 min ；将上述混合物转移至芯片室内，平铺均勻，避免在底部产生气泡，振动温箱中杂交45-60 min，杂交温度为47°C ；弃去杂交液，用DR.洗涤液洗涤三次；于杂交室中加0.2 μ L Str印-AP和200 μ L封闭液的混合液，室温反应30 min，弃去封闭液，以 DR.洗涤液重复洗涤三次，吸除芯片上残留的水分；
55、显色每个基因芯片室加4μ L NBT/BCIP和196 μ L DR.检测液的混合液，将芯片置于暗室中反应5-10 min，弃去检测液，用水冲洗至杂交点清晰为止；
56、读取结果利用芯片反应仪扫描读取结果。在本发明实施例中，基因芯片中的探针的点样矩阵如表1所示。其中，点A为阳性
权利要求
1.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片的基质膜上固定有用于鉴别禽流感病毒通用型及区分H4、H5、H6、H7、H9、NU N2, N9亚型，同时又能检测新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒的特异性探针；禽流感病毒通用型特异性探针序列如SEQ NO. 1所示；禽流感病毒H4特异性探针序列如SEQ NO. 2所示；禽流感病毒H5特异性探针序列如SEQ NO. 3所示；禽流感病毒H6特异性探针序列如SEQ NO. 4所示；禽流感病毒H7特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO. 5飞所示；禽流感病毒H9特异性探针序列如SEQ NO. 7所示；禽流感病毒m特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO. 8、所示；禽流感病毒N2特异性探针序列如SEQ NO. 10所示；禽流感病毒N2特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO. 11-12所示；新城疫病毒NDV特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO. 13-14所示；鸡减蛋综合症病毒EDS-76特异性探针序列如SEQ NO. 15所示。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述特异性探针的5’端标记15-30 Poly T0
3.根据权利要求1所示的基因芯片，其特征在于，所述基质膜为硅晶片、玻璃或高分子。
4.一种如权利要求1所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤·51、在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml、H4、H5、H6、H7、H9、Ni、N2、N9以及NDV、 EDS-76基因序列，利用生物信息学软件I^rimer Express 2. O设计特异性探针；·52、合成特异性探针；·53、使用DR.Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥IOmin ；每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照；·54、用紫外交联仪照射基因芯片7 10分钟，照射能量为1.2J，以固定特异性探针，最后依次用Milli-Q水和95%乙醇洗涤，干燥。
5.根据权利要求4所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述S2步骤还包括在特异性探针的5’端标记15-30 Poly T，以使特异性探针固定在基质膜上。
6.根据权利要求4所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述阳性对照为多聚 PolyT,阴性对照为ddH20。
7.一种使用如权利要求1所述的基因芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤·51、检测病原特异性弓I物设计在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml、H4、H5、H6、H7、 H9、N1、N2、N9以及NDV、EDS_76基因序列，利用生物信息学软件I^rimer Express 2. O设计病原特异性引物；并在每种病原对应引物对的上游引物标记生物素biotin ；·52、核酸提取使用DNA/RNA磁珠提取试剂盒提取待测样品的核酸，获取下一步核酸扩增用的模板；·53、进行PCR扩增使用OneStep RT-PCR试剂盒，按照试剂盒说明书上的步骤进行PCR 扩增；·54、杂交取S3步骤的PCR扩增的产物20μ L与200 μ L的DR.杂交缓冲液充分混合， 沸水变性6min，迅速转移至冰上IOmin ；将上述混合物转移至基因芯片室内，平铺均勻，避免在底部产生气泡，振动温箱中杂交45-60 min，杂交温度为47°C;弃去杂交液，用DR.洗涤液洗涤三次；于杂交室中加0. 2 μ L Strep-AP和200 μ L封闭液的混合液，室温反应30min，弃去封闭液，以DR.洗涤液重复洗涤三次，吸除芯片上残留的水分；S5、显色每个基因芯片室加4μL NBT/BCIP*196yL DR.检测液的混合液，将芯片置于暗室中反应5-lOmin，弃去检测液，用水冲洗至杂交点清晰为止；S6、读取结果利用芯片反应仪扫描读取结果。
8.根据权利要求7所述的基因芯片的检测方法，其特征在于，步骤S3中，PCR扩增的反应条件分别为 50°C 30min，94°C 3min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 72°C 10min,35循环。
9.根据权利要求7所述的基因芯片的检测方法，其特征在于，步骤S3中，进行PCR扩增所用的引物为禽流感病毒通用型特异性引物、禽流感病毒各亚型的特异性引物、新城疫病毒的特异性引物或鸡减蛋综合症病毒特意性引物。
全文摘要
本发明公开了一种基因芯片及其检测方法，本发明基因芯片可以在一块芯片室内同时进行禽流感病毒通用性筛选、鉴别H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9等亚型以及新城疫病毒和鸡减蛋综合症病毒的检测。
文档编号C12Q1/68GK102191339SQ201110078639
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月30日 优先权日2011年3月30日
发明者廖秀云, 徐海聂, 沙才华, 王振全, 罗宝正, 薄清如, 陈伟生 申请人:珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心