专利名称：一种细胞培养装置及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养装置及其应用，特别涉及一种可替代传统液体操作工作站的廉价、低消耗、高通量的细胞培养装置。
背景技术：
基于细胞的高通量实验在细胞的生物化学研究、药物研发、单细胞研究及组织工程学等众多领域有着广泛应用。缩小这些大批量实验的反应体积不仅可以减少耗材和试剂的消耗，而且能够产生更少的废液。为适应这种需求，高密度孔板和阵列反应器越来越多地被运用到高通量细胞实验中。虽然近年来已经发展了细胞的定位播种和定位收获技术，但是其他自动化的液体样品操作，尤其是单孔分辨率的液体操作，如对孔板上单个孔的细胞换液、细胞刺激的添加和去除等，仍然只能依赖于价格昂贵的液体操作工作站。使用微流芯片技术不仅可以将细胞培养在纳升、皮升体积的独立培养室中，而且能够对细胞培养环境实现精确控制，这些特点使微流芯片成为了高通量细胞培养的理想平台。然而，为同时实现高通量实验和单个反应室的独立控制，微泵、微阀等功能元件需要被高密度的集成到一块微流芯片上，这就大大增加了芯片制作的难度。此外，微泵、微阀的驱动部件如压缩空气、连接管路、电路控制部分、电磁阀等体积庞大，这就导致芯片上的细胞培养很难在传统培养箱内进行。虽然近年来数字微流芯片已经应用在细胞实验中，但其通量有限，且因需要制作电极而导致加工工艺复杂。
发明内容
本发明的目的正是为了解决现有技术中细胞培养通量低、劳动密集、消耗大、成本高的问题，提供了一种细胞培养装置，该系统可高通量地实现细胞培养的全套操作，采用一个优选的实施方式，细胞可以被均匀地播种到12X8个容积约为300纳升的微井中并培养48小时，每8小时更换培养液一次，并可实现对任意孔中细胞的传代、转染以及固定染色。本发明的优点在于I.高通量。传统方法一般用96孔板、384孔板，用本发明的方法很容易做到30 X 30、50 X 50、η X m个孔(井)，η和m都可根据实际需要选择。2.自动化。液体驱动装置和三维平移台都由程序自动控制。3.消耗少。每个微孔(微井)的工作体积在100纳升到500纳升。4.芯片可随意设计，制作简单。可根据需要随意设计管道数目和微井数目、间隔，可对任意微孔(微井)进行操作。5.成本低。只需三维平移台和蠕动泵等常规的液体驱动装置，与商业化仪器相比造价低廉。进行换液等操作时对细胞伤害小。传统的微量细胞培养中，换液操作先将原有培养液全部去除，再加入新培养液，这就意味着加入新培养液前只有少量培养液覆盖在细胞上，这一方面增加了培养液蒸发导致细胞暴露在空气中的可能性，另一方面增加了液面滑过细胞表面时对细胞造成的剪切力。使用本发明提供的细胞培养装置进行换液，可以先导出微井中部分原有培养液，再加入等量新培养液(或者在导出原培养液的同时注入等量新培养液)，并循环多次，这就保证了整个换液过程中细胞都浸没在培养液中，而且液体操作都是对细胞表面以上的液体进行，从而减少了对细胞的伤害。本发明中的“芯片”与通常本领域所定义的芯片概念相同，其外观为厚度均一的平整片状物体，最常见的形状为长方形或正方形。本发明中的“微流层”是一个空间的概念，常见的微流芯片具有长、宽、厚三个维度，在“厚”这个维度上可以划分为若干“层”，其中每一层内部的所有微流通道都是完整的(即该层内的微流通道除出口和入口外都在该层的空间以内)。层与层之间可以是一个整 体，也可以有物理间隔。本发明采用的技术方案如下。一种能代替液体操作工作站的细胞培养装置，包括微井芯片、三维平移台以及至少一块微流芯片，所述微流芯片包括至少一个微流层，每个微流层中具有至少一条微流通道并且微流芯片具有的微流通道的总数大于或等于2，所述微流通道在微流芯片上具有两个开口，其中一个开口作为微流入口，另外一个开口为微流出口，且除入口、出口外，微流通道的其他部分都在微流层内部；至少有两条微流通道的出口之间的距离小于微井芯片上一个微井的尺寸，这样，所述至少两条微流通道就可以同时对同一个微井中的液体进行操作了。上述至少两条微流通道构成一个微流通道组，所述微流通道组中至少有一条微流通道中液体的流动方向与其他微流通道中液体的流动方向相反，这样设计是为了利用同一个微流通道组中的微流通道同时对同一个微井中的液体进行注入和导出操作；每一个微流通道的入口都与一台液体驱动装置相连，通过所述液体驱动装置驱动液体在微流通道里流动；所述微井芯片具有至少两个微井，微井的尺寸大于微流通道组中所有微流通道截面尺寸之和，以保证操作时微流通道组中所有的微流出口都能同时位于微井内部。为避免歧义，对上述“尺寸”的含义说明如下微井的“尺寸”指的是微井周边沿上的任意两点之间的距离的最大值；微流通道截面“尺寸”指的是微流通道截面周边沿上任意两点之间的距离的最大值。采用上述技术方案便可以解决现有技术中最令人头痛的技术问题如何在进行换液等操作时尽量避免对微井中的细胞造成伤害。如前所述，传统的微量细胞培养中，换液操作先将原有培养液全部去除，再加入新培养液，这就意味着加入新培养液前只有少量培养液覆盖在细胞上，这一方面增加了培养液蒸发导致细胞暴露在空气中的可能性，另一方面增加了液面滑过细胞表面时对细胞造成的剪切力，从而不可避免地会对细胞造成伤害。而使用上述细胞培养装置进行换液，可以利用三维平移台控制微流芯片与微井芯片的相对位置，使得同一个微流通道组中的所有微流通道的出口都同时与同一个微井中的液体接触，通过某一条或几条微流通道先导出微井中部分原有培养液，再通过其他的(一条或几条)微流通道加入等量新培养液(或者在导出原培养液的同时注入等量新培养液)，并循环多次，这就保证了整个换液过程中细胞都浸没在培养液中，而且液体操作都是对细胞表面以上的液体进行，从而减少了对细胞的伤害。优选的，所述微流芯片具有两个微流层，两个微流层中微流通道的数目相同，每一个微流通道都与另外一个微流层中的一个微流通道构成一个微流通道组，所有的微流出口都分布在微流芯片的同一个侧边上。具有这样结构的微流芯片是最常用的，通常能满足大部分情况下的需求。通过设置两个来自不同微流层中的微流通道组成微流通道组，可以使得两个微流出口足够接近，例如可以将它们的出口设定在位于垂直于微流芯片的同一条直线上，两个出口之间只相隔一个将它们分开的薄层。若两个微流层分别称为第一微流层和第二微流层，则可以通过选择或设置液体驱动装置，使得第一微流层中微流通道内的液体在液体驱动装置的驱动下注入微井，而第二微流层中的微流通道在液体驱动装置的驱动下将微井中的液体导出。优选地，可以将微流层的厚度设置得比较薄，这样可以使微流芯片适于较少量液体的操作。具体的厚度可以根据实际应用时的需要来确定，太厚的微流芯片在进行液体操作时容易沾到微流出口处的液体。一般来说，在nL-μ L的量级上，可以将微流层的厚度设置为小于或等于1_，优选小于或等于500 μ m，更优选小于或等于300 μ m。优选地，微流芯片的微流出口处向外突起为楔形，微流通道的出口位于楔形的尖端上。这样设置的好处可以参照附图2进行简单地说明如图2(a)所示，微流出口处向外突起为楔形，微流通道的出口位于楔形的尖端，这样进行液体操作的时候，液体样品不会沾到微流芯片的侧边，从而避免了样品的浪费和污染。 优选地，微流出口表面为疏水材料，微井芯片的微井内表面为亲水材料。由于细胞培养液一般都是水溶液，如此设置会使得对液体的操作变得容易，当微流芯片的微流出口从一个微井移动到另一个微井的时候，不会造成液体样品的交叉污染。将微流出口表面处理成疏水的方法有很多，例如可以用1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷对微流出口处的微流层进行处理使其疏水；而简单地选择玻璃等亲水的基底作为微井芯片的基底，便可以方便地得到具有亲水性的微井内表面的微井芯片。优选地，微流芯片最外面的两个微流层外面各设置一个不包括任何微流通道的厚层，所述厚层厚度的设定以容易制作以及容易固定在三维平移台上为宜，例如设定为大于或等于Imm,优选大于或等于5mm,更优选大于或等于IOmm,所述厚层不覆盖到离微流出口Xmm的范围内，X的大小以厚层不影响到微流层的液体分配为宜，例如X= 1、2或5。如此设置是为了方便微流芯片在三维平移台上的固定，以及方便微流芯片的制作。由于微流层的厚度较薄，而如果采用高分子材料制备微流层的话，这样的厚度将会使得微流层非常柔软，不方便将其固定在三维平移台上，在实际操作过程中也不容易保证微流通道不形变，因此在微流芯片最外面的两个微流层外面各设置一个不包括任何微流通道的厚层，给微流层提供足够的支撑、保护，也方便将微流芯片固定到三维平移台上，以及方便制作微流芯片。而如果厚层覆盖到离微流出口太近的位置，液体样品可能沾到厚层，影响到液体操作。优选地，同一个微流层中的微流通道的出口等间距排列，微井芯片上的微井数目大于或等于4，排列成至少两行，同一行中的微井等间距排列，且同一行中相邻微井之间的距离等于微流芯片上两个相邻微流通道出口之间的距离的l/η或η倍，η为大于或等于I的正整数。这样设置是为了方便进行大通量的液体操作，通过三维平移台控制微流芯片平行于微井排列行的方向移动，或者垂直于该方向移动，可以简单、迅速地进行大通量的液体操作。而将微井芯片上的微井数目设置为大于或等于8，且任意两个相邻微井之间的距离都相等，则微井在微井芯片上形成蜂窝状的排列，微流芯片可以在多个方向上与微井芯片配套使用。优选地，为了在nL-μ L的量级上进行液体操作，设置微流通道使得其具有较小的横截面积，设置微井使其具有较小的容积。例如，微流通道的横截面积为I平方微米-2平方毫米，优选10平方微米-I平方毫米，更优选20平方微米-O. 5平方毫米；每个微井的容积为10纳升-1000纳升，优选50纳升-500纳升，更优选100纳升-300纳升。一般来说，微流芯片可以使用任何本领域常用的材料制备，例如玻璃、陶瓷、金属、聚合物材料等。然而，为了制备的便捷，由于聚合物材料具有良好的可加工性，微流芯片优选由聚合物材料构成，所述聚合物材料优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PO、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、环状聚烯烃共聚合物(CyclicOlefinCopolymers ；C0C)、聚偏二氟乙烯、聚 苯乙烯、聚砜、尼龙、苯乙烯-丙烯酸共聚物或者以上任意两种以上的混合物。微井芯片可以采用商品化的产品，例如常规的96孔板、384孔板等。也可以根据需要自行制备任意规格的微井芯片，例如可以制备30X30、50X50、nXm个孔(井)，n和m都可根据实际需要选择，制作芯片的材料很廉价，方法很简单，因此并不会增加多少成本，这是与传统的昂贵的液体操作站相比，本发明具有很大优势的方面之一。例如，可以使用氢氟酸在玻璃基片上侵蚀出若干个凹坑，这些凹坑便构成微井。然而用这种方法制备出来的微井芯片有一个缺点，就是微井的底部不平，会影响到细胞的生长和观察，因此，优选的方式是微井芯片由透明、平整的基底和附着在基底上的微环构成，所述微环及其包围起来的区域形成所述微井。选择透明基底是为了便于从下方穿过芯片观测细胞生长的状况，玻璃片便是一个很好的选择。具有这样结构的微井芯片，其微井底部是平的，有利于细胞的生长。进一步优选地，基底由亲水材料构成，而微环由疏水材料构成，这样设定除了具有上述的使得对液体的操作变得容易、不会造成液体样品的交叉污染等优点外，即使往微井中加入过多的细胞培养溶液，液体也会在疏水的微环的限制下不溢出。该微井芯片中的微井可以由两种方式形成1.在基底上旋涂一层疏水感光材料，将其刻蚀成微井的形状；2.在基底上旋涂一层疏水感光材料，将其刻蚀成微环的形状。将疏水感光材料刻蚀成微井时，如果疏水感光材料和基底热膨胀系数不同，由于各微井相连，加热后微井芯片会弯曲。因此优选将疏水感光材料刻蚀成微环的形状，每个微环相互独立，即使疏水感光材料和基底的加热后的膨胀系数不同，也不会出现微井芯片弯曲的情况。优选地，上述微环与基底之间形成一个薄层，所述薄层的材料与微环的材料相同，微环通过该薄层附着在基底上，所述薄层只覆盖在微环外部的基底表面上，所述薄层的厚度为5 μ m-60 μ m,优选10 μ m-30 μ m。这是由于用微环围成微井时，由于微环与基底接触面积小，在液体中浸泡时间太长容易脱落。为解决这个问题，可以在微环和基底之间制作一个薄层，薄层与微环使用同样的材料制作，所以二者贴合紧密；薄层与基底接触面积大，所以不容易脱落；薄层不容易和基底产生大热膨胀系数差别。由于薄层使用的是与微环相同的疏水材料，因此薄层不应该覆盖到微井内部的基底表面，以露出亲水的基底。液体驱动装置并不用特别地限定，常用的各种结构的泵都可以使用。例如可以是蠕动泵、注射器泵、活塞泵、真空泵或压缩空气泵中的一种或多种。本发明优选的实施方式中使用蠕动泵，将一段预先充满了液体的柔软管道与微流通道的入口相连，控制蠕动泵以一定的速度挤压该管道便可以将液体注入到微流通道中，或者将微流通道中的液体导出。可按如下的方法使用本发明的细胞培养装置对液体进行更换。通过三维平移台移动微流芯片，使其中的一个微流通道组位于某一个微井上方，调整微流芯片和微井芯片的相对位置，让微流通道组的所有微流出口与微井内液体接触，使用液体驱动装置驱动其中一条或多条微流通道从微井中导出液体，同时或延迟一定时间使用另外的液体驱动装置驱动其他微流通道中的一条或多条往微井中注入液体。优选地，设置导出液体的速度和注入液体的速度相同。优选地，一次操作更换的液体少于微井中液体总量的50%，优选少于30%，更优选少于10%，每次操作更换的液体量越少，则对细胞造成的损害越小，经过多次这样的重复操作，便可以将微井中的液体全部更换一遍。当导出液体后延迟一定时间再注入液体时，该时间可以设定为短于O. 5s，优选短于O. ls，更优选短于O. Ols0当微井中的液体比较多时，延迟一定时间再注入新的液体可以防止液体太多而溢出。
图I细胞培养装置示意图。进行液体操作时微流芯片和微井芯片分别竖直和水平放置。
图2(a)微流芯片示意图。(b)微流芯片侧视图。(C)微流芯片出口处放大图。(d)微流芯片出口处仰视图。图3(a)微井芯片结构图。微井由制作在基底上的微环围成。(b)具有薄层的微井芯片结构图。该微井芯片共有三层，由下至上依次为玻璃基底层、薄层和微环层，在此薄层和微环都由SU_8制备。图4用染料展示样品分配及替换过程。(a)-(d)为微流芯片的两个微流通道分别向微井芯片中的两个微井加入300纳升的红色染料和黄色染料的过程。(e)-(h)为最左侧微井中的红色染料被替换成黄色染料，最右侧微井中黄色染料被替换成红色染料的过程。图5用PBS替换微井中的荧光素，第1、2、3行每个换液循环分别更换微井中液体的20^^50^^80%,经过4个循环后微井中荧光素的残余量分别为第4个循环后微井中荧光素的残余量变化不显著。图6使用3种参数每4小时对微井中培养液进行一次更换，3种参数中每个换液循环替换掉的样品量分别为微井中液体量的20 %、50 %、80 %。(a) - (d)为播种细胞4小时后微井中细胞的图片。24小时后，每个循环替换掉的样品量分别为微井中液体量的20%、50%的微井中细胞状态良好，分别如图(e)、(f)所示。当初始细胞状态良好时，24小时后每个循环替换掉的样品量为微井中液体量80%的微井中细胞状态良好，如图(g);而当初始细胞状态不好时，24小时后用此参数换液的微井中中间部分细胞死亡并在换液过程中被带走，如图(h)。图7(a)-(c)为分别为细胞在微井中培养8、16、24小时后的情形。每8小时换液一次。细胞播种后培养48小时，分别用CalceinAM及EthD-I对活细胞和死细胞进行染色的结果如图(d)所示。图8细胞传代。将(a)图所示的微井中的细胞传到(C)图所示的两个微井中。传代后原微井如图(b)所示。8小时后观察，传到新微井中的细胞能够正常贴壁生长，如图(d)所示。图9转染带GFP的质粒后24小时微井中细胞的明场(a)及荧光图片(b)。
具体实施例方式以下举例说明微流芯片和微井芯片的制备方法，下面的实例中使用较简便的光刻胶SU-8以及PDMS制备，但并不表示微流芯片和微井芯片只能由这样的方法制备，任何本领域现有的技术都可以用来制备具有本发明结构的微流芯片和微井芯片。微流芯片的制备准备两块3寸硅片，对其表面进行清洗并烘干。在硅片上旋涂上一层约100微米的SU-8光刻胶。将硅片在65°C烘烤8分钟，95°C烘烤10分钟。准备一块具有微流通道图案的镂空的遮光板，在遮光板的遮挡下对SU-8用强度为300毫焦/平方厘米、中心波长为365纳米的紫外光进行照射，然后将硅片在65°C烘烤8分钟，95°C烘烤10分钟，用显影剂显影，最后将硅片在150°C烘烤3小时使SU-8充分交联。用同样方法制得两块相同图案的微流芯片模板。室温下，将两块模板及三块空白硅片在三甲基氯硅烷的蒸汽中处理5分钟。在两块模板及一块硅片上面分别旋涂200微米、200微米和40微米厚的未固化的PDMS，两块模板和硅片上旋涂的PDMS的预聚体和交联剂的质量比分别为5 1,20 : I和15 : 1，放平后在80°C烘烤12分钟固化PDMS制得第一微流层、第二微流层及两个微流层的间隔层。向 另两片空白硅片上倒预聚体和交联剂质量比为15 I的PDMS各15克，除泡后在80°C烘烤15分钟固化PDMS制得厚层。将两个厚层切成与微流层相适应的形状(即不覆盖微流层微流出口 2毫米以内的部分)，分别与两个微流层没有微流通道的一面相贴合，在80°C烘烤30分钟使厚层与微流层键合，制得对称的微流芯片上层和微流芯片下层。将微流芯片上层从模板上揭下来，在预定位置打孔形成一个微流层中的微流入口，再将微流芯片上层具有微流通道的一面与间隔层贴合在一起，在80°C烘烤30分钟使微流芯片上层和间隔层键合，将此键合层从空白硅片上揭下来，在预定位置打孔形成另一个微流层中的微流入口。最后将此键合层间隔层的一面与微流芯片下层具有微流通道的一面相贴合，在80°C烘烤过夜使PDMS充分聚合。将制得的微流芯片切开，形成微流出口，再在微流通道的出口位置剪去多余的PDMS以形成楔形的微流出口。微井芯片的制备准备一块长60晕米，宽45晕米,厚O. 17晕米的玻璃片，对其表面进行清洗并烘干。在玻璃上旋涂上一层约100微米的SU-8光刻胶。放平后将SU-8从40°C以10°C /小时的速度升温至95°C，在室温下冷却。准备一块具有微环图案的镂空的遮光板，在遮光板的遮挡下对SU-8用强度为300毫焦/平方厘米、中心波长为365纳米的紫外光进行照射，然后将SU-8从40°C以10°C/小时的速度升温至95°C，在室温下冷却。用显影剂显影，最后将玻璃片在150°C烘烤3小时以使SU-8充分交联，从而得到微井芯片。具有薄层的微井芯片的制备方法准备一块长60晕米，宽45晕米,厚O. 17晕米的玻璃片，对其表面进行清洗并烘干。在玻璃上旋涂上一层约10微米的SU-8光刻胶。将旋涂了光刻胶的玻璃片在65°C烘烤3分钟，95°C烘烤5分钟。准备一块具有微井图案的镂空的遮光板，在遮光板的遮挡下对SU-8用强度为300毫焦/平方厘米、中心波长为365纳米的紫外光进行照射。将玻璃片在65°C烘烤3分钟，95°C烘烤5分钟。在室温下冷却后用显影剂显影，之后将玻璃片在150°C烘烤3小时以使SU-8充分交联，制得薄层。在室温下冷却后在玻璃上旋涂上一层约100微米的SU-8光刻胶。放平后将SU-8从40°C以10°C /小时的速度升温至95°C，在室温下冷却。准备一块具有微环图案的镂空的遮光板，将遮光板上的微环图案与SU-8上已有的微井图案对齐，在遮光板的遮挡下对SU-8用强度为300毫焦/平方厘米、中心波长为365纳米的紫外光进行照射。将SU-8从40°C以10°C /小时的速度升温至95°C，在室温下冷却。用显影剂显影，最后将玻璃片在150°C烘烤3小时以使SU-8充分交联，从而得到微井芯片。实施例I本实施例用染料实验说明本发明提供的细胞培养装置可以实现样品的分配和替换。使用的微流芯片和微井芯片结构如图I所示。样品分配在三维平移台的控制下，微流芯片的出口移动到微井上方一定高度，此高度与要分配的液滴的大小相适应。在蠕动泵的驱动下，微流通道出口处生成一定大小的液滴，液滴接触并浸润到微井的内表面，微流芯片上移，液滴便留在了微井里。图4(a)_(d)展示了微流芯片的两个微流通道分别向微井芯片中的两个微井加入300纳升的红色染料和黄色染料的过程。 样品替换当微流芯片移动到一个微井之上一定高度时，在蠕动泵的驱动下，微井中的一部分液体经微流通道被导出。接着在另一蠕动泵的驱动下，等量新液体经与导出液体的微流通道配对工作(即同一微流通道组的另一个微流通道)的微流通道进入微井。这个导出一部分液体再导入一部分液体的过程称为一个循环，此循环重复多次，微井中原有的液体就会被新液体取代。图4(e)_(h)展示了图中最左侧微井中的红色染料被替换成黄色染料，最右侧微井中黄色染料被替换成红色染料的过程。实施例2本实施例用染料实验说明本发明提供的细胞培养装置可以高效地实现样品替换。用磷酸缓冲液(PBS)替换微井中的荧光素。当每个循环替换掉的荧光素分别为微井中原有荧光素的20%、50%、80%时，经过4个循环后微井中荧光素的残余量分别为20%、15%、5%，如图5所示。第4个循环后微井中荧光素的残余量变化不显著，这是因为样品扩散速度有限，一定循环数之后导出的液体大多是新加入的液体而不是微井中原有的液体。实施例3本实施例来说明不同单个循环样品替换量对细胞生长影响不大。培养CHO细胞24小时，期间每4小时更换培养液一次。使用3种参数进行培养液更换，3种参数中每个循环替换掉的样品量分别为微井中液体量的20%、50%、80%。24小时后，每个循环替换掉的样品量分别为微井中液体量的20%、50%的微井中细胞状态良好。当初始细胞状态良好时，24小时后每个循环替换掉的样品量为微井中液体量80%的微井中细胞状态良好；而当初始细胞状态不好时，24小时后用此参数换液的微井中间部分细胞死亡并在换液过程中被带走。如图6。据此，后面实施例中所述微井的样品替换过程中每个循环替换掉的样品量均为微井中液体量的50%。实施例4本实施例用来说明本发明提供的细胞培养装置可以进行细胞播种。通过微流通道向微井中加入150 μ g/mL的纤维粘连蛋白300纳升以使玻璃基底更有利于细胞贴附。孵育I小时后通过微流通道导出微井中的纤维粘连蛋白300纳升，通过与其配对工作(即属于同一微流通道组的另一个微流通道)的微流通道向微井加入PBS 300纳升进行两次清洗，再将PBS导出并将微井芯片晾干。消化培养瓶中的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并将细胞悬液的浓度调整至7 X IO5个细胞/mL，用4个微流通道同时将300纳升细胞悬液加入4个微井，一个微井中约获得200个细胞。一次播种完成后，微流芯片在平移台控制下移动到下一组微井，依照此过程完成96个微井中的细胞的播种。对每个微井中细胞计数，细胞数目的变差系数(C. V.)为20%。实施例5本实施例用来说明本发明提供的细胞培养装置可以进行细胞换液和长期培养。播种CHO细胞后，将微井芯片放入培养皿，培养皿中微井芯片周围加培养液以减少微井芯片中的细胞悬液液滴蒸发，拿到细胞培养箱中进行培养。 通过4个微流通道导出微井中原有培养液150纳升，再通过与其配对工作(即属于同一微流通道组的微流通道)的4个微流通道加入新培养液150纳升，此过程循环4次，一次换液完成，微流芯片移动到下一组微井。每8小时依上述过程更换一次培养液，细胞有明显增殖。培养48小时后用含
10μ mo I/L的Calcein AM及2 μ g/mL的EthD-I的培养液替换微井中原有培养液，孵育20分钟后用显微镜观察，活细胞被Calcein AM染色，发绿光，死细胞被EthD-I染色，发红光。如图7。实施例6本实施例用来说明本发明提供的细胞培养装置可以同时将4个微井中的细胞传到另外8个微井中。进行传代操作前，依照实施例3中描述的过程向欲传入细胞的微井中加入纤维粘连蛋白并进行孵育及冲洗。依照实施例4中描述的换液过程用PBS替换4个微井中的培养液，再用胰酶替换微井中PBS。将微井芯片放入培养箱中孵育2分钟进行胰酶消化。导出250纳升胰酶，力口入250培养液。重复此过程一次。在蠕动泵的驱动下，通过微流通道导出微井中含细胞的培养液300纳升，导出后蠕动泵立即停止，使这部分液体存留在微流通道中，蠕动泵反向转动，存留的液体通过相同微流通道导出，导出后蠕动泵立即停止，以避免导入气泡。此过程重复3次，微井中经过消化的细胞被吹打下来。之后通过微流通道将微井中的液体导出，存留在微流通道中，微流芯片在平移台控制下移至目标微井上方，在蠕动泵驱动下将微流通道中存留的液体平均分配到两个微井中，再通过与上述微流通道配对工作(即同一微流通道组的另一个微流通道)的微流通道向两个微井中加入150纳升培养液。被传到新的微井中的细胞可正常贴壁生长，如图8。实施例7本实施例用来说明本发明提供的细胞培养装置可以进行细胞转染。配制含转染混合物的培养液将2 μ L Lipofectamine 2000加入50 μ LOpti-ΜΕΜ,孵育5分钟;将O. 5 μ g带GFP质粒加入50 μ L Opti-MEM0将二者混合，孵育20分钟。加入不含抗体的培养液200 μ L，制得转染混合物。依照实施例4中描述的换液过程用转染混合物替换微井中培养液。将微井芯片放入培养箱。5小时后用培养液替换微井中的转染混合物。将微井芯片放回培养箱中培养24小时，其间每8小时换液一次。在荧光显微镜下观察，转染效率约为30%，如图9所示。
实施例8本实施例用来说明本发明提供的细胞培养装置可以进行细胞固定染色并对细胞增殖进行检测。依照实施例5中描述的过程培养细胞24小时，不同的是播种细胞8小时后使用的培养液含10 μ mol/L的5-乙炔_2’_脱氧尿苷(Click-iT EdU成像试剂盒，Invitrogen,,货号C10337)。依照实施例4中 描述的换液过程用3. 7%的甲醛PBS溶液替换微井中培养液，孵育15分钟，对细胞进行固定；之后用3%牛血清蛋白(BSA)的PBS溶液替换甲醛PBS溶液溶液两次；再用O. 5%Triton X-100的PBS溶液替换BSA，孵育20分钟，对细胞打孔。用3% BSA的PBS溶液替换Triton的PBS溶液两次。配制Click-iT反应混合物(Click- iT EdU成像试剂盒)，用此混合物替换BSA，孵育30分钟。在蓝光照射下，增殖出的细胞核有绿色荧光。
权利要求
1.一种细胞培养装置，包括微井芯片、三维平移台以及至少一块微流芯片，其特征在于所述微流芯片包括至少一个微流层，每个微流层中具有至少一条微流通道并且微流芯片具有的微流通道的总数大于或等于2，所述微流通道在微流芯片上具有两个开口，其中一个开口作为微流入口，另外一个开口为微流出口，且除入口、出口外，微流通道的其他部分都在微流层内部；至少两条微流通道的出口之间的距离小于微井芯片上一个微井的尺寸，上述至少两条微流通道构成一个微流通道组，所述微流通道组中至少有一条微流通道中液体的流动方向与其他微流通道中液体的流动方向相反；每一个微流通道的入口都与一台液体驱动装置相连，通过所述液体驱动装置驱动液体在微流通道里流动；所述微井芯片具有至少两个微井，微井的尺寸大于微流通道组中所有微流通道截面尺寸之和。
2.根据权利要求I所述的细胞培养装置，其特征在于所述微流芯片具有两个微流层，两个微流层中微流通道的数目相同，每一个微流通道都与另外一个微流层中的一个微流通道构成一个微流通道组，所有的微流通道出口都分布在微流芯片的同一个侧边上。
3.根据权利要求I或2所述的细胞培养装置，其特征在于微流层的厚度小于或等于Imm,优选小于或等于500 μ m,更优选小于或等于300 μ m。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于微流芯片的微流通道出口处向外突起为楔形，微流通道的出口位于楔形的尖端上。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于微流通道出口表面为疏水材料，微井芯片的微井内表面为亲水材料。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于微流芯片最外面的两个微流层外面各设置一个不包括任何微流通道的厚层，所述厚层厚度的设定以容易制作以及容易固定在三维平移台上为宜，例如设定为大于或等于1mm，优选大于或等于5mm，更优选大于或等于10mm，所述厚层不覆盖到离微流出口 Xmm的范围内，X的大小以厚层不影响到微流层的液体分配为宜，例如X = 1、2或5。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于同一个微流层中的微流通道的出口等间距排列，微井芯片上的微井数目大于或等于4，排列成至少两行，同一行中的微井等间距排列，且同一行中相邻微井之间的距离等于微流芯片上两个相邻微流通道出口之间的距离的l/η或η倍，η为大于或等于I的正整数。
8.根据权利要求7所述的细胞培养装置，其特征在于微井芯片上的微井数目大于或等于8，且任意两个相邻微井之间的距离都相等。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于微流通道的横截面积为I平方微米-2平方毫米，优选10平方微米-I平方毫米，更优选20平方微米-O. 5平方毫米；每个微井的容积为10纳升-1000纳升，优选50纳升-500纳升，更优选100纳升-300纳升。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于微流芯片由聚合物材料构成，所述聚合物材料优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、环状聚烯烃共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers ;C0C)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龙、苯乙烯-丙烯酸共聚物或者以上任意两种以上的混合物。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于微井芯片表面向下凹陷而形成所述微井。
12.根据权利要求1-10的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于微井芯片由透明、平整的基底和附着在基底上的微环构成，所述微环及其包围起来的区域形成所述微井。
13.根据权利要求12所述的细胞培养装置，其特征在于基底由亲水材料构成，而微环由疏水材料构成。
14.根据权利要求13所述的细胞培养装置，其特征在于所述微环与基底之间形成一个薄层，所述薄层的材料与微环 的材料相同，微环通过该薄层附着在基底上，所述薄层只覆盖在微环外部的基底表面上，所述薄层的厚度为5 μ m-60 μ m,优选10 μ m_30 μ m。
15.根据权利要求1-14的任一项所述的细胞培养装置，其特征在于所述液体驱动装置选自蠕动泵、注射器泵、活塞泵、真空泵或压缩空气泵中的一种或多种。
16.权利要求1-15的任一项所述的细胞培养装置在细胞播种、细胞换液、细胞传代、细胞转染或细胞固定染色中的应用。
17.使用权利要求1-15的任一项所述的细胞培养装置进行更换液体的方法，其特征在于通过操作三维平移台使微流芯片的至少一个微流通道组位于微井上方，使微流通道组的所有微流出口与微井内液体接触，用液体驱动装置驱动其中一条或多条微流通道从微井中导出液体，同时或延迟一定时间使用另外的液体驱动装置驱动其他微流通道中的一条或多条往微井中注入液体。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于导出液体的速度和注入液体的速度相同。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于一次操作更换的液体少于微井中液体总量的50%，优选少于30%，更优选少于10%。
20.根据权利要求17-19的任一项所述的方法，其特征在于注入液体的操作比导出液体的操作延迟时间短于O. 5s，优选短于O. ls，更优选短于O. Ols0
全文摘要
本发明涉及一种细胞培养装置，包括微井芯片、三维操作平移台以及至少一块微流芯片，微流芯片包括至少一个微流层，每个微流层中具有至少一条微流通道并且微流芯片具有的微流通道的总数大于或等于2，至少两条微流通道的出口之间的距离小于微井芯片上一个微井的尺寸，上述至少两条微流通道构成一个微流通道组，所述微流通道组中至少有一条微流通道中液体的流动方向与其他微流通道中液体的流动方向相反；每一个微流通道的入口都与一台液体驱动装置相连，通过所述液体驱动装置驱动液体在微流通道里流动。采用本发明的细胞培养装置可以实现高通量、自动化的细胞培养操作。
文档编号C12M3/00GK102719359SQ201110079248
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者周莹, 庞玉宏, 黄岩谊 申请人:北京大学