专利名称：烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域中的病毒检测方法，特别是涉及一种烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的半巢式RT-PCR检测方法。
背景技术：
甘薯裡绿矮化病毒(S^eetpotato chlorotic stunt virus，SPCSV)属于长线形病毒科{Closteroviridae)毛形病毒属iCrinivirus)成员。该病毒的基因组为双组份单链正义RNA，基因组大小为17.6 kbp左右。根据血清学关系和核苷酸序列，SPCSV可划分为东非(EA)和西非(WA)两个株系。上世纪70年代首先在非洲发现了 SPCSV，目前主要分布在非洲和南美一些国家。我国自2010年首次发现SPCSV以来，目前在全国多个甘薯种植区陆续检测到该病毒病的存在。SPCSV是危害甘薯的主要病毒之一，特别重要的是，SPCSV 可与马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害 SPVD (sweet potato virus disease, SPVD)。SPVD是甘薯上是最严重的病毒病害之一，通常可使甘薯减产50%-98%，甚至绝收。SPCSV是SPVD的主要病原之一，主要由烟粉虱(Bemisa babaci)以半持久方式传播，感染SPCSV的甘薯通常会迅速形成SPVD，SPVD的流行跟烟粉虱的数量密切相关。SPCSV 的长距离传播主要通过种薯和种苗，短距离主要通过烟粉虱进行传播。烟粉虱生存能力强、 繁殖速度快。据报道，烟粉虱经过48h的饲毒就能进行有效传染，而且烟粉虱的数量越大， 病毒传播的有效性越强。由于对SPCSV尚无特别有效的防治方法，做好烟粉虱带毒率的检测，加强对烟粉虱的防治，可有效减少SPCSV的蔓延扩散，减少病害引起的损失。因此，建立一种简便、快速、灵敏的检测烟粉虱中SPCSV的方法，对于该病的预警和防治具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种简便、快速、灵敏的半巢式RT-PCR检测烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的方法。本发明的技术方案
一种烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的检测方法，包括以下步骤
(O分别设计合成SPCSV病毒的3条引物
CSV70P1: 5' -GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3'，
CSV70P2: 5' -GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3'，
CSV70P3: 5' -TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3'，
其中K为G或T，R为A或G，Y为C或T，HSA、T*C;
(2)用解剖针挑取烟粉虱，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；
(3)以反转录产物作为模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2进行半巢式RT-PCR的第一轮扩增，预期扩增片段大小为431bp ;利用引物CSV70P1和CSV70P3进行半巢式RT-PCR的第二轮扩增，预期扩增片段大小为170bp ；
(4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。所述反转录的反应体系为10μ1，包括4 μ RNA模板，2μ1 5XRT buffer，0. 5μ 浓度为 10 MmoI/L 的 CSV70P2，I PL 浓度为 10 mmol/L 的 dNTPs，0. 25 PL 浓度为 40υ/μ1 的 RNase抑制剂和O. 5 μ 浓度为5υ/μ1的AMV反转录酶，余量为DEPC_H20。反应程序为42°C 反转录40min,99°C 5min, 5°C 5min,反应后得到反转录产物。所述半巢式RT-PCR的第一轮扩增的反应体系为25μ1，包括2. 5μ 10 X PCR buffer, Iμ 浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTPs，浓度为 10 MmoI/L 的 CSV70P1 和 CSV70P2 各 O. 5 μ , O. 2μ 浓度为5U/^L的Taq酶，2. 5μ1反转录产物作模板，余量为ddH20 ;扩增的反应程序为94°C预变性2min，94°C变性30s，54°C退火30s，72 °C延伸45s，完成35个循环，最后72°C 延伸IOmin0所述半巢式RT-PCR的第二轮扩增是将第一轮RT-PCR的扩增产物稀释20倍，取 WL稀释产物作为第二轮PCR扩增的模板，第二轮PCR扩增反应体系为25μ1，包括2.5 PLIOXPCR buffer, μ 浓度为 2· 5 mmol/L 的 dNTPs，浓度为 10 MmoI/L 的 CSV70P1 和 CSV70P3各O. 5 μ , O. 2μ 浓度为5U/^L的Taq酶，用ddH20补足至25 μ 。第二轮扩增的反应程序为94°C预变性2min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，完成32个循环， 最后72°C延伸IOmin0所述的方法在检测单头或多头烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的应用。 本发明的积极有益效果
(I)本发明的半巢式RT-PCR检测方法能对单头或多头带毒的烟粉虱进行检测，阳性率为100%，表明该方法能稳定地检测出单头或多头烟粉虱中的SPCSV，而RT-PCR方法只能检测出3头以上烟粉虱中的SPCSV，说明半巢式RT-PCR检测方法效率更高。(2)本发明的检测方法和RT-PCR检测SPCSV的灵敏性比较看出，RT-PCR可检测出 SPCSV时的CRNA最低浓度为5. 69 X IO4拷贝/μ ，半巢式RT-PCR检测出SPCSV时的cRNA最低浓度为5. 69X IO1拷贝/>L，表明半巢式RT-PCR的检测灵敏度比RT-PCR高1000倍。说明本发明的检测方法检测精度更高。(3)本发明的检测方法简便，能快速、灵敏地检测单头或多头烟粉虱中的甘薯褪绿矮化病毒，实现对烟粉虱带毒情况的有效监测，对加强烟粉虱的防治和减少该病毒的蔓延扩散具有重要意义。
图I :RT_PCR检测烟粉虱中SPCSV的扩增结果；
图中M :DL2000 marker ;1_5分别表示10头、5头、3头、2头和单头带毒烟粉虱；6_8 :分别为无毒烟粉虱、健康甘薯和SPCSV #5^70重组质粒。图2 :本发明的半巢式RT-PCR检测烟粉虱中SPCSV的扩增结果；
图中M DL2000 marker ;1、3、5、7、9分别为单头、2头、3头、无毒烟粉虱和甘薯试管苗的
4第一轮RT-PCR产物；2、4、6、8、10分别为单头、2头、3头烟粉虱、无毒烟粉虱和甘薯试管苗的第二轮PCR产物；11、12分别为SPCSV重组质粒的第一轮、第二轮PCR产物。图3 =RT-PCR检测SPCSV的灵敏性的扩增结果；
图中 M DL2000 marker ;1_7 :分别为 10 倍梯度稀释的 5. 69X 107_5· 69X IO1 拷贝 /μ 体外反转录RNA。图4 :本发明的半巢式RT-PCR检测SPCSV灵敏性的扩增结果；
图中 M DL2000 marker ；1~7 :分别为 10 倍梯度稀释的 5. 69X 107_5· 69X IO1 拷贝 /μ 体外反转录RNA。
具体实施例方式实施例I :烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的检测方法及其应用 I材料与方法
I. I供试毒源和烟粉虱
将感染SPCSV的甘薯植株种植于防虫温室内用于饲养烟粉虱，将饲养3d以上的烟粉虱视为带毒烟粉虱，将从大田棉花上捕捉的烟粉虱用健康的白菜饲养两周后作为阴性对照。 收集带毒烟粉虱和健康烟粉虱用液氮速冻后，置于_70°C保存备用。将经过NCM-ELISA和 RT-PCR检测SPCSV为阴性的甘薯茎尖培养试管苗作为甘薯阴性对照。1.2试剂及试剂盒
UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒为上海生工生物工程公司产品；UNIQ_10柱式DNA胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术公司；RNase抑制剂、AMV反转录酶、DNA聚合酶、 PMD19-T载体、T7 RNA Polymerase购自TaKaRa公司，其它常用试剂为国产分析纯。I. 3引物设计
根据GenBank中已登录的SPCSV也/770基因的核苷酸序列设计三条引物
CSV70P1: 5' -GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3'，
CSV70P2: 5' -GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3'，
CSV70P3: 5' -TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3'，
其中 K 为 G 或 T，R 为 A 或 G，Y 为 C或 T，H*A、T*C ；CSV70P1 和 CSV70P2 用作半巢式RT-PCR的第一轮扩增，预期扩增片段大小为431bp ；CSV70P1和CSV70P3用作半巢式 RT-PCR的第二轮扩增引物，预期扩增片段大小为170bp。引物由上海生工生物工程公司合成。
I. 4 RT-PCR检测烟粉虱中的SPCSV
用解剖针挑取单头烟粉虱放入加有30μ 预冷的RNA提取液的I. 5ml离心管中(RNA提取液的成分为20 mmol/L的碳酸铵，2%的SDS，2mmol/L EDTA, 200 μ g/ ml的皂土，其中所用碳酸铵母液的PH值为9. 0)，用DEPC处理过的研磨棒充分研磨，再用170μ 的抽提液冲洗研磨棒，然后按照UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明书，提取烟粉虱体内总RNA。利用RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR。反转录体系为10μ1，包括4 μ RNA模板，2μ1 5XRT buffer，。· 5μ CSV70P2 (10 Mmol/L),I μ dNTPs (10 mmol/L),0. 25 μ RNase抑制剂(40 U/^L)和0. 5 μ AMV反转录酶(5υ/μ1)，用DEPC-H2O补足至10μ 。反转录的反应程序为421^反转录40 min,99°C 5 min, 5°C 5 min,反应后得到反转录产物。
PCR 反应体系为2. 5μ1 反转录产物作模板，2. 5 μ 10XPCR buffer, I μ dNTPs (2.5 mmol/L),O. 5 μ CSV70P1 (10 Mmol/L)和 0· 5 μ CSV70P2 (10 Mmol/L)，O. 2μ Taq 酶(5 U/μυ，用 ddH20 补足至 25 μ 0PCR扩增反应条件94°C预变性2 min，94°C变性30 s，54°C退火30 s，72°C延伸 45s，完成35个循环，最后72°C延伸10 min。用I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测时上样量为8μ1，100V稳压电泳30 min, EB染色，经UVP凝胶成像系统观察和照相。I. 5半巢式RT-PCR检测烟粉虱中的SPCSV
取4 PL按1.4中方法提取的烟粉虱总1 ^作为模板，利用引物05￥70 1和05￥70 2 进行半巢式RT-PCR的第一轮扩增，预期扩增片段大小为431bp。具体步骤为
利用RT-PCR试剂盒进行反转录。反转录体系为10μ1，包括4 μ RNA模板，2μ1 5XRT buffer，。· 5μ CSV70P2C10 Mmol/L), I μ dNTPs(10 mmol/L),0. 25 μ RNase 抑制剂(40 U/ μυ和0. 5 μ AMV反转录酶(5υ/μ1)，用DEPC-H2O补足至10μ 。反转录的反应程序为 42°C反转录40 min, 99°C 5 min, 5°C 5 min,反应后得到反转录产物。PCR 反应体系为2. 5μ1 反转录产物作模板，2. 5 μ 10XPCR buffer, I μ dNTPs (2.5 mmol/L),0. 5 μ CSV70P1 (10 Mmol/L)和 0· 5 μ CSV70P2 (10 Mmol/L)，O. 2μ Taq 酶(5 U/μυ，用ddH20补足至25 μ 。PCR扩增反应条件为:94°C预变性2 min，94°C变性30 s，54°C退火30 s，72°C延伸45s，完成35个循环，最后72°C延伸10 min。将扩增产物稀释20倍后，取I PL的稀释产物作为第二轮PCR扩增模板，第二轮 PCR 扩增体系为2.5 μ 10XPCR buffer, I μ dNTPs(2. 5 mmol/L), 0. 5 μ CSV70P1C10 Mmol/L)和 0.5 μ CSV70P3 (10 Mmol/L)，O. 2μ Taq 酶(5 U/^L)，用 ddH20 补足至 25μ 。半巢式RT-PCR的第二轮扩增的反应程序为94°C预变性2min，94°C变性30s，56°C 退火30s，72。。延伸30s，完成32个循环，最后72°C延伸IOmin0PCR产物的电泳、染色及成像同I. 4。即用I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测时上样量为8μ1，100V稳压电泳30 min, EB染色，经UVP凝胶成像系统观察和照相。I. 6 RT-PCR和半巢式RT-PCR产物的克隆和序列测定
将部分RT-PCR和半巢式RT-PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST软件对所测序列进行比较分析。 1.7 RT-PCR和半巢式RT-PCR检测SPCSV的灵敏性比较
按照T7 RNA Polymerase说明书进行RNA体外转录。在上游引物CSV70P1的5端引入T7启动子序列，以SPCSV基因的重组质粒为模板，进行PCR扩增，扩增的双链DNA
片段(454bp)在T7 RNA聚合酶的作用下经体外转录形成单链RNA(cRNA)，纯化后用核酸测定仪测得cRNA浓度为148. lng/^L，根据阿伏伽德罗常数将浓度换算为5. 69 X IO11拷贝/ PL[cRNA 含量(拷贝 /μ =6. 02Χ IO23X 148. I X 1(Γ9/(454X 345)=5. 69 X IO11 拷贝 /^L]。 将该cRNA浓度用DEPC-H2O按10倍梯度稀释成5. 69X 1010-5. 69 X IO1拷贝/μ ，分别取浓度为5. 69 X 107-5. 69 X IO1拷贝/μ 的7个浓度梯度的RNA作为检测模板，分别按照I. 4和
1.5的方法进行RT-PCR和半巢式RT-PCR的检测，比较二者的灵敏性。 2结果与分析2.I RT-PCR检测烟粉虱体内SPCSV的稳定性
以提取的烟粉虱总RNA为模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2进行RT-PCR扩增。结果表明，从10、5、3、2和单头带毒烟粉虱中均能扩增出一条与预期大小一致的特异性条带，而从无毒烟粉虱和脱毒甘薯试管苗均中未能扩增出相应的条带(见图I)。为了检验RT-PCR检测带毒烟粉虱的稳定性，分别对单头、2头和3头带毒烟粉虱各进行10次RT-PCR重复试验，发现单头烟粉虱中SPCSV的检出率是40%，2头检出率为60%， 3头的检出率为100%。说明利用RT-PCR方法只能稳定检测出3头烟粉虱中的SPCSV，而不能稳定检测出单头烟粉虱中的SPCSV。2. 2半巢式RT-PCR检测烟粉虱体内SPCSV的稳定性
采用半巢式RT-PCR分别对单头、2头、3头带毒烟粉虱中SPCSV的带毒情况进行检测。 结果显示，半巢式RT-PCR从单头、2头和3头带毒烟粉虱体内均能扩增出目的条带，而不能从无毒烟粉虱和脱毒甘薯试管苗中扩增出相应条带(见图2 )。对单头带毒烟粉虱进行10次半巢式RT-PCR重复检测，阳性率为100%。说明利用半巢式RT-PCR方法能稳定地检测出单头烟粉虱中的SPCSV。2. 3 RT-PCR和半巢式RT-PCR两种检测方法的扩增产物的序列测定
为了进一步验证RT-PCR和半巢式RT-PCR扩增出的片段为目的病毒的核酸序列，对部分扩增产物进行克隆和序列测定。将部分利用RT-PCR和半巢式RT-PCR从烟粉虱中扩增出的特异性片段克隆到PMD19-T载体上进行序列测定。结果表明，所克隆片段的核苷酸序列与SPCSV WA株系的相似性为97. 6%-100%，说明两种方法所扩增出的片段均为SPCSV的特异性片段。2. 4 RT-PCR和半巢式RT-PCR方法检测SPCSV的灵敏性比较
以制备的SPCSV的CRNA作为模板，进行RT-PCR检测。结果表明，RT-PCR可检测的cRNA 最低浓度为5. 69X IO4拷贝/μ (见图3)。以第一轮RT-PCR的扩增产物为模板，进行半巢式RT-PCR扩增，结果半巢式RT-PCR最低能从浓度为5. 69 X IO1拷贝/μ 的cRNA中检测出 SPCSV (见图4)，表明建立的半巢式RT-PCR的检测灵敏度比RT-PCR高1000倍。
权利要求
1.一种烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(O分别设计合成SPCSV病毒的3条引物CSV70P1: 5' -GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3'，CSV70P2: 5' -GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3'，CSV70P3: 5' -TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3'，其中K为G或T，R为A或G，Y为C或T，HSA、T*C;(2)用解剖针挑取烟粉虱，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA 作为PCR模板，进行反转录；(3)以反转录产物作为模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2进行半巢式RT-PCR的第一轮扩增，预期扩增片段大小为431bp ;利用引物CSV70P1和CSV70P3进行半巢式RT-PCR的第二轮扩增，预期扩增片段大小为170bp ；(4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述反转录的反应体系为10μ1，包括4 μ RNA 模板，2μ1 5 X RT buffer，O. 5μ 浓度为 10 Mmol/L 的 CSV70P2，I PL 浓度为 10 mmol/L 的 dNTPs，0. 25 μ 浓度为 40υ/μ1 的 RNase 抑制剂和 O. 5 μ 浓度为 5υ/μ1 的 AMV反转录酶，余量为DEPC-H2O15
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述反转录的反应程序为42°C反转录40min,99°C反应5min, 5°C反应5min,反应后得到反转录产物。
4.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一轮扩增的反应体系为 25μ1，包括2. 5PL10XPCR buffer, Ιμ 浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTPs，浓度为 10 Mmol/L 的 CSV70P1 和 CSV70P2 各 O. 5 μ , O. 2μ 浓度为 5U/^L 的 Taq 酶，2. 5μ1 反转录产物作模板，余量为ddH20。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一轮扩增的反应程序为94°C预变性2min，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸45s，完成35个循环， 最后72°C延伸IOmin0
6.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二轮扩增是将第一轮RT-PCR的扩增产物稀释20倍，取WL稀释产物作为第二轮PCR扩增的模板，第二轮PCR扩增反应体系为25μ1，包括2. 5 PLIOXPCR buffer，Iμ 浓度为2. 5 mmol/L的 dNTPs，浓度为 10 Mmol/L 的 CSV70P1 和 CSV70P3 各 0. 5 μ , 0. 2μ 浓度为 5\]/μ 的 Taq 酶， 用ddH20补足至25 μ 0
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二轮扩增的反应程序为94°C预变性21^11，941变性308，561退火30s，72°C延伸30s，完成 32个循环，最后72°C延伸IOmin。
8.权利要求7所述的方法在检测单头或多头烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的应用。
全文摘要
本发明涉及一种烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的半巢式RT-PCR检测方法，包括设计合成SPCSV病毒的3条引物CSV70P1、CSV70P2、CSV70P3；用解剖针挑取烟粉虱，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；以反转录产物作为模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2进行半巢式RT-PCR的第一轮扩增，预期扩增片段大小为431bp；利用引物CSV70P1和CSV70P3进行半巢式RT-PCR的第二轮扩增，预期扩增片段大小为170bp；用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本发明方法能对单头或多头带毒的烟粉虱进行检测，阳性率为100%，能稳定地检测出单头或多头烟粉虱中的SPCSV，检测效率较高；检测出SPCSV时的cRNA最低浓度为5.69×101拷贝/μL，灵敏性较高。该方法能实现对烟粉虱带毒情况的有效监测，对加强烟粉虱的防治和病毒的蔓延扩散具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102586484SQ201210061149
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者乔奇, 张德胜, 张振臣, 张盼, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艳红 申请人:河南省农业科学院