专利名称：酿酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酿酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的应用，提供了这种缺失菌株的筛选方法，验证了它在耐糠醛方面的应用，属于生物能源技术开发技术领域。
背景技术：
随着石油资源的枯竭、石油价格的上涨和环境的恶化，人们对可替换能源和环境友好型能源需求的提高，寻找新型可再生资源替代化石资源和开发洁净能源已成为工业生物技术领域的研究热点。生物质能的开发，可以缓解对石油资源的依赖、控制二氧化碳的排放，并促进农业新型产业链的发展，对推动我国社会主义新农村建设具有重要意义。在寻找可再生资源的过程中，燃料乙醇作为一种可再生洁净能源从上世纪70年代在美国、巴西开始推行。我国乙醇的生产能力已达到500多万吨/年，其中燃料乙醇的年产量保持在110万吨左右，仅次于巴西、美国，居世界第三位。而农业作为可再生能源的提供者的作用变得越来越重要。各种来源的植物纤维素可以作为生产燃料乙醇丰富廉价的原材料。由于大量使用玉米为原料开发生物能源导致玉米价格持续增长，所以在经过了将粮食转化为乙醇的热潮之后，纤维素乙醇技术的开发和纤维素乙醇的商业化生产正渐成气候。但是，以纤维素为原料的乙醇生产过程中产生多种发酵抑制剂，这大大降低了乙醇的生产效率。其中，糠醛是重要的抑制剂之一。通过功能基因组学技术我们获得能够耐受糠醛的基因缺失菌株，为提高纤维素乙醇生产效率奠定了理论基础。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种酿酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的应用，还公开了一种大规模高效筛选耐受糠醛基因缺失菌株的方法，并得到了三个耐受糠醛的基因缺失菌株，为提高纤维素乙醇生产效率奠定了理论基础。按照本发明提供的技术方案，酿酒酵母缺失菌株KKSC1，其分类命名为 Saccharomyces cererisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012037。酿酒酵母缺失菌株KKSC2,其分类命名为cereFisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012038。酿酒酵母缺失菌株KKSC3,其分类命名为cereFisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012039。所述菌株CCTCC NO M 2012037 缺失基因 SJZ/，CCTCC NO M 2012038 缺失基因 DEPl，CCTCC NO M 2012039缺失基因SAP30。SIZl、DEPl和SAP30三个基因的缺失具有提高微生物的耐糠醛的能力；
SIZl基因核苷酸序列为SEQ NOl所示，DEPl基因核苷酸序列为SEQ N02所示，SAP30 基因核苷酸序列为SEQ N03所示。
所述酿酒酵母缺失菌株在耐糠醛方面的应用，KKSCl、KKSC2、KKSC3的耐糠醛性在
纤维素乙醇生产中的应用。从美国Invitrogen Inc公司购买同源的以BY4741为母菌株的6000个单基因缺失菌株出发，进行筛选取添加IOmM糠醛的SC固体培养基对菌株进行培养24h，选取出 sizl : ..^a/ MX4、depl: :kanWM 和 sap30 : kanWk\ 三株具有糠醒耐受性的菌株。用PCR技术扩增带有/7aiMX4遗传标记的DNA片段，将此片段纯化后转化到sizl kanWk\菌株细胞里，此DNA片段通过遗传重组的方式与.. kanWk\菌株细胞里的 na MX4遗传标记交换，在YPD+nourseothricin的平板上得到能够抗nourseothricin抗生素的菌株。再把这个菌株在YPD+G418的平板上进行划线，3(ie条件下培养2天，如果它在 YPD+G418的平板上不能生长，它就是sizl .-natWM菌株(既KKSCl菌株)。同样地,通过相同的方法,从i/e/72 : MX4菌株和知^a/ MX4菌株分别得到 depl na MX4 菌株(KKSC2 )和 sap30 na MX4 菌株(KKSC3 )。本发明具有如下优点本发明提供的三个耐受糠醛基因缺失菌株可以应用于摇瓶和发酵罐里，研究酿酒酵母菌利用含有糠醛的纤维素酸解液发酵生成乙醇的能力，为纤维素酒精工业提供高产优良基因工程菌株。此外，它们还可以用于研究酿酒酵母菌耐受糠醛的分子机理。其筛选过程规模大，效率高，筛选出的菌株切实提高了糠醛的耐受能力。生物材料样品保藏酿酒酵母缺失菌株KKSC1,其分类命名为Saccharomyces cerevisae已保藏于中国典型培养物保藏中心，该中心地址中国武汉武汉大学，保藏日期2012年2月27日，保藏编号为保藏编号CCTCC NO M 2012037。酿酒酵母缺失菌株KKSC2,其分类命名为Saccharomyces cererisae,及酿酒酵母缺失菌株KKSC3,其分类命名为Saccharomyces cerevisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心，该中心地址中国武汉武汉大学，保藏日期2012年2月27日，保藏编号为保藏编号 CCTCC NO M 2012038
酿酒酵母缺失菌株KKSC3,其分类命名为Saccharomyces cererisae,及酿酒酵母缺失菌株KKSC3,其分类命名为Saccharomyces cerevisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心， 该中心地址中国武汉武汉大学，保藏日期2012年2月27日，保藏编号为保藏编号CCTCC NOMM 2012039。
图 I 酿酒酵母缺失菌株 KKSCl (.sizl natMX4), KKSC2 {depl natMX4),MSC , i.sap30 natMX4)和野生型酿酒酵母菌株BY4741在SC和SC+10mM furfural (糠醛)平板上的生长表型。
具体实施例方式实施例I酿酒酵母缺失菌株KKSCl的耐糠醛性实验
取酿酒酵母缺失菌株KKSCl在液体YPD培养基里30°C条件下过夜培养8-12h，然后将所得培养物调至0D600 值为2. 0，得到培养物待用。YPD培养基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。取培养得到的培养物和野生型酿酒酵母菌株，以蒸馏水为溶液，分别按十倍的浓度依次将它们稀释5次，得到5个浓度依此递减的细胞稀释溶液，并分别标号备用。从KKSCl和野生型酿酒酵母菌株5个稀释后的细胞溶液样品中分别取3 μ L点接到不含或者含IOmM糠醛的SC固体培养基上，在30°C条件下平板培养48h。SC固体培养基葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮源6. 7g/L和琼脂20g/L。以不添加糠醛的平板为对照培养基，经检测可知KKSCl耐糠醛的能力明显优于野生型酿酒酵母菌株，两者对比的生长表型如图I所示。左边为没有加糠醛的对照SC培养基。每个平板上的样品从左到右均为未稀释的细胞过夜培养物及其5个依次10倍稀释的细胞溶液样品。实施例2酿酒酵母缺失菌株KKSC2的耐糠醛性实验
取酿酒酵母缺失菌株KKSC2在液体YPD培养基里30°C条件下过夜培养8_12h，然后将所得培养物调至0D600 值为2. 0，得到培养物待用。YPD培养基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。取培养得到的培养物和野生型酿酒酵母菌株，以蒸馏水为溶液，别按十倍的浓度依次将它们稀释5次，得到5个浓度依此递减的细胞稀释溶液，并分别标号备用。从KKSC2和野生型酿酒酵母菌株5个稀释后的细胞溶液样品中分别取3 μ L点接到不含或者含IOmM糠醛的SC固体培养基上，在30°C条件下平板培养48h。SC固体培养基葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮源6. 7g/L和琼脂20g/L。以不添加糠醛的细胞溶液为对照培养基，经检测可知KKSC2耐糠醛的能力明显优于野生型酿酒酵母菌株，如图I所示。实施例3酿酒酵母缺失菌株KKSC3的耐糠醛性实验
取酿酒酵母缺失菌株KKSC3在液体YPD培养基里30°C条件下过夜培养8_12h，然后将所得培养物调至0D600 值为2. 0，得到培养物待用。YPD培养基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。取培养得到的培养物和野生型酿酒酵母菌株，以蒸馏水为溶液，分别按十倍的浓度依次将它们稀释5次，得到5个浓度依此递减的细胞稀释溶液，并分别标号备用。从KKSC3和野生型酿酒酵母菌株5个稀释后的细胞溶液样品中分别取3 μ L点接到不含或者含IOmM糠醛的SC固体培养基上，在30°C条件下平板培养48h。SC固体培养基葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮源6. 7g/L和琼脂20g/L。以不添加糠醛的细胞溶液为对照培养基，经检测可知KKSC3耐糠醛的能力明显优于野生型酿酒酵母菌株，如图I所示。
权利要求
1.酿酒酵母缺失菌株KKSC1,其分类命名为cererisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012037。
2.酿酒酵母缺失菌株KKSC2,其分类命名为cererisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012038。
3.酿酒酵母缺失菌株KKSC3,其分类命名为cererisae,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012039。
4.如权利要求1、2或3所述酿酒酵母缺失菌株的基因，其特征是所述菌株CCTCCNO M 2012037 缺失基因 SJZ/，CCTCC NO M 2012038 缺失基因 CCTCC NO M 2012039 缺失基因SAP30, SIZU DEPl和SAP30三个基因的缺失具有提高微生物的耐糠醛的能力；SIZl基因核苷酸序列为SEQ NOl所示，DEPl基因核苷酸序列为SEQ N02所示，SAP30 基因核苷酸序列为SEQ N03所示。
5.权利要求1、2或3所述酿酒酵母缺失菌株在耐糠醛方面的应用，其特征是KKSC1、 KKSC2、KKSC3的耐糠醛性在纤维素乙醇生产中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种酿酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的应用，提供了这种缺失菌株的筛选方法，验证了它在耐糠醛方面的应用，属于生物能源技术开发技术领域。其提供的三个耐受糠醛基因缺失菌株可以应用于摇瓶和发酵罐里，研究酿酒酵母菌利用含有糠醛的纤维素酸解液发酵生成乙醇的能力，为纤维素酒精工业提供高产优良基因工程菌株。此外，它们还可以用于研究酿酒酵母菌耐受糠醛的分子机理。其筛选过程规模大，效率高，筛选出的菌株切实提高了糠醛的耐受能力。
文档编号C12N1/18GK102586127SQ20121006082
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者蒋伶活 申请人:江南大学