紫苏醛在制备防治阴道炎的药物中的用途的制作方法

本发明涉及紫苏醛的新用途，属于医药技术领域。

背景技术：

白色念珠菌是一种重要的条件致病菌，主要存在人体的口腔、上呼吸道、肠道以及阴道等处，既可以引起皮肤或黏膜发生病变，同时也能导致人体系统性感染。其中由白色念珠菌引起的白色念珠菌阴道炎是当今社会中比较常见的发生在广大女性中的妇科疾病，这种疾病典型的症状表现为外阴痰痒和阴道分泌物增多，通常会伴有阴道疼痛、外阴灼热、性交困难和尿痛等症状，这种疾病可以由性交传染，大约70％的处在生育年龄的女性都患过至少1次或者以上的白色念珠菌阴道炎，而且会有部分患过白色念珠菌阴道炎患者会再次发作，其中有一小部分的患者会在1年内发生4次或者4次以上的白色念珠菌阴道炎疾病。目前临床对于白色念珠菌病的治疗面临着严峻的挑战。虽然新型抗真菌药物的相继问世给真菌病治疗带来了新的转机，但同时耐药菌株的出现也呈增多趋势。念珠菌病治疗难度大、念珠菌的耐药性增多及现有抗念珠菌药物毒副作用多等促使人们不断寻找高效低毒的抗真菌药物，这使得植物源抗菌药物倍受关注，且需求量逐渐增加。

目前国内外关于植物精油或者植物活性成分抗不同的敏感或者耐药病原菌已有了大量研究。药用植物作为一种具有治疗潜力的资源已经得到了历史的证明。紫苏(perillafrutescens)，一年生草本植物，历来被当作传统药物使用，是一种受欢迎的叶类蔬菜；紫苏具有清热解毒、抑制真菌生长的功效，紫苏醛(perillaldehyde,pae)，一种天然单萜化合物，为无色至浅黄色液体，大量存在于紫苏中。目前，针对pae抗菌活性的研究报道，只有少量关于其抗细菌作用的描述，对真菌作用也仅是对酵母菌属的零星报道，这些研究仅显示pae具有抗菌活性但并未深入开展研究。迄今为止，国内外未见有对紫苏醛防治白色念珠菌阴道炎的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供紫苏醛的新用途，具体的是紫苏醛在制备防治阴道炎的药物中的用途，还提供了以紫苏醛为活性成分的防治阴道炎的药物组合物。

本发明提供了紫苏醛在制备防治阴道炎的药物中的用途。

进一步的，所述的药物是防治白色念珠菌阴道炎的药物。

进一步的，所述的药物是以紫苏醛为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。

进一步的，所述的药剂是外用制剂、口服制剂或注射制剂。

进一步的，所述的外用制剂为洗剂、栓剂、涂膜剂或搽剂。

进一步的，所述的制剂中紫苏醛的浓度为0.4μl/ml-1.6μl/ml。

本发明的紫苏醛对白色念珠菌具有抑制作用，可用于制备防治白色念珠菌阴道炎的药物。

附图说明：

图1为本发明预防小鼠白色念珠菌阴道炎真菌检验结果；

注：非造模感染组(group1)：不破坏小鼠免疫功能，只进行白色念珠菌感染；造模非给药组(group2)：破坏小鼠免疫功能，感染白色念珠菌，给20μl赋形剂；预防组(groupp1)：造模感染给1000μg/ml氟康唑；预防组(groupp2)：造模感染给0.4μl/ml紫苏醛；预防组(groupp3)：造模感染给0.8μl/ml紫苏醛；预防组(groupp4)：造模感染给1.6μl/ml紫苏醛(n＝6)。

图2为本发明预防小鼠白色念珠菌阴道炎组织病理检查结果；

注：非造模感染组(group1)：不破坏小鼠免疫功能，只进行白色念珠菌感染；造模非给药组(group2)：破坏小鼠免疫功能，感染白色念珠菌，给20μl赋形剂；预防组(groupp1)：造模感染给1000μg/ml氟康唑；预防组(groupp2)：造模感染给0.4μl/ml紫苏醛；预防组(groupp3)：造模感染给0.8μl/ml紫苏醛；预防组(groupp4)：造模感染给1.6μl/ml紫苏醛。

图3为本发明治疗小鼠白色念珠菌阴道炎真菌检验结果；

注：非造模感染组(group1)：不破坏小鼠免疫功能，只进行白色念珠菌感染；造模非给药组(group2)：破坏小鼠免疫功能，感染白色念珠菌，给20μl赋形剂；治疗组(groupt1)：造模感染给1000μg/ml氟康唑；治疗组(groupt2)：造模感染给0.4μl/ml紫苏醛；治疗组(groupt3)：造模感染给0.8μl/ml紫苏醛；治疗组(groupt4)：造模感染给1.6μl/ml紫苏醛(n＝6)。

图4为本发明治疗小鼠白色念珠菌阴道炎组织病理检查；

注：非造模感染组(group1)：不破坏小鼠免疫功能，只进行白色念珠菌感染；造模非给药组(group2)：破坏小鼠免疫功能，感染白色念珠菌，给20μl赋形剂；治疗组(groupt1)：造模感染给1000μg/ml氟康唑；治疗组(groupt2)：造模感染给0.4μl/ml紫苏醛；治疗组(groupt3)：造模感染给0.8μl/ml紫苏醛；治疗组(groupt4)：造模感染给1.6μl/ml紫苏醛。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

实施例1：紫苏醛对白色念珠菌最低抑菌浓度(mic)的测定

根据美国临床实验室标准化委员会(nccls)制定的m27-a3微量肉汤稀释法测定紫苏醛对临床分离的白色念珠菌最低抑菌浓度(mic)。

供试培养基为rpmi1640。

供试病原真菌为白色念珠菌candidaalbicans(n＝6)。

采用二倍稀释法，向96孔板每孔中放入100μlrpmi1640培养基，再加入100μl紫苏醛，进行倍比稀释，得到96孔细胞培养板从第1至第10孔紫苏醛浓度范围为0.00313到3.2μl/ml。再接种100μl1×10³cfu/ml菌悬液，使每孔终体积为200μl，第11孔只加入rpml1640培养基200μl，作为培养基对照孔，第12孔加入200μl白色念珠菌菌悬液作为生长对照孔，96孔板加盖并用parafilm密封以减少孵育过程中水分的蒸发，将白色念珠菌置于37℃温箱中孵育48h，肉眼观察无白色念珠菌生长孔的所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度(mic)，实验重复3次。

实施例2：紫苏醛对白色念珠菌阴道炎的预防作用

紫苏醛对由白色念珠菌引起的白色念珠菌阴道炎具有预防作用。

1.实验用材

供试培养基为rpmi1640培养基。

供试病原真菌为白色念珠菌candidaalbicans。

供试动物为雌性balb/c(22±2g)小鼠。

2.实验准备

白色念珠菌candidaalbicans菌悬液制备：将白色念珠菌candidaalbicans接种于沙堡液体培养基(sdb)中，37℃培养12h，3200g离心5min，收集菌体，用rpmi1640培养基进行稀释，通过血球计数板调整菌悬液浓度为6×10⁶cfu/ml。

紫苏醛配制：用0.01％的无菌tween-20含1％羧甲基纤维素钠(cmc-na)配制不同浓度的紫苏醛(0.4μl/ml、0.8μl/ml、1.6μl/ml)。

3.实验方法

3.1模型的构建

免疫抑制模型的构建：将造模组小鼠于接种前6天开始皮下注射苯甲酸雌二醇油剂0.1mg/20g，1次/2天，并于接种前1天到接种后2天，每日腹腔注射22.5μg/20g地塞米松。接种时用多功能移液器向小鼠阴道接种20μl浓度为6×10⁶cfu/ml的菌悬液。于接种4天后，对造模组小鼠阴道进行真菌检验，确保每只小鼠阴道感染白色念珠菌。

3.2实验分组

在小鼠感染白色念珠菌之前，将未感染白色念珠菌小鼠随机分成7组，每组10只小鼠，分别给每只小鼠感染白色念珠菌。ck组小鼠不感染白色念珠菌，不破坏小鼠免疫功能，不给药；group1不破坏小鼠免疫功能，小鼠感染白色念珠菌；group2破坏小鼠免疫功能，小鼠感染白色念珠菌；groupp1-groupp4都破坏小鼠免疫功能，并都感染白色念珠菌，在此基础上，groupp1给20μl浓度为1000μg/ml的氟康唑阳性对照药物；groupp2给20μl浓度为0.4μl/ml的pae；groupp3给20μl浓度为0.8μl/ml的pae；groupp4给20μl浓度为1.6μl/ml的pae，每天给药两次，在小鼠感染白色念珠菌前两天开始给药直到接种后的十六天。

3.3评价指标

通过真菌检验和组织病理检查的结果来评价pae对白色念珠菌阴道炎的预防作用。

3.4实验结果

3.4.1真菌检验结果

真菌检验：在小鼠接种白色念珠菌candidaalbicans后的第四天、第八天、第十二天和第十六天，每组随机选取六只感染白色念珠菌的小鼠，用多功能移液器取1ml无菌生理盐水反复清洗阴道，并取灌洗液100μl，进行10倍稀释，将混匀后的10倍洗液接种于含有0.05％氯霉素的sda培养基中，37℃培养48h，进行平板计数，为减少误差，每只小鼠灌洗液设置了三组平行实验。

真菌检验使用spss(13.0)软件对数据进行处理分析。在预防实验中，当紫苏醛浓度分别为0.4μl/ml、0.8μl/ml和1.6μl/ml时，连续给药16天后，小鼠阴道载菌量分别为log10.25±2.87cfu/ml、log2.50±2.38cfu/ml、log1.50±2.38cfu/ml，而造模非给药组，小鼠阴道载菌量为log147.50±29.35cfu/ml，小鼠给药后阴道载菌量明显较低。氟康唑(1000μg/ml)阳性对照组，小鼠阴道载菌量为log3.75±4.92cfu/ml。紫苏醛高浓度(1.6μl/ml)组清除小鼠阴道内的白色念珠菌的能力强于氟康唑(1000μg/ml)阳性对照组，紫苏醛中浓度(0.8μl/ml)组清除小鼠阴道内的白色念珠菌的能力与氟康唑(1000μg/ml)阳性对照组相当(如图1，与预防组(group2)比较，*p<0.01)。

3.4.2组织病理检查结果

组织病理检查：在小鼠接种白色念珠菌candidaalbicans后的第四天和第十六天，每组随机选取两只感染白色念珠菌的小鼠，解剖小鼠并取出感染白色念珠菌的小鼠阴道，用10％多聚甲醛固定。阴道标本组织进行石蜡包埋，0.5μm切片，用过碘酸雪夫(pas)对感染白色念珠菌的小鼠阴道组织切片进行染色并拍照。

组织病理检查用过碘酸雪夫(pas)对小鼠阴道组织切片进行染色，观察白色念珠菌中形成的假菌丝和芽生孢子对阴道感染情况的影响。

如图2所示，当pae浓度为1.6μl/ml时，连续给药16天后，小鼠阴道粘膜组织全部恢复正常，没有发现有炎症细胞，pas染色结果图中也未检测到芽生孢子；当pae浓度为0.8μl/ml和0.4μl/ml时，连续给药16天后，与group2(感染非给药组)相比，小鼠阴道组织切片中可观察到的阴道粘膜组织炎症情况以及染色结果中的芽生孢子数都有所降低，groupp1(氟康唑阳性对照组)小鼠阴道组织切片中阴道粘膜组织发炎情况与groupp3(0.8μl/mlpae中剂量组)相当，染色观察到的芽生孢子数量也与groupp3(0.8μl/mlpae中剂量组)相当，groupp1(氟康唑阳性对照组)整体效果与groupp3(0.8μl/mlpae中剂量组)相当，groupp4(1.6μl/mlpae高剂量组)清除小鼠阴道内的白色念珠菌的能力强于groupp1(氟康唑阳性对照组)。

上述研究表明，pae对白色念珠菌阴道炎有明显的预防作用。

实施例3：紫苏醛对白色念珠菌阴道炎的治疗作用

紫苏醛对由白色念珠菌引起的白色念珠菌阴道炎具有治疗作用。

1.实验用材

供试培养基为rpmi1640培养基。

供试病原真菌为白色念珠菌candidaalbicans。

供试动物为雌性balb/c(22±2g)小鼠。

2.实验准备

白色念珠菌candidaalbicans菌悬液制备：将白色念珠菌candidaalbicans接种于沙堡液体培养基(sdb)中，37℃培养12h，3200g离心5min，收集菌体，用rpmi1640培养基进行稀释，通过血球计数板调整菌悬液浓度为6×10⁶cfu/ml。

紫苏醛配制：用0.01％的无菌tween-20含1％羧甲基纤维素钠(cmc-na)配制不同浓度的紫苏醛(0.4μl/ml、0.8μl/ml、1.6μl/ml)。

3.实验方法

3.1模型的构建

免疫抑制模型构建：将造模组小鼠于接种前6天开始皮下注射苯甲酸雌二醇油剂0.1mg/20g，1次/2天，并于接种前1天到接种后2天，每日腹腔注射22.5μg/20g地塞米松。接种时用多功能移液器向小鼠阴道接种20μl浓度为6×10⁶cfu/ml的菌悬液。于接种4天后，对造模组小鼠阴道进行真菌检验，确保每只小鼠阴道感染白色念珠菌。

3.2实验分组

紫苏醛对白色念珠菌阴道炎的治疗作用：ck组小鼠不感染白色念珠菌，不破坏小鼠免疫功能，不给药；group1不破坏小鼠免疫功能，小鼠感染白色念珠菌；group2破坏小鼠免疫功能，小鼠感染白色念珠菌；groupt1-groupt4都破坏小鼠免疫功能，并感染白色念珠菌，groupt1给20μl浓度为1000μg/ml的氟康唑阳性对照药物；groupt2给20μl浓度为0.4μl/ml的pae；groupt3给20μl浓度为0.8μl/ml的pae；groupt4给20μl浓度为1.6μl/ml的pae，每天给药两次，在小鼠感染白色念珠菌后第四天开始给药连续给药十六天。

3.3评价指标

通过真菌检验和组织病理检查的结果来评价pae对白色念珠菌阴道炎的治疗作用。

3.4实验结果

3.4.1真菌检验结果

真菌检验：在小鼠接种白色念珠菌candidaalbicans后的第四天、第八天、第十二天和第十六天，每组随机选取六只感染白色念珠菌的小鼠，用多功能移液器取1ml无菌生理盐水反复清洗阴道，并取灌洗液100μl，进行10倍稀释，将混匀后的10倍洗液接种于含有0.05％氯霉素的sda培养基，37℃下培养48h，进行平板计数，为减少误差，每只小鼠灌洗液设置了三组平行实验。

真菌检验使用spss(13.0)软件对数据进行处理分析。紫苏醛对白色念珠菌阴道炎治疗作用。在治疗实验中，当紫苏醛浓度分别为0.4μl/ml、0.8μl/ml和1.6μl/ml时，连续给药16天后，小鼠阴道载菌量分别为log17.75±6.18cfu/ml、log12.75±14.17cfu/ml、log4.68±5.97cfu/ml，而造模非给药组，小鼠阴道载菌量为log147.50±29.85cfu/ml，给药后阴道载菌量明显较低。氟康唑(1000μg/ml)阳性对照组，小鼠阴道载菌量为log19.00±10.61cfu/ml，紫苏醛低浓度(0.4μl/ml)组清除阴道念珠菌能力与阳性对照组相当，紫苏醛中浓度(0.8μl/ml)组和紫苏醛高浓度(1.6μl/ml)组清除阴道念珠菌能力强于氟康唑阳性对照组(如图3所示，与治疗组(group2)比较，*p<0.01)。

3.4.2组织病理检查结果

组织病理检查：在小鼠接种白色念珠菌candidaalbicans后的第四天和第十六天，每组随机选取两只感染白色念珠菌的小鼠，解剖小鼠并取出感染白色念珠菌的小鼠阴道，用10％多聚甲醛固定，阴道标本组织进行石蜡包埋，0.5μm切片，用过碘酸雪夫(pas)对感染白色念珠菌的小鼠阴道组织切片进行染色并拍照。

组织病理检查用过碘酸雪夫(pas)对小鼠阴道组织切片进行染色，观察白色念珠菌中形成的假菌丝和芽生孢子对阴道感染情况的影响。

如图4所示，造模组小鼠于接种后4天，阴道组织切片中有许多假菌丝和芽生孢子。当pae浓度为0.4μl/ml、0.8μl/ml、1.6μl/ml时，连续给药16天后，阴道组织切片中阴道粘膜组织的炎性情况和染色观察到的芽生孢子数量比group2(造模非给药组)都有所降低，groupt1(氟康唑阳性对照组)小鼠阴道组织切片中阴道粘膜组织的炎性情况和染色观察到的芽生孢子数量与groupt2(0.4μl/mlpae低剂量组)情况相当，而groupt3(0.8μl/mlpae中剂量组)和groupt4(1.6μl/mlpae高剂量组)治疗效果均优于groupt1(氟康唑阳性对照组)。

研究结果证明了pae对白色念珠菌阴道炎有明显的治疗作用。

本发明中紫苏醛对白色念珠菌具有抑制作用，可用于制备防治白色念珠菌阴道炎的药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。