GO‑PLL‑RGDS/VEGF‑siRNA靶向基因药物的制备、活性和应用的制作方法
本发明涉及用于递送vegf-sirna的递送系统go-pll-rgds/vegf-sirna，涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的细胞摄取情况，涉及它沉默vegf基因的作用，涉及它下调vegf表达的效率，涉及它抑制肿瘤细胞增殖的作用，并涉及它抑制荷s180肉瘤小鼠肿瘤生长的作用以及递送系统的肿瘤靶向作用，因而涉及它作为非病毒载体在抗肿瘤基因治疗药物中的应用。属于生物医药学领域。
背景技术：
近年来，研究发现，在肿瘤的基因治疗中，非病毒载体比病毒载体安全性高，避免了腺病毒等病毒载体引起免疫原性反应的可能，从而成为基因递送研究的热点。目前已报道的非病毒载体主要分为阳离子聚合物类(如聚乙烯亚胺pei)、脂质体类、无机纳米材料(如纳米金刚石、金纳米粒)等，然而大多研究仍存在一些亟需解决的问题。例如，pei的细胞毒性较大；脂质体的负载效率低；无机纳米材料大多为疏水性，稳定性以及生物相容性较差。另外，非病毒载体的肿瘤靶向性差也是造成基因递送效率低、体内毒副作用大的关键因素。
石墨烯自发现以来，由于其独特的单原子层结构特征和理化性质引起极大关注，除在电学、光学等领域的应用引起广泛研究外，其越来越多的医学应用价值被逐渐发掘出来。氧化石墨烯(grapheneoxide，go)是石墨烯的氧化物，是在运用氧化还原法制备石墨烯时得到的前驱体，其表面存在羧基、羟基、环氧基等多种含氧功能团，生物相容性较好并且有利于对其进行功能化修饰。另外，由于其独特的二维纳米结构，氧化石墨烯的比表面积比一般纳米载体大，并且上下两面都可以进行修饰。聚l-赖氨酸(pll)是一种碱性氨基酸聚合物，由于含有多个游离的氨基，所以在生理条件下发生解离，带有正电荷。除此之外，pll是一种亲水性较强的化合物，在体内可被生物降解，其单体是人体必需氨基酸赖氨酸，所以生物相容性较好。rgd(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)序列肽是细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)中糖蛋白成分纤连蛋白(fibronectin，fn)的保守性序列，对纤连蛋白与细胞表面受体之间的相互作用起到识别作用。rgd序列肽的受体—整合素，是一类膜糖蛋白家族。已有研究表明，在某些实体瘤细胞膜上整合素受体高表达。rgds(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-丝氨酸)是一种线性rgd序列肽，研究表明可以与肿瘤细胞膜上高表达的整合素受体特异性结合，因此可作为靶向序列对药物或基因载体进行修饰，实现药物或基因的靶向递送。
本发明利用聚l-赖氨酸pll对氧化石墨烯进行正电性和亲水性修饰，然后利用靶向序列肽rgds进行靶向性修饰，通过共价键将其连接，得到基因vegf-sirna的递送载体go-pll-rgds。本发明为提高vegf-sirna的负载量，选用比表面积较大的氧化石墨烯作为载体，并通过与pll与靶向性序列肽rgds共价连接制得go-pll-rgds，然后负载vegf-sirna，结果发现1mg的go-pll-rgds可负载100μg的vegf-sirna，基因敷在效率大大提高，并通过药物分布研究确证了递送系统的肿瘤靶向性。根据这个发现，发明人提出了本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的基因递送系统：go-pll-rgds/vegf-sirna。
本发明所述的基因递送系统，由抗肿瘤基因治疗药物vegf-sirna和靶向递送载体go-pll-rgds制备而成。
本发明所述的基因递送系统，go-pll-rgds与vegf-sirna的质量比为：10:1。
本发明所述的基因递送系统，为纳米结构。
本发明所述的基因递送系统，靶向递送载体go-pll-rgds由以下成分制成：go、pll、rgds。
本发明的另一个目的在于提供基因递送系统的制备方法。
本发明所述的制备方法：将go-pll-rgds与vegf-sirna按照质量比10:1混合，室温静置，即得go-pll-rgds/vegf-sirna。
其中，靶向递送载体go-pll-rgds的制备：氧化石墨烯go通过开环反应、缩合反应依次连接pll(聚l-赖氨酸)和rgds并脱保护得到go-pll-rgds。优选的，本发明所述的基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：
1)制备go-pll
称取2.0mggo超声分散在4ml超纯水中，用探头超声仪即超声波破碎仪超声4h(2秒间歇式)。加入koh水溶液(ph9)至8ml。加入10.0mgpll,此时有沉淀物生成，继续用koh水溶液(ph11)调至ph值为9。将反应瓶置于70℃油浴中搅拌24h。24h后停止加热，离心(12000g,20min),弃掉上清液，水洗三次，洗掉未反应的pll。冻干备用。
2)制备boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh
按照标准方法制备boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-obzl。将boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-obzl430mg加入20ml甲醇中，加入64.5mg钯碳，通入氢气，室温反应，tlc监测反应。5h后反应完全，滤除钯碳，旋除甲醇，得到boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh。
3)制备go-pll-rgds
称取10mgboc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh，将其溶解在10mldmf中，加入30mgedc·hcl，搅拌活化15min，形成反应液a。将2mggo-pll超声分散在10mldmf中，然后将其与上述活化的反应液a混合，再加入30mghobt，室温搅拌。24h后，将反应液离心(12000g，20min)，收集沉淀物，用甲醇和超纯水洗涤离心三次，除去未结合的boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh和未反应的edc·hcl和hobt。冻干得到go-pll-ser-asp(ome)-gly-arg(tos)-boc。将其分散在10ml甲醇溶液中，超声30min，冰浴条件下，用naoh(2n)溶液调节其ph值等于12，反应6h，待反应结束后，以10000g的转速离心10min，用超纯水漂洗3次，再用无水乙醇漂洗三次，以12000g转速离心15min，放置通风处自然干燥。冰浴下，将上述干燥的产物分散在5ml混合酸液中(tfa：tfoh＝4:1,v/v)，反应1h。将其转移至离心管中，离心(7000g，15min)弃掉上清。分别用无水乙醚漂洗和超纯水漂洗三次即得到目标产物go-pll-ser-asp-gly-arg(go-pll-rgds)。最后加入5ml超纯水，超声分散，发现产物分散性良好。将分散液装入透析袋(截留分子量：8000)，透析24h除去杂质。将透析纯化后的分散液冻干，测定红外光谱。
4)制备go-pll-rgds/vegf-sirna
称取2mggo-pll-rgds，分散在2mldepc水中，超声40min，分别配制成1000μg/ml的go-pll-rgds储备液，再将1.0odvegf-sirna(33μg)溶解在250μldepc水中。将go-pll-rgds与vegf-sirna按照一定的n/p比混合，室温静置30min，即得go-pll-rgds/vegf-sirna。
本发明的另一个目的在于提供基因递送系统在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
本发明的另一个目的在于评价基因递送系统go-pll-rgds/vegf-sirna在基因和蛋白水平下调vegf表达的效率。
本发明的另一个目的在于评价基因递送系统go-pll-rgds/vegf-sirna抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本发明的另一个目的在于评价基因递送系统go-pll-rgds/vegf-sirna抑制荷s180肉瘤小鼠肿瘤生长的作用。
本发明的另一个目的在于评价基因递送系统go-pll-rgds/vegf-sirna靶向荷s180肉瘤小鼠肿瘤的靶向性作用。
对说明书中出现的以下词语作进一步的解释：
go：grapheneoxide，氧化石墨烯
pll：聚l-赖氨酸
rgds：arg-gly-asp-ser，精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-丝氨酸
说明书中其他位置出现的英文缩写，请罗列出来作出进一步的解释:
vegf：血管内皮生长因子
pei：聚乙烯亚胺
tlc：薄层层析法
dmf：n,n-二甲基甲酰胺
edc·hcl：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐
hobt：1-羟基苯并三唑
tfa：三氟乙酸
tfoh：三氟甲磺酸
od值：光密度值
depc：焦碳酸二乙酯
n/p比：氮/磷比，指基因载体与基因的比例
nc：非同源-sirna
dmem：改良杜氏伊格尔培养基
fbs：胎牛血清
fam：羟基荧光素
mtt:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐
dmso：二甲基亚砜
ns：生理盐水
cy3：花青染料荧光标记
elisa：酶联免疫吸附测定
rt-qpcr：实时定量逆转录-聚合酶链式反应
附图说明：
图1.go-pll-rgds/vegf-sirna的制备路线。
注：反应条件：i:koh,70℃.ii:boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh/edc；naoh/ch3oh；三氟乙酸/三氟甲磺酸.ⅲ:室温孵育静置30min.
图2.琼脂糖凝胶阻滞实验结果图。
图3.go、go-pll-rgds和go-pll-rgds/vegf-sirna的透射电镜图。
注：go(a)，go-pll-rgds(b)，go-pll-rgds/vegf-sirna(c)的透射电子显微镜图片
图4.空白水，go、go-pll-rgds和go-pll-rgds/vegf-sirna的原子力显微镜。
注：水(a),go(b),go-pll-rgds(c),go-pll-rgds/vegf-sirna(d)的原子力显微镜图片。
图5.hela细胞对go-pll-rgds/vegf-sirna摄取的结果图。
a:空白对照组
b:裸fam-vegf-sirna组
c:go-pll-rgds/vegf-sirna组
d:lipo/fam-vegf-sirna组
图6.go-pll-rgds/vegf-sirna的实时反转录定量聚合酶链反应的测定结果。(n＝3)
注：gpr为go-pll-rgds的指代写法；nc为非同源阴性对照sirna。
图7.go-pll-rgds/vegf-sirna的酶联免疫吸附法测定结果图。(n＝3)
注：gpr为go-pll-rgds的指代写法；nc为非同源阴性对照sirna。
图8.mtt法测go-pll-rgds的细胞毒性结果。(n＝3)
图9.go-pll-rgds/vegf-sirna抑制hela细胞增殖作用结果。(n＝3)
注：gpr为go-pll-rgds的指代写法；nc为非同源阴性对照sirna。
图10.go-pll-rgds/vegf-sirna的体内抗肿瘤活性结果。(n＝10)
注：blankcontrol为空白对照生理盐水组；negativecontrol为vegf-sirna阴性对照组；positivecontrol为阿霉素组。gpr为go-pll-rgds的指代写法。
给药剂量：空白对照生理盐水组为0.2ml/只,阴性对照组vegf-sirna给药剂量为0.3mg/kg，gpr/vegf-sirna组中go-pll-rgds剂量为3mg/kg，vegf-sirna给药剂量为0.3mg/kg，阳性对照阿霉素剂量为2μmol/kg。
a为各组肿瘤照片，b为肿瘤重量，c为抑瘤率。
图11.go-pll-rgds/vegf-sirna的肿瘤靶向作用。
a:空白对照组
b:裸cy3-vegf-sirna组
c:go-pll-rgds/cy3-vegf-sirna组
具体实施方式：
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备go-pll-rgds/vegf-sirna
制备go-pll
称取2.0mggo超声分散在4ml超纯水中，用探头超声仪即超声波破碎仪超声4h(2秒间歇式)。加入koh水溶液(ph9)至8ml。加入10.0mgpll,此时有沉淀物生成，继续用koh水溶液(ph11)调至ph值为9。将反应瓶置于70℃油浴中搅拌24h。24h后停止加热，离心(12000g,20min),弃掉上清液，水洗三次，洗掉未反应的pll。冻干备用。测定红外光谱。傅立叶转换红外线光谱(ftir，thermoscientifictmnicolettmistm5，cm-1):3242.74，2935.15，1635.09，1520.51，1340.47，1037.13，601.35。
制备boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh
按照标准方法制备boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-obzl。将boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-obzl430mg加入20ml甲醇中，加入64.5mg钯碳，通入氢气，室温反应，tlc监测反应。5h后反应完全，滤除钯碳，旋除甲醇，得到boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh。
测定核磁共振,1h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ/ppm＝δ/ppm＝12.656(s,1h),8.169(d,j＝7.50hz,1h),8.047(t,j＝8.00hz,1h),7.924(d,j＝7.50hz,1h),7.630(d,j＝8.00hz,2h),7.283(d,j＝8.50hz,2h),7.016(m,1h),6.915(d,j＝8.00hz,1h),6.614(m,1h),4.725(dd,j1＝13.50,j2＝7.50hz,1h),4.209(m,1h),3.890(m,1h),3.782(d,j＝5.50hz,2h),3.711(dd,j1＝11.00hz,j2＝5.00hz,1h),3.619(dd,j1＝11.00hz,j2＝5.00hz,1h),3.595(s,3h),3.308(s,2h),3.029(s,2h),2.746(dd,j1＝16.00hz,j2＝5.50hz,1h),2.531(dd,j1＝16.00hz,j2＝8.00hz,1h),2.343(s,3h),1.603(s,1h),1.450(m,2h),1.379(s,9h).
13c-nmr(125mhz,dmso-d6):δ/ppm＝172.87,172.15,170.96,170.63,169.18,157.10,155.89,142.26,141.49,129.50,126.04,78.68,61.71,55.33,54.43,51.98,49.55,42.47,36.67,29.63,28.67,21.35.
esi-ms(m/z):[m-1]-：700.47；[2m-1]-:1401.70.
制备go-pll-rgds
称取10mgboc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh，将其溶解在10mldmf中，加入30mgedc·hcl，搅拌活化15min，形成反应液a。将2mggo-pll超声分散在10mldmf中，然后将其与上述活化的反应液a混合，再加入30mghobt，室温搅拌。24h后，将反应液离心(12000g，20min)，收集沉淀物，用甲醇和超纯水洗涤离心三次，除去未结合的boc-arg(tos)-gly-asp(ome)-ser-oh和未反应的edc·hcl和hobt。冻干得到go-pll-ser-asp(ome)-gly-arg(tos)-boc。将其分散在10ml甲醇溶液中，超声30min，冰浴条件下，用naoh(2n)溶液调节其ph值等于12，反应6h，待反应结束后，以10000g的转速离心10min，用超纯水漂洗3次，再用无水乙醇漂洗三次，以12000g转速离心15min，放置通风处自然干燥。冰浴下，将上述干燥的产物分散在5ml混合酸液中(tfa：tfoh＝4:1,v/v)，反应1h。将其转移至离心管中，离心(7000g，15min)弃掉上清。分别用无水乙醚漂和超纯水漂洗三次即得到目标产物go-pll-ser-asp-gly-arg(go-pll-rgds)。最后加入5ml超纯水，超声分散，发现产物分散性良好。将分散液装入透析袋(截留分子量：8000)，透析24h除去杂质。将透析纯化后的分散液冻干，测定红外光谱。傅立叶转换红外线光谱(ftir,thermoscientifictmnicolettmistm5,cm-1)：3253.22，2922.98，1643.00，1518.86，1056.93，666.97。
制备go-pll-rgds/vegf-sirna
称取2mggo-pll-rgds，分散在2mldepc水中，超声40min，分别配制成1000μg/ml的go-pll-rgds储备液，再将1.0odvegf-sirna(33μg)溶解在250μldepc水中。将go-pll-rgds与vegf-sirna按照一定的n/p比混合，室温静置30min，即可得到转染复合物go-pll-rgds/vegf-sirna。
测定go-pll-rgds/vegf-sirna中vegf-sirna的负载量
配制样品用rna稀释缓冲液配制go-pll-rgds：vegf-sirna(质量比)为2:1，8:1，10:1，20:1，30:1，40:1，50:1的混合悬浮液100μl，摇匀，室温静置30min。
实验步骤称取0.5g琼脂糖于100ml烧杯中，加入5mltbe(10×)和45ml去离子水，置于微波炉内中高火加热2min将琼脂糖溶化。稍冷却后加入10μl溴化乙锭溶液(10mg/ml)，搅匀，倒入模具中(事先洗净并用无水乙醇润洗晾干)，插入梳子，凝固后备用。取30mltbe(10×)和270ml超纯水，混合均匀后倒入电泳槽中作为电泳液。取出凝固后的琼脂糖凝胶，置于电泳槽中，每孔加样20μl。打开电源，将电压设置成120v，时间设置为20min。从电泳槽中取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪观察并拍照。
实验结果如图2所示，不同质量比的go-pll-rgds/vegf-sirna的荧光条带均比游离sirna组(对照)弱，说明vegf-sirna被不同程度地阻滞在上样孔里，表明vegf-sirna成功被部分或完全稳定负载在go-pll-rgds表面。当质量比为10:1时，荧光条带完全消失，说明此时vegf-sirna被完全阻滞在上样孔里，即vegf-sirna被完全负载在go-pll-rgds表面。所以，1mggo-pll-rgds可以负载100μgvegf-sirna。
实施例2测定go-pll-rgds和go-pll-rgds/vegf-sirna的纳米结构
实验方法取100μl浓度为1000μg/ml的go、go-pll-rgds水分散液用纯水稀释到2ml。按照质量比10:1配制go-pll-rgds/vegf-sirna水分散液，即go-pll-rgds的浓度为50μg/ml，vegf-sirna的浓度为5μg/ml。各取20μl滴加到碳支持膜(铜网)上，置于37℃烘箱中干燥24h。将各样品置于透射电镜(tem，jem-1230，jeol，日本)下观察并获取照片。再各取20μl滴加到云母片上，置于室温自然风干。将各样品置于原子力显微镜(afm，veecoinstruments，inc，plainview，usa)下观察并获取照片。以水为空白背景。
实验结果从图3中的透射电镜图像我们可以看出go有典型的褶皱片状纳米结构，粒径大小不均，在100-350nm范围内。而go-pll-rgds的粒径大小明显较小，在60-180nm之间,。这是由于亲水性化合物pll和rgds的修饰，使go-pll-rgds的水分散性更好，不易发生聚集。而负载了vegf-sirna的go-pll-rgds/vegf-sirna的粒径增加，部分达到200nm以上。另外，图4中的原子力显微镜图像显示，go-pll-rgds的厚度由未经修饰的1.7nm左右(go)增加到3.0nm。与go-pll-rgds相比，go-pll-rgds/vegf-sirna的粒径和厚度均有增加，厚度增加到4.4nm左右。
实施例3测定go-pll-rgds和go-pll-rgds/vegf-sirna的zeta电位和水合粒径
实验方法配制100μg/mlgo和go-pll-rgds的水分散液备用。配制100μg/ml(即go-pll-rgds的浓度为100μg/ml，vegf-sirna的浓度为10μg/ml)的go-pll-rgds/vegf-sirna水分散液。用激光粒度分析仪测定样品的粒径分布与zeta电位。
实验结果go、go-pll-rgds和go-pll-rgds/vegf-sirna的zeta电位值分别是-40.59±2.23mv、25.87±0.47mv、15.36±2.62mv。go、go-pll-rgds和go-pll-rgds/vegf-sirna的水合粒径分别为275.8±2.7nm、162.9±4.5nm、196.6±2.7nm。zeta电位值由负值变为正值，也进一步说明go-pll-rgds的成功修饰。在负载vegf-sirna之后，复合物go-pll-rgds/vegf-sirna仍表现出一定的正电性，这对细胞摄取有重要意义。
实施例4激光共聚焦显微镜考察hela细胞对go-pll-rgds/vegf-sirna的细胞摄取情况
实验方法
1)药物配制：将go-pll-rgds超声分散在depc水中，配成浓度为1000μg/ml的储备液。将其放置在无菌样品瓶中(厚度不超过1cm)，紫外照射24h。将1.0od(2.5nmol，33μg)fam-vegf-sirna溶解在250μl的depc水中，配成10nmol/ml的储备液。lipo(lipornaimax)的使用浓度按照说明书推荐量。按照以下各组分比例分别配成100nmol/l(按sirna的浓度计)的裸fam-vegf-sirna、go-pll-rgds/fam-vegf-sirna、lipo/fam-vegf-sirna。
1.裸fam-vegf-sirna(阴性对照组)：取24μlfam-vegf-sirna储备液加入到2376μl无血清培养基中混匀备用。
2.go-pll-rgds/fam-vegf-sirna(实验组)：取24μlfam-vegf-sirna和34μlgo-pll-rgds储备液加入到2342μl无血清培养基中混匀，室温静置30min备用。
3.lipo/fam-vegf-sirna(阳性对照组)：取24μlfam-vegf-sirna和20μllipo(lipornaimax)储备液加入到2356μl无血清培养基中混匀，室温静置30min备用。
2)细胞复苏及培养：
1.打开水浴锅，预热(37℃)。
2.从液氮罐中取出冻存的hela细胞，迅速放入37℃水浴中，1min内溶解。
3.在超净台中把溶解的细胞快速移入离心管中，加入2ml的完全培养基。离心(1000g，5min)。
4.弃上清，加入1ml培养基，吹打均匀，移入25cm2培养瓶中，补加4ml培养基，37℃、5％co2的培养箱中培养。
3)细胞传代：弃掉原培养基，加入2ml的pbs小心吹洗2次，再加入1ml胰酶，吹打均匀，放入培养箱，4min后，在倒置显微镜下观察，细胞回缩成球形悬浮起来。加入3ml完全培养基，终止消化。小心吹打细胞，并将其转入离心管中，离心(1000g，5min)，小心倾倒上清液，加入4ml完全培养基吹打均匀。各吸取2ml细胞悬液于25cm2培养瓶中。再各自补加3ml培养液，吹打均匀，放入培养箱中，37℃、5％co2培养。
4)激光共聚焦显微镜测定：将3×105个(2.0×105/ml)hela细胞种于内径10mm的激光共聚焦小皿中，37℃、5％co2培养24h，待细胞贴壁后换成配制好的含药培养基(不含fbs)。分别设空白对照组(加入等体积的空白培养基)、阳性对照组、阴性对照组、实验组。转染4h后，弃掉含药培养基，用pbs洗三次，每皿加入hoechst33342工作液1ml，孵育15min后弃掉，用pbs洗三遍，最后在每皿中预留少量pbs防止干片。置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
实验结果fam是一种羧基化的荧光素类标记试剂，激发波长492nm，发射波长518nm。如图5所示，a组是空白对照组，hoechst33342将细胞核染成蓝色。b组镜下只能观察到蓝色的细胞核，可知，游离的fam-vegf-sirna不能被细胞摄取。c组中，在细胞核外能观察到绿色荧光，在merge通道下可以观察到绿色荧光集中分布在胞质中，可知，fam-vegf-sirna被go-pll-rgds成功递送进入细胞。d组作为阳性对照，也可以在细胞核周围观察到绿色荧光。因此，从以上结果可以得出以下结论：转染复合物go-pll-rgds/fam-vegf-sirna成功被细胞摄取，并定位于细胞质内。
实施例5实时反转录定量聚合酶链反应评价go-pll-rgds/vegf-sirna沉默vegf编码基因的作用
实验方法
1)药物配制：将go-pll-rgds超声分散在depc水中，配成浓度为1000μg/ml(储备液1)的储备液。将其分别放置在无菌样品瓶中(厚度不超过1cm)，紫外照射24h备用。将1.0od(2.5nmol，33μg)homo-vegf-sirna溶解在250μl的depc水中，配成10nmol/ml的储备液。1.0od(2.5nmol，33μg)非同源-sirna(nc)溶解在250μl的depc水中，配成10nmol/ml的储备液。lipo(lipornaimax)的使用浓度按照说明书推荐量。
按下表配制含药培养基各6ml(浓度为100nm)：
表1.药物配制比例
2)细胞转染：取对数期hela细胞，计数，调整细胞浓度至1.6×105个/ml(所用培养基为不含抗生素但含10％fbs的dmem培养基)。每孔吸取2ml细胞悬液接种到六孔板中，使每孔细胞个数为3.2×105个，37℃、5％co2培养。12h后待细胞贴壁后，将培养基小心吸出。每孔加入配制的含药培养基各2ml，每组设3个复孔，空白对照组加入等体积的dmem。37℃、5％co2条件下继续培养6h。6h后，小心吸出含药培养基，换成完全培养基，继续培养42h。
在进行细胞转染时，我们发现，如果给予转染试剂lipo(lipornaimax)前的细胞用含双抗的完全培养基培养，当加入转染试剂lipo后发现细胞在30min内形状由梭形变成圆形，漂浮在培养基中。而go-pll-rgds/vegf-sirna则无此现象。之后，用不含双抗的培养基培养至贴壁，然后给予转染试剂进行转染，此现象消失。
3)细胞全rna的提取：操作前用rna酶清除剂擦拭工作台面，使用无酶离心管和枪头。
1.取转染结束的六孔板，弃去培养基，每孔加入1mltrizol裂解液(trizol裂解液的用量根据孔面积计算，10cm2加1mltrizol裂解液)，用移液枪吹打均匀，3min后转移到离心管中，静置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
2.每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min，离心(4℃，12000g，15min)。
3.离心后混合液分成三层，下面为红色的苯酚-氯仿层，上面为水相，rna存在水相中，约占总体积的50％。
4.沉淀rna：将上层水相缓慢小心地转移到另一个离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min，然后离心(4℃，12000g，15min)，可见白色沉淀。
5.洗涤rna：弃上清，加入1ml配置好的75％乙醇(v醇/vdepc水＝3：1)。洗涤rna沉淀，震荡摇匀，离心(4℃，12000g，15min)，重复洗涤三次。弃上清，晾干(注意：无需完全干燥，否则极大降低它的溶解度)。
6.rna再溶解：用depc水(每管60μl)重悬rna，吹打几次，用低功率超声使rna完全溶解，55℃水浴孵育10min，再冷却至室温，分装后-80℃保存。
7.纯度及浓度测定：用depc水校正nanodrop-1000后，用2μlrna水溶液滴在测量臂上，选择核酸rna-measure进行测量od260/od280值和浓度值。
4)反转录：
1.样品准备：根据测定的rna浓度，计算出所需的rna体积(样品需2μg)，配置样品。
2.每个反应孔加10μl2×rtbuffer，1μlrtenzymemix和相应体积的rna溶液，depc水补足20μl，加入到microamptmoptical96-wellreactionplate中，用封口膜封口，4℃，1000g，离心3min，除去气泡。
3.将microamptmoptical96-wellreactionplate放入realtimepcrsystem7500中，设置条件，94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃25s，72℃7min，4℃∞。共30个循环。获得cdna，测其浓度。
5)聚合酶链反应：
1.cdna的上样量为50ng，根据其浓度计算需加入的各组cdna样品的体积。按照以下各组分体积配制混合液：每个反应孔混合液体积为50μl，包括25μl
2.将配好的混合液加入microamptmoptical96-wellreactionplate中，每孔50μl，离心(4℃，1000g，3min)，使混合液沉于反应孔底部并排出气泡，
3.将96孔板放入real-timepcrsystem7500中，设置条件，hold：50℃2min，95℃10min，cycle(40cycles)，95℃15s，60℃1min。开始扩增。
4.数据处理。以gapdh为内参，运用2-△△ct法相对定量各mrna的量。上述实验重复三次。
实验结果
表2.在go-pll-rgds/vegf-sirna作用下hela细胞的vegf-mrna的相对量(均值±sd，n＝3)
从图6可以看出：阴性对照组游离的vegf-sirna和go-pll-rgds/非同源sirna的mrna相对表达量与空白对照组比较，无显著性差异(p>0.05)，即两者均不能有效下调mrna的表达。而实验组go-pll-rgds/vegf-sirna的mrna的相对表达量与空白对照组比较有显著性差异(p<0.01)，go-pll-rgds/vegf-sirna能够有效下调mrna的表达，下调率为40.86±4.09％，与阳性对照组lipo/vegf-sirna相当。
实施例6酶联免疫吸附法评价go-pll-rgds/vegf-sirna下调vegf表达的作用
实验方法
1)药物配制：将go-pll-rgds超声分散在depc水中，配成浓度为1000μg/ml(储备液1)的储备液。将其分别放置在无菌样品瓶中(厚度不超过1cm)，紫外照射24h备用。将1.0od(2.5nmol，33μg)homo-vegf-sirna溶解在250μldepc水中，配成10nmol/ml的储备液。1.0od(2.5nmol，33μg)非同源-sirna(nc)溶解在250μldepc水中，配成10nmol/ml的储备液。lipo(lipornaimax)的使用浓度按照说明书推荐量。按照2.1.3中的方法分别配制药物。
按下表配制含药培养基各6ml(浓度为100nm)：
表1.药物配制比例
2)细胞转染取对数期hela细胞，计数，调整细胞浓度至1.6×105个/ml(所用培养基为不含抗生素但含10％fbs的dmem培养基)。每孔吸取2ml细胞悬液接种到六孔板中，使每孔细胞个数为3.2×105个，37℃、5％co2培养。12h后待细胞贴壁后，将培养基小心吸出。每孔加入配制的含药培养基2ml，每组设3个复孔，空白对照组加入等体积的dmem。37℃、5％co2条件下继续培养6h。6h后，小心吸出含药培养基，换成完全培养基，继续培养42h。由于vegf是分泌性蛋白，直接收集细胞培养基上清即可检测其含量。具体方法为：吸取每孔的培养基于离心管中，离心(4℃，8000g，10min)，取上清，再离心(4℃，12000g，10min)，取上清即可。
3)bcaproteinassaykit测定培养液上清中总蛋白浓度
用bca蛋白定量试剂盒，按照说明描绘标准曲线，测定每组蛋白样品的浓度(将蛋白样品原液稀释5倍测定)。
4)humanvegfelisa试剂盒测定样品蛋白中vegf的含量
1.根据每组蛋白样品的浓度计算每个样品的上样体积(按每个样品上样130μg计算)用超纯水配成50μl的样品液。
2.按照稀释比稀释washbuffer(25×)，streptavidin-hrp(100×)。
3.除chromogenblanks外所有孔每孔加入50μlincubationbuffer。标准品孔中再加入100μlstandarddiluentbuffer，样品孔加入50μlstandarddiluentbuffer和50μl样品液，并设置三个复孔。用封口膜盖住，室温下放置2h。
4.小心吸除液体，每孔用washbuffer(1×)洗4次，每次100μl/孔。除chromogenblanks外每孔加入100μlhuvegfbiotinconjugate。用封口膜盖住，室温放置1h。
5.小心吸除液体，washbuffer(1×)洗4次。除chromogenblanks外每孔加入100μlstreptavidin-hrp，用封口膜盖住，室温下放置30min。
6.小心吸除液体，washbuffer(1×)洗4次，每孔加入100μlstabilizedchromogen，另3个chromogenblanks也加100μlstabilizedchromogen的孔。盖上封口膜，避光，室温静置30min后，每孔加入100μlstopsolution，轻敲，至完全变色。在450nm下测定od值。
上述实验重复三次。
实验结果
表2.在go-pll-rgds/vegf-sirna作用下hela细胞的vegf蛋白的相对量(均值±sd％，n＝3)
从图7中可以看出，阴性对照组游离的vegf-sirna和go-pll-rgds/非同源sirna的vegf相对表达量与空白对照组比较，无显著性差异(p>0.05)，即两者均不能有效下调vegf的表达。而实验组go-pll-rgds/vegf-sirna的vegf的相对表达量与空白对照组比较有显著性差异(p<0.01)，go-pll-rgds/vegf-sirna能够有效下调蛋白的表达，下调率为51.71±4.54％。
实施例7评价go-pll-rgds/vegf-sirna的细胞毒性和抑制肿瘤细胞增殖的作用
实验方法
1)试剂配制
完全培养基：dmem培养基(450ml)中加入灭活的胎牛血清50ml(10％)，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml。
无血清培养基：dmem培养基。
胎牛血清的灭活：将成品胎牛血清在56℃水浴中孵育30min，分装为50ml/份，-20℃保存。
pbs：将pbs粉末按说明用超纯水配制成ph7.4，浓度为0.01m的pbs缓冲液，高压灭菌。4℃保存。
胰酶：将成品胰酶分装10ml/份，4℃保存。
mtt工作液：称取50mgmtt粉末，将其溶解在10ml的pbs缓冲液中，超声使其充分溶解，配制成5mg/ml的工作液，用0.22μm过滤膜过滤除菌。
2)药物配制
将中间产物go-pll超声分散在depc水中，配成浓度为1000μg/ml的储备液1。
将go-pll-rgds超声分散在depc水中，配成浓度为1000μg/ml(储备液2)和500μg/ml(储备液3)的储备液。将其分别放置在无菌样品瓶中(厚度不超过1cm)，紫外照射24h备用。将1.0od(2.5nmol，33μg)homo-vegf-sirna溶解在500μldepc水中，配成5nmol/ml的储备液。1.0od(2.5nmol，33μg)非同源-sirna(nc)溶解在500μldepc水中，配成5nmol/ml的储备液4。lipo(lipornaimax)的使用浓度按照说明书推荐量。
1.go-pll-rgds的细胞毒性评价
go-pll和go-pll-rgds：将go-pll和go-pll-rgds储备液分别稀释成浓度分别为50，100，200，300，400，500，750μg/ml的go-pll母液和go-pll-rgds母液。
2.go-pll-rgds/vegf-sirna的抑制hela细胞增殖的作用
空白背景组：只加入空白培养基，没有细胞。
空白对照组：不进行处理，只加入相同体积的培养基的细胞。
阴性对照组：go-pll-rgds、vegf-sirna、go-pll-rgds/非同源-sirna、lipo/非同源-sirna
阳性对照组：lipo/vegf-sirna
实验组：go-pll-rgds/vegf-sirna、go-pll-rgds、vegf-sirna、go-pll-rgds/非同源-sirna、lipo/非同源-sirna、lipo/vegf-sirna和go-pll-rgds/vegf-sirna的浓度均为10nm，40nm，80nm，120nm。
3)mtt法评价go-pll-rgds的细胞毒性
取对数期hela细胞，计数，调整细胞浓度至4×104个/ml。96孔板用pbs液封，每孔取100μl细胞悬液种板，37℃、5％co2培养。12h后待细胞贴壁后，给药。每孔加入上述配制好的go-pll母液或go-pll-rgds母液25μl，使加入的go-pll-rgds或go-pll的终浓度是10，20，40，60，80，100，150μg/ml，每个浓度设6个复孔，空白背景组和空白对照对照组补加25μldepc水。37℃、5％co2条件下继续培养48h。48h后，每孔加25μlmtt工作液，左右前后摇晃均匀，37℃孵育4h。4h后4000g离心10分钟。小心吸出每孔培养基。每孔加入dmso150μl，用微型振荡器震荡(500r，10min)。在酶标仪上，以检测波长为570nm测定吸光度(od)值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)×100％。上述实验重复三次。
4)go-pll-rgds/vegf-sirna抑制hela细胞增殖的作用
取对数期hela细胞，计数，用完全培养基调整细胞浓度至4×104个/ml。96孔板用pbs液封，每孔取100μl细胞悬液种板，37℃、5％co2培养。12h后，待细胞贴壁，小心吸出完全培养基，每孔加入100μl无血清培养基。然后，每孔分别加入25μl配制不同浓度的的go-pll-rgds、vegf-sirna、go-pll-rgds/非同源-sirna、lipo/非同源-sirna、lipo/vegf-sirna和go-pll-rgds/vegf-sirna进行转染，各组终浓度分别为10，40，80，120nm(按sirna计)。转染6h后，各孔换成等体积完全培养基，继续培养42h。每孔加25μl的mtt工作液，左右前后摇晃均匀，37℃孵育4h。4h后4000g离心10分钟。小心吸出每孔培养基。每孔加入dmso150μl，用微型振荡器震荡500r，15min。在酶标仪上，以检测波长为570nm测定吸光度(od)值，计算细胞存活率。上述实验重复三次。
实验结果
1.go-pll-rgds的细胞毒性评价
理想的基因载体不仅要有效，同样重要的是低毒性。通过mtt法对go-pll-rgds和中间物go-pll的细胞毒性进行评价。结果如图8所示，当go-pll-rgds的浓度增加至150μg/ml时，其细胞存活率扔在85％以上，为表现出明显的细胞毒性。而同浓度的go-pll处理过的细胞，存活率比go-pll-rgds组低，并且当浓度增加至60，80，100，150μg/ml时，二者之间有显著性差异(p<0.05)，即go-pll的细胞毒性大于go-pll-rgds。有文献报道，正电性的纳米载体可以与细胞膜表面负电性的糖蛋白相互作用，从而表现出细胞毒性；并且通过修饰中和纳米载体的正电性，可以减小其细胞毒性。在上述章节中，我们已经测得go-pll-rgds的zeta电位值(25.87±0.47mv)明显小于go-pll的zeta电位值(40.20±4.89mv)，即经过rgds的修饰，使pll上的氨基减少，中和了go-pll上部分的正电荷。
2.go-pll-rgds/vegf-sirna的抑制hela细胞增殖的作用
从图9可以得出：
1.不同浓度的vegf-sirna与空白对照组相比，细胞存活率未表现出显著性差异，即vegf-sirna对细胞增殖无抑制作用。
2.不同浓度的go-pll-rgds、go-pll-rgds/非同源-sirna和lipo(lipornaimax)/非同源-sirna与空白对照比较，虽然表现出差异(p<0.05)，但是细胞存活率均在80％以上，对细胞增殖无明显抑制作用。
3.阳性对照组lipo(lipornaimax)/vegf-sirna与空白对照组相比，有显著性差异(p<0.01)，表现出明显的抑制细胞增殖的作用。验证了实验方法的正确性。
4.10nm的go-pll-rgds/vegf-sirna与空白对照组比较，细胞存活率表现出显著性差异(p<0.05)，并且随着浓度的增加，其细胞存活率逐渐降低，即抗细胞增殖作用呈现一定范围的剂量依赖性。
实施例8评价go-pll-rgds/vegf-sirna抑制荷s180肉瘤小鼠肿瘤生长的作用
1)肿瘤生长抑制作用
实验方法
1.给药剂量
空白对照生理盐水(ns)组：0.2ml/只；
阴性对照游离vegf-sirna组：0.3mg/kg；
阳性对照阿霉素(dox)组：2μmol/kg；
实验组go-pll-rgds/vegf-sirna：0.3mg/kg(按vegf-sirna计)；3.0mg/kg(按go-pll-rgds计)。
2.给药方式
尾静脉注射，隔天一次，共给药5次。
3.荷s180肉瘤小鼠模型的建立
将0.2ml浓度为1×107个/ml的s180细胞悬液接种于每只小鼠左腋皮下，建立荷s180肉瘤小鼠模型。小鼠饲养环境整洁卫生，5只一笼，温度为18-22℃，湿度为50-60％，饮食充足且自由。隔天测量小鼠的瘤体积，饲养7天，此时小鼠的瘤体积(长×宽2/2)约为350mm3。实验动物icr小鼠雄性，体重20±2g(x±sd)，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供。
4.评价
将建模成功的小鼠随机分成四组，每组10只，隔天称量体重和瘤体积。并按上述剂量和方法分别给予生理盐水(ns)、游离vegf-sirna、阿霉素、go-pll-rgds/vegf-sirna。在最后一次给药结束后的次日，首先称重，然后进行脱颈椎处死小鼠，眼球取血2ml/只，每组取6只小鼠。室温静置1h，待析出血清后离心(4℃，4000g，10min)，取上清得血清样品，-80℃保存。取脏器(瘤、心、肝、脾、肾、脑)，称其重量，计算抑瘤率和脏体比，并做记录。脏器置于-80℃保存。
抑瘤率(％)＝[(生理盐水组平均瘤重－给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重]×100％，脏器指数＝脏器重/处死前体重。数据统计均采用t检验和方差分析。
实验结果各组瘤重及抑瘤率结果如图10所示，a中是各组小鼠解剖后取出的移植瘤图片，可直观得看出实验组go-pll-rgds/vegf-sirna组的小鼠的肉瘤体积比空白对照生理盐水组小，比阴性对照组游离vegf-sirna组的肉瘤体积小。b中是各组的平均瘤重(g)，c是各组的抑瘤率。结果表明游离vegf-sirna组的平均瘤重与空白对照组比较，无显著性差异(p>0.05)。go-pll-rgds/vegf-sirna组的平均瘤重与空白对照生理盐水组和阴性对照游离vegf-sirna组比较，有显著性差异(p<0.01)，抑瘤率为51.74％，其抑瘤率略小于化疗药dox(56.23％)。上述结果说明游离的vegf-sirna不能有效抑制肿瘤的生长，而go-pll-rgds/vegf-sirna则可有效抑制肿瘤生长，表现出体内抗肿瘤活性。
2)各组荷瘤小鼠血清中vegf的表达水平
实验方法取上述获得的小鼠血清样品，室温融化，按mus-vegf-elisakit说明描绘标准曲线并测定血清中的vegf蛋白含量。
实验结果按照说明配制一系列浓度的标准蛋白液，测定其吸收值，绘制标准曲线如下：回归方程为y＝0.0096x+0.1278(r2＝0.999)。各组荷瘤小鼠血清中vegf的绝对含量结果如下表所示：go-pll-rgds/vegf-sirna组的小鼠血清中的vegf含量为61.44±2.62pg/ml，明显低于空白对照组和游离的vegf-sirna组。结果说明，go-pll-rgds/vegf-sirna可以有效下调小鼠体内的vegf蛋白的表达量，即有效使vegf-sirna发挥基因沉默作用。这与体外结果与讨论相吻合。
表1.各组小鼠血清中vegf含量(均值±sd,pg/ml)
实施例9评价go-pll-rgds/vegf-sirna的肿瘤靶向性作用—荧光成像法测定go-pll-rgds/vegf-sirna的组织分布
实验方法：
1.荷s180肉瘤小鼠模型的建立
将0.2ml浓度为1×107个/ml的s180细胞悬液接种于每只小鼠左腋皮下，建立荷s180肉瘤小鼠模型。小鼠饲养环境整洁卫生，5只一笼，温度为18-22℃，湿度为50-60％，饮食充足且自由。
2.给药
随机将建模成功的小鼠分为3组，每组3只。分别按照以下剂量尾静脉注射给药，给药一次。
生理盐水组：0.2ml/只
cy3-vegf-sirna组：0.3mg/kg
go-pll-rgds/cy3-vegf-sirna组：0.3mg/kg(按cy3-vegf-sirna计)；3.0mg/kg(按go-pll-rgds计)，配制方法如2.1.3所述。
3.荧光成像观察
给药24h后，将小鼠处死，取出各脏器，注意避光。置于荧光成像仪下观察并定量计算各脏器的荧光强度值。激发波长为550nm，发射波长为570nm。注：12h时先用6％水合氯醛0.2ml/只腹腔注射将小鼠麻醉，然后活体成像，观察荧光。结果由于体毛影响造成无法成像，之后将其腹部的体毛剃掉，置于荧光成像仪下，结果仍看不到荧光图像。分析原因：可能由于cy3的荧光强度较弱，小鼠皮肤及组织较厚。所以采取处死小鼠后直接取出脏器后观察这一方法。注：cy3荧光染料是一种常用于生物分子标记的水溶性染料。
实验结果如图11a所示，生理盐水组的各器官观察不到荧光，游离的cy3-vegf-sirna组中，在肿瘤、肝、肺、肾以及脑中均可观察到较弱的荧光，并且肿瘤部位的荧光强度并不比其他脏器的荧光强度强。这是由于游离的cy3-vegf-sirna容易被酶解失活，并较快地排出体外。而go-pll-rgds/cy3-vegf-sirna组中，肿瘤部位的荧光强度明显强于其他脏器，并且，在脑中未观察到荧光。另外，肾脏的荧光强度较其他器官的荧光强度强，go-pll-rgds/cy3-vegf-sirna可能通过肾脏排泄，从而在肾脏有蓄积。肺部的荧光面积较游离的cy3-vegf-sirna组肺部荧光面积大，与部分氧化石墨烯会沉积在肺部有关。b中，将荧光强度值量化，可以得出同样的结果。go-pll-rgds/cy3-vegf-sirna在肿瘤部位的荧光强度值是肾脏的2.34倍。综上说明给药24h后，go-pll-rgds/cy3-vegf-sirna大部分在肿瘤组织分布，其次是在肾脏分布，可能与代谢排泄途径有关；另外在肝脏和肺部也有少量分布。这一结果证明了go-pll-rgds/cy3-vegf-sirna具有肿瘤靶向性。
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