专利名称：菌种诱变仪以及利用其复合诱变放射形根瘤菌的方法
技术领域：
本发明属于菌种诱变，特别是指一种菌种诱变仪以及利用其复合诱变放射形根瘤菌的方法。
背景技术：
微生物正常状态下发生基因突变的机率为10_6，发生正向突变的机率更低。采用单一的物理诱变方法对微生物突变产生的效应小，两种或两种以上的物理诱变方法复合使用对微生物突变产生的效应大。专利号为03218655. x的实用新型专利中公开了一种诱变接种两用箱，该实用新型通过外接的磁力搅拌器对其内部的菌种实现单一物理方法的诱变， 其强度不易实现调整和控制，且诱变效果不明显。放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的菌种，申请号为201110219188. 5的发明专利申请中公开可以利用该菌种生产可得然胶，但利用该菌种生产可得然胶发酵液中可得然胶的固含量较低。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种菌种诱变仪，本发明的目的之二是提供利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的方法，通过采用紫外灯光照、外加强度可调的磁场、使用红外线灯提高菌种诱变环境温度、以及利用药物诱变对放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031进行诱变，达到提高突变效应，提高突变后菌种的产胶率的目的。
保藏编号为CGMCCNo. 5031的放射形根瘤菌已于2011年7月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号， 该诱变株的分类命名为放射性根瘤菌(Rhizobium radiobacter)。本发明的目的之一是这样实现的
菌种诱变仪，包括箱体、封装于箱体前部的箱门、设置于箱体外部的箱盖；电路部分包括电源、紫外灯管、红外线灯、变压器、电感线圈、滑动变阻器以及显示仪表，紫外灯管、红外线灯和变压器初级线圈并联后分别接于电源两端，变压器次级线圈经滑动变阻器与电感线圈构成回路，显示仪表联接于回路中；其中紫外灯管、红外线灯设于箱体内部上方；显示仪表包括串联设置于回路中的电流表，分别联接于电感线圈首尾两端的电压表；电源选用220V交流电源，电感线圈用直径O. 5毫米铜导线、缠绕匝数为1000，紫外灯管的波长为 260nm，红外线灯的功率为35W。本发明的第二个目的是这样实现的
利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的方法，由如下工艺步骤组
成
A、化学诱变
将放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031试管菌种斜面接种于装有灭菌后的150-200ml培养基的三角瓶中，进行摇床培养得到菌悬液，摇瓶培养的条件为转速200-220转/分钟，温度36-38°C，培养时间20-24小时；
摇瓶培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖O. 5%-1%、蛋白肽O. 1%-0. 3%、磷酸氢二钾O. 15%-0. 25%、磷酸二氢钾
O.05%-0. 1%、生物素 5ppm-10ppm、5-溴尿嘧啶 O. 005%-0. 01%、利福平 O. 0005%-0. 001%、余量为无菌水，pH=6-7 ；
B、磁光热药复合诱变 BI、培养平板的制备
将步骤A中制备的菌悬液稀释后，取O. 1-0. 15ml均匀涂覆在盛有固体培养基的培养皿表面，固体培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖O. 5%-1%、花生饼粉O. 1%-0. 3%、蛋白胨O. 1%-0. 3%、磷酸氢二钾O. 08%-0. 1%、 磷酸二氢钾O. 02%-0. 04%、生物素20ppm-30ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%-0. 01%、利福平 lppm-1. 5ppm、琼脂 I. 5%-2. 0%、余量为无菌水，pH=6_7 ；
B2、复合诱变
开启菌种诱变仪预热，打开红外线灯D3使箱体内温度保持至36-38°C ;打开紫外灯管 D2，然后调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O. 6A，紫外照射30秒后关闭紫外灯管 D2 ；72小时时，调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O刻度，关闭红外线灯D3 ;将培养皿包扎严密后取出，倒置放置于培养箱中36-38°C培养86-96小时得到该菌种的诱变株。申请人:已于2012年3月6日将该诱变株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，该诱变株的分类命名为放射性根瘤菌rat/ioAacier),保藏编号为CGMCCNo. 5848。本发明的具体技术构思还有
为便于进行箱体内的菌种诱变操作，观察操作过程中培养容器中的菌落形态，优选的技术方案是在箱体内部上方还设一照明灯，该照明灯与紫外灯管、红外线灯、变压器初级线圈并联后接于电源两端。为便于对电感线圈所在的回路中的电流和电压情况进行观察和控制，优选的技术方案是电压表和电流表设于箱盖表面，变压器、滑动变阻器、电感线圈、电源设于箱体一侧外部的箱盖内。电感线圈可以根据实际情况选用包括铁氧体线圈、铁芯线圈等多种现有的形式， 并不脱离本发明的实质。其中优选的技术方案是采用铁芯线圈。为便于对滑动变阻器进行控制，以有效改变电感线圈所产生的磁场强度，优选的设计方案是滑动变阻器的滑动端与位于箱盖表面的控制手柄联连。所述的步骤BI中的菌悬液稀释是将步骤A中制备的菌悬液稀释为体积比为10, 的菌悬液。优选的稀释方法是，稀释是按照体积比为1:10的比例依次将步骤A中制备的菌悬液稀释为体积比为10_10的菌悬液，即依次稀释为10' 10_2、10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8、 10'I (Tici。可以显而易见的是，步骤B2中对培养皿的包扎可以选用多种现有不透气的遮光材料(如牛皮纸、遮光膜等等)，以避免外界环境对培养皿内菌种的影响。其中较为优选且常见的是，步骤B2中采用牛皮纸将培养皿包扎严密。诱变后菌种发酵制备可得然胶固形物的检测(一)发酵液制备
将诱变后的放射形根菌CGMCC NO. 5031试管斜面I支，无菌操作接种于装有灭菌好的 150-200ml培养基的三角瓶中进行摇床培养制成摇瓶种子，培养条件为转速200-220转/ 分钟，温度36-38°C，培养时间20-24小时。摇瓶培养的培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖O. 5%-1%、蛋白肽O. 1%-0. 3%、磷酸氢二钾O. 15%-0. 25%、磷酸二氢钾 O. 05%-0. 1%、生物素 5ppm-10ppm、pH=6-7、余量为无菌水。将培养好摇瓶种子按照质量百分比为5-10%的接种量接入灭菌后的发酵培养基中进行摇床培养发酵，发酵条件为转速200-220转/分钟，温度36-38°C，培养时间90-96 小时，制得发酵液。发酵培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖10%-12%、硝酸钠O. 3%-0. 45%、磷酸氢二钾O. 1%-0. 2%、磷酸二氢钾O. 15%-0. 3%、 FeSO4 10ppm-15ppm、生物素20ppm-30ppm、聚醚消泡剂O. 03%-0. 1%、余量为无菌水；
(二)检测
对发酵液中可得然胶的含量采用如下检测方法
将发酵液倒入一定体积的小烧杯中，用玻璃棒搅拌使其无气泡，用玻璃棒把表面抹平， 把杯子外的发酵液清洗干净。发酵液用质量百分比为90-95%的乙醇提取、沉降、过滤布挤干，将其撕碎后全部彻底移入到培养皿中，在微波炉小火烘3分钟，然后放入100±5°C烘箱中烘至恒重(约4小时)，拿出称重。(三)计算
固形物含量(g/L)=(称样克数/发酵液体积)X 100%
经检测计算，检测固含量最高可达96克/升，而现有的菌种在培养温度为30-33°C时发酵液中可得然胶的固含量为78克/升。本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于
I、本发明巧妙的将紫外灯光照、磁场和使用红外线灯提高菌种诱变环境温度三种物理诱变方法结合于菌种诱变仪上，其结构设计简单有效，对菌种诱变机率大。2、由于电感线圈L所产生的磁场强度、紫外灯的照射强度以及提高菌种诱变环境温度的调整，均可以实现较为准确的控制，从而可以科学的对菌种诱变的成因进行分析，为科学实验奠定了基础，同时可以有效缩短实验的进程，有助于菌种诱变的工业化生产。3、采用磁光热药对放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031进行复合诱变，有效提高了诱变后菌种的产胶率，为工业化生产中可得然胶固形物收率的提高提供了有效的技术支撑。
图I是本发明的结构示意图。图2是本发明的电路图。图3是图I的后视图。本发明中的附图标记如下
I、箱盖；2、箱体；3、箱门；4、控制手柄；A、电流表；D1、照明灯；D2、紫外灯管;D3、红外线灯；L、电感线圈；L1、初级线圈；L2、次级线圈；R、滑动变阻器；T、变压器；V、电压表。该放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的诱变株申请人已于2012年3月6日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，该诱变株的保藏编号为 CGMCCNo. 5848。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本说明书所做出的等效技术手段替换均不脱离本发明的保护范围。实施例I
本实施例中菌种诱变仪整体技术构造如图所示，其中包括箱体2、封装于箱体2前部的箱门3、设置于箱体2外部的箱盖I ;电路部分包括电源、紫外灯管D2、红外线灯D3、变压器 T、电感线圈L、滑动变阻器R以及显示仪表，紫外灯管D2、红外线灯D3和变压器初级线圈LI 并联后分别接于电源两端，变压器次级线圈L2经滑动变阻器R与电感线圈L构成回路，显示仪表联接于回路中；其中紫外灯管D2、红外线灯D3设于箱体2内部上方，变压器T、滑动变阻器R、电感线圈L、电源设于箱体2 —侧外部的箱盖I内；显示仪表包括串联设置于回路中的电流表A，分别联接于电感线圈L首尾两端的电压表V ;电源选用220V交流电源，电感线圈L用直径O. 5毫米铜导线、缠绕匝数为1000，紫外灯管D2的波长为260nm，红外线灯D3 的功率为35W。在箱体2内部上方还设一照明灯D1，该照明灯Dl与紫外灯管D2、红外线灯D3、变压器初级线圈LI并联后接于电源两端。电压表V和电流表A设于箱盖I表面。电感线圈L采用铁芯线圈。滑动变阻器R的滑动端与位于箱盖I表面的控制手柄4联连。利用磁光热复合菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的方法，由如下工艺步骤组成
A、化学诱变
将放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031试管菌种斜面接种于装有灭菌后的150ml培养基的三角瓶中，进行摇床培养得到菌悬液，摇瓶培养的条件为转速200转/分钟，温度36°C，培养时间20小时；
摇瓶培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖O. 5%、蛋白肽O. 1%、磷酸氢二钾O. 15%、磷酸二氢钾O. 05%、生物素5ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%、利福平O. 0005%、余量为无菌水，pH=6-7 ；
B、磁光热药复合诱变 BI、培养平板的制备
将步骤A中制备的菌悬液稀释后，取O. 1-0. 15ml均匀涂覆在盛有固体培养基的培养皿表面，固体培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖O. 5%、花生饼粉O. 1%、蛋白胨O. 1%、磷酸氢二钾O. 08%、磷酸二氢钾O. 02%、生物素20ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%、利福平I. 5%、余量为无菌水，pH=6_7 ；B2、复合诱变
开启菌种诱变仪预热，打开红外线灯D3使箱体内温度保持至36°C ;打开紫外灯管D2， 然后调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O. 6A，紫外照射30秒后关闭紫外灯管D2 ； 72小时时，调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O刻度，关闭红外线灯D3 ;将培养皿包扎严密后取出，倒置放置于培养箱中36°C培养86小时。所述的步骤BI中的菌悬液稀释是将步骤A中制备的菌悬液稀释为体积比为10, 的菌悬液。优选的稀释方法是，稀释是按照体积比为1:10的比例依次将步骤A中制备的菌悬液稀释为体积比为10_10的菌悬液，即依次稀释为10' 10_2、10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8、 10'I (Tici。步骤B2中采用牛皮纸将培养皿包扎严密。实施例2
本实施例中菌种诱变仪的结构同实施例I，利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌 CGMCC NO. 5031的方法，由如下工艺步骤组成
A、化学诱变
将放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031试管菌种斜面接种于装有灭菌后的200ml培养基的三角瓶中，进行摇床培养得到菌悬液，摇瓶培养的条件为转速220转/分钟，温度38°C，培养时间24小时；
摇瓶培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖1%、蛋白肽O. 3%、磷酸氢二钾O. 25%、磷酸二氢钾O. 1%、生物素10ppm、5-溴尿嘧啶O. 01%、利福平O. 001%、余量为无菌水，pH=6-7 ；
B、磁光热药复合诱变 BI、培养平板的制备
将步骤A中制备的菌悬液稀释后，取O. 15ml均匀涂覆在盛有固体培养基的培养皿表面，固体培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖1%、花生饼粉O. 3%、蛋白胨O. 3%、磷酸氢二钾O. 1%、磷酸二氢钾O. 04%、生物素 30ppm、5-溴尿嘧啶O. 01%、利福平L 5ppm、琼脂2. 0%、余量为无菌水，pH=6_7 ；
B2、复合诱变
开启菌种诱变仪预热，打开红外线灯D3使箱体内温度保持至38°C ;打开紫外灯管D2， 然后调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O. 6A，紫外照射30秒后关闭紫外灯管D2 ； 72小时时，调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O刻度，关闭红外线灯D3 ;将培养皿包扎严密后取出，倒置放置于培养箱中38°C培养96小时。其余步骤同实施例I。实施例3
本实施例中菌种诱变仪的结构同实施例1，利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌 CGMCC NO. 5031的方法，由如下工艺步骤组成
A、化学诱变
将放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031试管菌种斜面接种于装有灭菌后的180ml培养基的三角瓶中，进行摇床培养得到菌悬液，摇瓶培养的条件为转速210转/分钟，温度37°C，培养时间22小时；
8摇瓶培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖O. 8%、蛋白肽O. 2%、磷酸氢二钾O. 2%、磷酸二氢钾O. 08%、生物素8ppm、5-溴尿嘧啶O. 007%、利福平O. 0008%、余量为无菌水，pH=6-7 ；
B、磁光热药复合诱变 BI、培养平板的制备
将步骤A中制备的菌悬液稀释后，取O. 13ml均匀涂覆在盛有固体培养基的培养皿表面，固体培养基由如下质量百分数的组分组成
葡萄糖O. 8%、花生饼粉O. 2%、蛋白胨O. 2%、磷酸氢二钾O. 09%、磷酸二氢钾O. 03%、生物素25ppm、5-溴尿嘧啶O. 008%、利福平I. 2ppm、琼脂I. 8%、余量为无菌水，pH=6_7 ；
B2、复合诱变
开启菌种诱变仪预热，打开红外线灯D3使箱体内温度保持至37°C ;打开紫外灯管D2， 然后调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O. 6A，紫外照射30秒后关闭紫外灯管D2 ； 72小时时，调节滑动变阻器R旋钮使电流表A指针指向O刻度，关闭红外线灯D3 ;将培养皿包扎严密后取出，倒置放置于培养箱中37°C培养90小时。其余步骤同实施例I。
权利要求
1.菌种诱变仪，包括箱体(2)、封装于箱体(2)前部的箱门(3)、设置于箱体(2)外部的箱盖(I);电路部分包括电源、紫外灯管(D2)、红外线灯(D3)、变压器(T)、电感线圈(L)、滑动变阻器(R)以及显示仪表；其特征在于紫外灯管(D2)、红外线灯(D3)和变压器初级线圈 (LI)并联后分别接于电源两端，变压器次级线圈(L2)经滑动变阻器(R)与电感线圈(L)构成回路，显示仪表联接于回路中；其中紫外灯管(D2)、红外线灯(D3)设于箱体(2)内部上方，显示仪表包括串联设置于回路中的电流表(A)，分别联接于电感线圈(L)首尾两端的电压表(V);电源选用220V交流电源，电感线圈(L)用直径O. 5毫米铜导线、缠绕匝数为1000， 紫外灯管(D2)的波长为260nm，红外线灯(D3)的功率为35W。
2.根据权利要求I所述的菌种诱变仪，其特征在于在箱体(2)内部上方还设一照明灯 (D1)，该照明灯(Dl)与紫外灯管(D2)、红外线灯(D3)、变压器初级线圈(LI)并联后接于电源两端。
3.根据权利要求I所述的菌种诱变仪，其特征在于变压器(T)、滑动变阻器(R)、电感线圈(L)、电源设于箱体(2) —侧外部的箱盖(I)内，电压表(V)和电流表(A)设于箱盖(I)表面。
4.根据权利要求I所述的菌种诱变仪，其特征在于电感线圈(L)选用铁芯线圈。
5.根据权利要求I所述的菌种诱变仪，其特征在于滑动变阻器(R)的滑动端与位于箱盖(I)表面的控制手柄(4)联连。
6.一种利用如权利要求1-5所述的利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌的方法，其特征在于由如下工艺步骤组成A、化学诱变将放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031试管菌种斜面接种于装有灭菌后的150-200ml培养基的三角瓶中，进行摇床培养得到菌悬液，摇瓶培养的条件为转速200-220转/分钟，温度 36-38°C，培养时间20-24小时；摇瓶培养基由如下质量百分数的组分组成葡萄糖O. 5%-1%、蛋白肽O. 1%-0. 3%、磷酸氢二钾O. 15%-0. 25%、磷酸二氢钾 O. 05%-0. 1%、生物素 5ppm-10ppm、5-溴尿嘧啶 O. 005%-0. 01%、利福平 O. 0005%-0. 001%、余量为无菌水，pH=6-7 ；B、磁光热药复合诱变BI、培养平板的制备将步骤A中制备的菌悬液稀释后，取O. 1-0. 15ml均匀涂覆在盛有固体培养基的培养皿表面，固体培养基由如下质量百分数的组分组成葡萄糖O. 5%-1%、花生饼粉O. 1%-0. 3%、蛋白胨O. 1%-0. 3%、磷酸氢二钾O. 08%-0. 1%、 磷酸二氢钾O. 02%-0. 04%、生物素20ppm-30ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%-0. 01%、利福平 lppm-1. 5ppm、琼脂 I. 5%-2. 0%、余量为无菌水，pH=6_7 ；B2、复合诱变开启磁光热复合菌种诱变仪预热，打开红外线灯(D3)使箱体内温度保持至36-38°C;打开紫外灯管(D2)，然后调节滑动变阻器(R)旋钮使电流表(A)指针指向O. 6A，紫外照射30 秒后关闭紫外灯管(D2 );72小时时，调节滑动变阻器(R)旋钮使电流表(A)指针指向O刻度， 关闭红外线灯(D3);将培养皿包扎严密后取出，倒置放置于培养箱中36-38°C培养86-96小时。
7.根据权利要求6所述的利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌的方法，其特征在于所述的步骤BI中的菌悬液稀释是将步骤A中制备的菌悬液稀释为体积比为10,的菌悬液。
8.根据权利要求6所述的利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌的方法，其特征在于所述的稀释是按照体积比为1:10的比例依次将步骤A中制备的菌悬液稀释为体积比为I。-10 的菌悬液，即依次稀释为 ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο,。
9.根据权利要求6所述的利用菌种诱变仪复合诱变放射形根瘤菌的方法，其特征在于所述的步骤B2中采用牛皮纸将培养皿包扎严密。
全文摘要
本发明属于菌种诱变，特别是指一种菌种诱变仪以及利用其复合诱变放射形根瘤菌的方法。菌种诱变仪包括箱体、箱门、箱盖；电路部分包括电源、紫外灯管、红外线灯、变压器、电感线圈、滑动变阻器以及显示仪表，紫外灯管、红外线灯和变压器初级线圈并联后分别接于电源两端，变压器次级线圈经滑动变阻器与电感线圈构成回路，显示仪表联接于回路中，采用上述诱变仪对放射形根瘤菌CGMCCNO.5031进行复合诱变。本发明解决了现有技术存在解决了现有设备中诱变效果不明显、菌种产胶率低的问题，具有复合诱变仪可有效提高菌种诱变机率、诱变后的菌种产胶率得到明显提高等优点。
文档编号C12N13/00GK102586102SQ20121006054
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者张星昊 申请人:张星昊