专利名称：一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法
技术领域：
本发明涉及一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法，属于细胞工程和组织工程领域。
背景技术：
从脂肪组织中分离培养的细胞多称为“前体脂肪细胞”。前体脂肪细胞是一类具有增殖分化能力的脂肪细胞前体，在体内多种因素的影响下聚脂分化而成为成熟脂肪细胞。 目前报道培养成功的前体脂肪细胞主要来源于人、鼠、猪等。Aso等在1995年于牛肌细胞间 SV(stromal vascular)细胞培养物中分离克隆出前体脂肪细胞系。近年来，国内一些实验室也陆续对牛脂肪细胞展开了研究。目前所用的培养方法主要有组织块培养法和传统消化培养法。采用组织块培养法时，需先将脂肪组织用眼科剪刀剪至每块约Imm3大小，然后用玻璃细管接种到培养瓶内，3-4天后有少量细胞游离出来贴壁生长，约10-12天后有80-90% 细胞贴壁，因此，此培养方法所需时间较长、人力较多。而采用传统消化培养法时，也需先将脂肪组织用眼科剪刀剪至每块约Imm3大小，然后加入胶原酶I在37°C培养箱内消化30分钟，之后离心洗涤，最后接种到培养瓶内。培养1天后有少量细胞开始贴壁生长，7-8天后约有80-90%细胞贴壁，因此，该方法较组织块培养法省时间，但在剪碎组织时同样很费人力。
发明内容
为了克服上述两种培养方法存在的技术缺陷，本发明旨在提供一种简单高效、节省时间和人力、可重复性强的牛前体脂肪细胞体外培养方法。本发明基于传统消化培养方法，利用组织勻浆机结合胶原酶I培养基处理脂肪组织，采用含胎牛血清的DMEM/F12培养液对牛前体脂肪细胞进行体外培养，成功建立了牛前体脂肪细胞体外培养的新模型，极大的缩短了试验样品处理的时间，且获得细胞形态最好，培养及提取RNA效率最高，是一种更为便捷、长期高效的前体脂肪细胞培养方法。通过体外培养牛前体脂肪细胞，可深入了解脂肪细胞的增殖分化规律，为后续深入研究前体脂肪细胞增殖分化过程中基因、蛋白的表达及信号通路奠定基础。且为调控肉牛体脂沉积、预防奶牛围产期和泌乳高峰期疾病(酮病、 脂肪肝)等提供新思路和新方法。本发明的技术方案是一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法，其特征是， 利用牛皮下脂肪细胞在体外通过改良消化法进行培养，继而获得牛前体脂肪细胞；具体如下(1)试剂0. 胶原酶I培养基将IOOmg胶原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5. 6% NaHCO3溶液调节PH值至7. 2 7. 4，经0. 22微米过滤器过滤、分装，_20°C保存备用。细胞培养液在DMEM/F12液中添加其体积10%的胎牛血清，经0. 22微米过滤器过滤、分装，4°C保存备用。(2)牛前体脂肪细胞的原代培养
a无菌条件下取牛皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5 8次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；b然后剪切组织块至8 IOmm3小块，用组织勻浆机180 200r/min勻浆至乳糜状；继而加入0. 胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次；C经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min ；弃去离心后的上清液，加入细胞培养液清洗1次， 2000r/min离心lOmin，制成细胞悬液，显微镜下计数，以5X 104cells/mL接种细胞至培养皿或培养瓶，置入37 °C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。本发明工艺先进简单、培养基配制科学合理。采用0. 胶原酶I和含胎牛血清的DMEM/F12液对牛皮下脂肪细胞在体外通过改良消化法进行培养，继而获得牛前体脂肪细胞。本发明通过体外改良消化法培养牛前体脂肪细胞，成功建立了牛前体脂肪细胞体外培养的新模型，极大的缩短了试验样品处理的时间，且获得细胞形态最好，培养及提取 RNA效率最高，是一种更为便捷、长期高效的前体脂肪细胞培养方法。为后续深入研究前体脂肪细胞增殖分化过程中基因、蛋白的表达及信号通路奠定基础，为调控肉牛体脂沉积、预防奶牛围产期和泌乳高峰期疾病(酮病、脂肪肝)等提供新思路和新方法。
图1为三种方法培养的前体脂肪细胞图片；图1中A、B.组织块法培养的前体脂肪细胞，C、D.传统消化法培养的前体脂肪细胞，Ε、F.改良消化法培养的前体脂肪细胞；Α.前体脂肪细胞培养4d，C、E.前体脂肪细胞培养2d，B、D、F.前体脂肪细胞培养8d。图2为MTT法检测传统消化法和改良消化法对牛前体脂肪细胞增殖的影响(n = 3)图片；图3为油红O染色后的脂肪滴(Χ200)图片；图3中a.组织块培养法培养的脂肪细胞，b.传统消化法培养的脂肪细胞，c.改良消化法培养的脂肪细胞。图4为脂肪细胞中总RNA的琼脂糖电泳图片；图4中1、2.改良消化法，3、4.组织接种法，5、6.传统消化法。图5为牛IGF-I基因的RT-PCR结果图片。图5中1、2.改良消化法，3、4.组织接种法，5、6.传统消化法。
具体实施例方式实施例1(1)试剂0. 1 %胶原酶I培养基将IOOmg胶原酶I溶解于100毫升D-Hanks液(型号 91105B-100，上海宝曼生物科技有限公司生产)中，用5.6%妝!10)3溶液调节PH值至7. 2 7. 4，经0. 22微米过滤器过滤、分装，_20°C保存备用。细胞培养液在DMEM/F12液(型号D6421，Sigma公司生产)中添加其体积10% 的胎牛血清，经0. 22微米过滤器过滤、分装，4°C保存备用。(2)牛前体脂肪细胞的原代培养
a无菌条件下取牛皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗6次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；b然后剪切组织块至9mm3小块，用组织勻浆机180 200r/min勻浆至乳糜状；继而加入0. 胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次；c经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min ；弃去离心后的上清液，加入细胞培养液清洗1次，2000r/min离心lOmin，制成细胞悬液，显微镜下计数，以5X 104cells/mL接种细胞至培养皿或培养瓶，置入37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。其培养效果如下1.牛前体脂肪细胞形态学观察图1中组织接种后，第4d观察到少量梭形细胞游离出脂肪组织边缘(图1，A)，第7d时前体脂肪细胞开始大量增殖，呈梭形，至8d(汇合占底面积70%以上(图1，B)。改良消化法与传统消化法获得的细胞刚接种时胞质回缩成小圆球形，为悬浮状态，接种24h后可见部分细胞开始贴壁，呈不规则的三角形。培养4 后贴壁细胞开始伸展变形，大多数呈狭长梭形的成纤维样细胞形态(图1，C、E)。第8d细胞汇合达到80%以上(图1，D、F)。2. MTT法检测牛前体脂肪细胞的增殖活性。以IOVcm2密度将传统消化法和改良消化法所得前体脂肪细胞接种于96孔培养板，在培养的2、4、6、8、IOd加入MTT，490nm波长酶联检测仪测定各孔吸光度值。图2中利用MTT法绘制的牛前体脂肪细胞生长曲线类似S型，符合体外培养细胞的正常生长增殖规律，即先进入缓慢的潜伏生长期(约40h)，随后到指数生长期(4-10d)。改良消化法前体脂肪细胞的后期增殖活性高于传统消化法。3.油红O染色法检测牛前体脂肪细胞分化图3中在前体脂肪细胞生长至汇合状态后更换为诱导分化培养液(在DMEM/F12液中添加0. 5% BSA、10 μ g/mL转铁蛋白、17 μ M生物素、100 μ M泛酸钙盐、10 μ g/mL牛胰岛素、0. 5mM ΙΒΜΧ,Ο. 25 μ M DEX，混勻后用IM NaOH调节PH值至7. 2_7. 4，经0. 22微米滤器过滤、分装，4°C保存备用)中进行诱导分化培养。诱导第2d细胞胞质内开始有小脂滴出现，至第6d时，胞质内小脂滴明显增多，并且有少数开始融合成大脂滴。诱导分化后的脂肪细胞培养12d结束，按油红O染色法鉴定脂肪细胞倾去培养液，PBS洗细胞2次，10%甲醛固定lh, PBS洗2次，油红O染色20min，PBS洗2次，稍干后以甘油明胶封固观察拍照。图3显示，三种培养方法的细胞形态学观察结果基本一致，而改良消化法培养得到的脂肪滴最多。4.脂肪细胞RNA质量检测培养的脂肪细胞，倾去培养液，加入Trizol吹打并收集细胞，提取RNA，RT-PCR扩增IGF-I基因检测RNA质量。引物设计根据Ge et al (2001)，由博尚生物技术有限公司(上海)合成。上游引物 forward-ATT ACA AAG CTGCCT GCC CC(SEQ-I)；下游引物:Reverse-ACC TTA CCC GTA TGA AAG GAATAT ACG T (SEQ-2)；产物长度 249bp ；反应条件为940C 4min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 31 个循环，72°C 10min，4°C 30min。从细胞中提取用于IGF-I基因RT-PCR分析的总RNA检测结果见图4。从图4中可见，总RNA在凝胶上显示出两条清晰的和一条较浅的条带，分别为^S、18S和5S rRNA。28S和18S rRNA条带亮度的比值均大于1. 5倍，表明总RNA无降解。总RNA的0D260值与0D280值的比值均在1. 8 2. O之间，表明无蛋白质和其它杂质污染。因此，提取的RNA质量完好。由图5IGF-1基因的RT-PCR电泳可见，三种方法均能扩增出目的基因，且改良消化法扩增效果要好于另两种方法。
权利要求
1. 一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法，其特征是，a无菌条件下取牛皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5 8次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；b然后剪切组织块至8 IOmm3小块，用组织勻浆机180 200r/min勻浆至乳糜状；继而加入0. 胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次；c经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min ；弃去离心后的上清液，加入细胞培养液清洗1次，2000r/min离心lOmin，制成细胞悬液，显微镜下计数，以5X 104cells/mL接种细胞至培养皿或培养瓶，置入37 °C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养；其中，步骤b中0. 胶原酶I培养基为将IOOmg胶原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5. 6% NaHCO3溶液调节PH值至7. 2 7. 4，经0. 22微米过滤器过滤、分装，-20 °C保存备用；步骤c中细胞培养液为在DMEM/F12液中添加其体积10%的胎牛血清，经0. 22微米过滤器过滤、分装，4 °C保存备用。
全文摘要
一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法，属于细胞与组织工程技术领域。本发明基于传统消化培养方法，利用组织匀浆机结合胶原酶I培养基处理脂肪组织，采用含胎牛血清的DMEM/F12培养液对牛前体脂肪细胞进行体外培养，成功建立了牛前体脂肪细胞体外培养的新模型。本发明工艺先进简单、培养基配制科学合理，节省了人力和物力，极大的缩短了试验样品处理的时间，且获得细胞形态最好，培养及提取RNA效率最高，是一种更为便捷、长期高效的前体脂肪细胞培养方法，为后续深入研究前体脂肪细胞增殖分化过程中基因、蛋白的表达及信号通路奠定基础，且为调控肉牛体脂沉积、预防奶牛围产期和泌乳高峰期疾病等提供新思路和新方法。
文档编号C12N5/077GK102559589SQ20121006029
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者万发春, 刘晓牧, 刘桂芬, 宋恩亮, 成海建, 游伟, 谭秀文 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所