专利名称：稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP及其方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pik-m功能性分子标记PikmFNP及其方法与应用。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是对水稻生产危害最严重的病害之一,姆年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定结果容易造成误差，目标基因的选择效率往往较低。随着分子标记技术的产生以及利用，其方便、直接、不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，而且还大大加快了育种步伐。由于含有5个具有不同抗谱以及小种特异性的等位基因Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik-s，位于第11染色体长臂端上的Pik位点一直是稻瘟病抗性研究以及抗病育种的焦点。其中，Pik-m(Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm—specific riceblast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、Pik(Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189:321-334)以及Pik_p(Yuan et al. 2011. The Pik-presistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linkedCC-NBS-LRR genes. TheorAppl Genet 122:1017-1028)已被成功地鉴定并克隆 研究表明，这3个等位基因的稻瘟病抗性须由2个相邻的NBS-LRR类抗病基因共同介导。同时，在水稻群体中，包含这3个等位基因的基因组区域存在着基因型的分化，即当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时存在时，该基因型定义为K型；而当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时不存在时，该基因型定义为N型(基因型与感病水稻参考品种日本睛的相同)。为了加快Pik-m在抗病育种工作中的应用，如在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、抗性基因Pik-m与其他功能基因的聚合育种、转基因育种中的应用，开发出准确有效的且区别于其它稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特异性分子标记显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP。
本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法。本发明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的应用。本发明目的通过以下技术方案实现一种稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，它是由引物对SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pik-m呈特异性带型的分子标记；所述的引物对的核苷酸序列如下所示
SEQ ID NO. 1(5，-3，)TCGCCGGTGACCTAAGAGAT ；SEQ ID NO. 2(5’ _3，) GATTTCACCGGCGCAAGCAT ；所述的水稻品种为Tsuyuake ；所述的稻瘟病抗性基因Pik-m包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pikml-TS和Pikm2-TS ；所述的特异性酶切指的是Mbo I酶切；所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列与Pikml-TS及Pikm2_TS做比对的方法，分析得到能区别于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特异性的I处单碱基差异(single nucleotide polymorphism, SNP),再通过引物设计得到SEQ IDNO. I及SEQ ID NO. 2，对水稻DNA进行扩增得到Pik_m功能特异性分子标记PikmFNP。优选的，上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，包括以下步骤(I)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pik-m等位基因的编码区DNA序列；(2)利用多序列比对软件工具(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)，将步骤⑴所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pik_m抗性基因所特异的I个SNP，其位于Pik-m组成基因中的Pikml-TS的CC区域，最终导致功能特异性
氨基酸的改变；(3)根据步骤(2)所得到的 I 个 SNP 以及 dCAPS(Derived Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequences)标记的原理，利用 Primer Premier 5. 0 软件工具(http://www.premierbiosoft. com)设计出引物对SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2 ;并用这组引物分别对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证；(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pik-m抗性基因的功能特异性的分子标记PikmFNP。更优选的，步骤(I)所述的K型水稻品种包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交4以及 Q1063 ；步骤(3)中在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性上游引物SEQ ID NO. 1，而在其下游100_200bp处设计功能特异性下游引物SEQ ID NO. 2 ；
步骤(3)中所述的PCR的反应体系如下
10XPCR Buffer2 ^il
dNTPs (2.5 mM)1.6 ^il
上游引物(IOpM)0.5 ^il
下游引物(IOpM)0.5 ^il
r脚酶(5U4U)0.1 ^il
DNA模板(50ng/|il)Ifil
ddH20补至 20pl所述的PCR的反应条件如下预变性94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，扩增35个循环；72°C 5分钟;10°C保存。步骤(3)中所述的酶切为利用限制性内切酶Mbo I对所获得的PCR产物进行酶切，
其反应体系如下
10 X酶切缓冲液1.2 W
PCR扩增产物5 ^il
Mbo I0.25 ^il
ddH20补至 12 ^il在3rc条件下酶切3小时后，取适量酶切产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为166bp，酶切后所得到的产物大小为145bp，后者即为抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记。所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明的Pik-m功能特异性选择标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pik-m在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，且不受环境以及人为因素的影响。因此，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到积极重要的作用。
图I是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的组成基因之一Pikml-TS与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图；黑色星号表示由PikmFNP造成的功能特异性氨基酸的改变。图2是水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的另ー组成基因Pikm2_TS与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图。
图3是Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP在12个水稻品种中的验证结果图其中，泳道I :抗性基因供体品种Kusabue (Pik);泳道2 : IRBLk-Ka (Pik单基因系)；泳道3 :抗性品种Kando 51 (Pik);泳道4 :抗性品种Kuyuku 131 (Pik);泳道5 :抗性基因供体品种Tsuyuake (Pik-m);泳道6 : IRBLKm-TS (Pik-m单基因系)；泳道7 :抗性品种GA20 (Pik-m);泳道8 :抗性基因供体品种K60 (Pik_p);泳道9 :1RBLkp-K60 (Pik_p单基因系);泳道10 :抗性品种Taifenzhan(Pik-p);泳道11 =IRBLks-S(Pik-s单基因系);泳道12 IRBLKh-K3 (Pik-h 单基因系);泳道 M :DNAladder。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进ー步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I :Pik等位基因编码区序列的比对及SNP的鉴定通过常规的PCR扩增(Yuanet al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes. TheorAppl Genet 122 :1017-1028 ;Zhai et al. 2011. The isolation and characterizationof Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologistl89 :321-334)、测序(上海英骏生物技术有限公司，广州分公司)，从5个抗病水稻品种 Shin 2 (Pik-s 供体品种；Kiyosawa. 1987. With genetic view on themechanism of resistance and virulence. Japanese Journal of Genetics 41:89-92)、Tsuyuake(Pik-m 供体品种；Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm—specificrice blast resistance. Geneticsl80 :2267-2276)、Kusabue (Pik 供体品种；Zhai etal.2011. i'he isolation and cnaracterization of Pik, a rice blast resistancegene wmch emerged after rice domestication. New Phytologist 189 :321-334)、K3 (Pik-h 供体品种；Xu et al. 2008. Efficient authentic fine mapping of the riceblast resistance gene Pik-h in the Pik cluster，using new Pik-h-differentiatingisolates. Molecular Breeding 22 :289-299)、K60 (Pik-p 供体品种；Yuan et al. 2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair ofclosely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genetl22 :1017-1028)及 2 个感病水稻品种黑交(K 型感病品种；Zhai et al. 2011. The isolation and characterization ofPik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. NewPhytologist 189 :321-334)、Q1063 (K 型感病品种；Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189 :321-334)中获得相应的 Pik_m 等位基因编码区DNA 序列[Pik-p (HM035369)，Pik(HM048900)，Pik_m(AB462256)，已经公开于 http://www.ncbi. nlm. nih. gov];利用多序列比对软件工具(http://multalin. toulouse. inra. fr/multalin/)，通过对这些序列翻译后的蛋白质序列进行比对分析，鉴定到存在于Pikml-TS基因cDNA第685位点的功能特异性SNP。在第685位点处，Pikml-TS编码的第229位氨基酸为谷氨酰胺(Q)，而其它等位基因在该位点则编码谷氨酸或赖氨酸(E或K)，因此，该位点可以将Pik-m与其它等位基因区分开(图I)。图2是水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的另ー组成基因Pikm2-TS与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图。在此，不存在Pik-m功能特异性的SNP。实施例2 :Pik_m功能特异性分子标记及其引物设计与检测根据dCAPS 标记的原理(Neff et al. , 2002. Web-based primer design for thesingle nucleotide polymorphism analysis. Trends in Genetics 18 :d13_615),在上述SNP位点处设计带有错配碱基的功能特异性上游引物Pikm-FNP-F，如SEQ ID NO. I所示；在上述SNP位点下游100-200bp处设计功能特异性下游引物Pikm-FNP-R，如SEQ ID NO. 2所示。利用这该组引物对携带有Pik-m基因以及其他等位基因的品种DNA模板进行扩增。Pikm-FNP的PCR扩增反应体系如下
10XPCR Buffer2 ^il dNTPs (2.5 mM)1.6 ^il 上游引物 Pikm-FNP-F (10 ^iM)0.5 ^il 下游引物 Pikm-FNP-R (10 ^iM)0.5 ^il r脚酶(5U4U)0.1 ^il DNA模板(50ng/|il)Ifil ddH20补至 20plPikm-FNP的PCR扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、720C I分钟，35个循环；72°C 5分钟；10°C保存。PCR反应结束后，利用限制性内切酶Mbo I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应
体系如下
10 X酶切缓冲液1.2 WPCR扩增产物5 ^ilMbo I0.25 ^il
ddH20补至 12 ^il在37°C条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为166bp，酶切后所得到的产物大小为145bp，后者(能被酶切)即为抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记。实施例3 :抗性基因Pik-m功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的应用提取含有不同的稻瘟病抗性基因的12个水稻品种([分别为KuSabue、Kand051、Kuyuku 131、GA20、Taifenzhan(Zhai et al. 2011. The isolation and characterizationof Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 :321-334)、Tsuyuake(Ashikawa et al. 2008. Two adjacentnucleotide-binding site—leucine rich repeat class genes are required to conferPikm-specif ic rice blast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、K60 (Yuan etal.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pairof closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122 :1017-1028)、IRBLk-Ka、IRBLKm-TS、IRBLkp_K60、IRBLks-S、及 IRBLKh_K3 (Kobayashi et al. 2007. Developmentofnew sets of international standard differential varieties for blast resistancein rice(Oryza sativa L.). JARQ 41:31-37]的基因组DNA，并以此为模板，利用实施例2中描述的Pikm-FNP的PCR扩增反应 体系和反应条件，对抗性基因Pik_m功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检測。电泳結果分别如图3所示。如
的那样，试验結果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pik-m功能特异性分子标记可在鉴别Pik-m基因与其他稻瘟病抗性基因得到应用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置換方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于是由引物对SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pik-m呈特异性带型的分子标记； 所述的引物对的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I :5’ -TCGCCGGTGACCTAAGAGAT-3’ ；SEQ ID NO.2 :5’ -GATTTCACCGGCGCAAGCAT-3’。
2.根据权利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于所述的水稻为水稻品种Tsuyuake。
3.根据权利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pik-m包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pikml-TS和Pikm2-TS。
4.根据权利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于所述的特异性酶切为Mbo I酶切。
5.权利要求I 4任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列与Pikml-TS及Pikm2-TS做比对的方法，分析得到能区别于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特异性的I处单碱基差异，再通过引物设计得到SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2，对水稻DNA进行扩增得到Pik_m功能特异性分子标记PikmFNP。
6.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于包括以下步骤 (1)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pik-m等位基因的编码区DNA序列； (2)利用多序列比对软件工具，将步骤(I)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pik-m抗性基因所特异的I个单碱基差异，其位于Pik-m组成基因中的Pikml-TS的CC区域，最终导致功能特异性氨基酸的改变； (3)根据步骤⑵所得到的I个单碱基差异以及dCAPS标记的原理，利用PrimerPremier 5. 0软件工具设计出引物对SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2 ;并用这组引物分别对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证； (4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pik-m抗性基因的功能特异性的分子标记PikmFNP。
7.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于步骤(I)所述的K型水稻品种包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交4以及Q1063。
8.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述的PCR的反应体系如下10XPCR Buffer 2u 1,2. 5mMdNTP I. 6u l、10iiM 引物 SEQ ID NO. 10. 5 u l、10iiM 引物 SEQ ID NO. 20. 5 u l、5U/y I rTaq酶 0. I ii l、50ng/ V- I DNA 模板 I ii I、双蒸水补至 20 ii I ; 所述的PCR的反应条件如下预变性94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，扩增35个循环；72°C 5分钟;10°C保存。
9.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于 步骤(3)中所述的酶切为利用限制性内切酶Mbo I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下=IOX酶切缓冲液I. 2 μ I、PCR扩增产物5 μ I、Mbo I酶O. 25 μ 1，双蒸水补至 12μ I。
10.权利要求I 4任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的应用，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP应用于在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种。
全文摘要
本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP及其方法与应用。该分子标记PikmFNP是由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列与Pikm1-TS及Pikm2-TS序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特异性的单碱基差异，再通过设计，得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，对水稻DNA扩增，并经特异性酶切之后，得到Pik功能特异性分子标记PikmFNP。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。
文档编号C12N15/11GK102618533SQ20121006027
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者林菲, 潘庆华, 王玲, 翟纯 申请人:华南农业大学