专利名称：一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种无质粒、无抗生素筛选标记的基因工程菌的构建方法。
背景技术：
利用基因工程微生物生产有用物质已成为物质制造的新的模式。目前，通常采用含目的基因的质粒表达系统来构建工程微生物。但是这种质粒表达系统往往存在质粒易丢失、不稳定、且质粒的存在又将增加宿主菌的代谢负担。更为严重的是质粒往往又含有抗生素抗性筛选标记，这将严重影响环境污染问题，导致环境中抗生素耐药菌泛滥，从而限制了含质粒的基因工程菌的工业化进程。为了解决质粒表达系统的上述缺陷，将目的基因整合到微生物染色体上是一个非常有效的方法。为此，许多科学家研发了许多质粒来整合基因到染色体上。美国普渡大学Haldimann and Wanner (2001)开发了一系列条件复制整合调节(CRIM)质粒， 利用该质粒可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的卩遼菌体整合位点上(Haldimann, A. , Wanner, B. L. Journal of Bacteriology. 2001，183 :6384-6393)。但是，利用这些质粒整合基因到大肠杆菌的染色体上后，质粒上的抗生素抗性筛选标记和复制子仍然保留在染色体上。所构建的工程菌仍然存在抗生素抗性筛选标记导致环境中耐药菌泛滥的问题。为克服他们的缺陷，台湾Chiang et al.在他们工作的基础上有开发了一系列用于基因整合的质粒，应用这些质粒同样可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点上，而且所得到的工程菌不含抗生素抗性筛选标记和复制子，可用于工业化生产(Chiang, C. -J. , Chen, P. T. , Chao, Y. P. Biotechnology Bioengineering 2008，101 =985-995)。但是，应用上述2个团队的质粒都只能将目的基因单拷贝地整合到大肠杆菌的染色体上，而实际工作中往往需要整合多拷贝的基因以提高基因的表达水平， 从而提高微生物的生产能力。为此，美国麻省理工学院Tyod et al.开发了一种可提高整合基因拷贝数的质粒PTGD，利用λ InCh基因组整合技术，将质粒上的目的基因整合到大肠杆菌染色体上后，因质粒上携带了抗生素抗性基因(与目的基因串列在一起)，可利用所谓的化学诱导染色体进化技术，提高目的基因在染色体上的拷贝数(Tyo，K. E. J.，Ajikumar, P. K. , Stephanopoulos, G. Nature Biotechnology 2009,27:760-765)。他们所得到的工程菌虽然基因的拷贝数因化学诱导染色体进化得到了增加，但是他们使用的基因整合技术是 λ InCh基因组整合技术，需要4个步骤，比较复杂，整合效率低，而且工程菌仍然含有抗生素抗性筛选标记，不适合于工业化生产。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的生物工程菌的构建方法，以及由上述方法构建得到的基因工程菌。本发明所采用的技术方案是一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤I)将表达整合酶的辅助质粒转化到宿主细胞中，得到含有辅助质粒的宿主细胞， 所述辅助质粒带有一个抗生素a抗性筛选基因；2)将目的基因连接到pXKF3T5b载体中，得到含有目的基因的pXKF3T5b载体；3)基因整合将含有目的基因的pXKF3T5b载体转化入含有辅助质粒的宿主细胞中，培养过夜；4)辅助质粒的去除挑选目的菌落，接入含三氯生的培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的单菌落同时点种到含三氯生、抗生素a的LB的平板上，培养过夜，挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落；5)抗性筛选基因β的去除挑选只在含三氯生的平板上生长的红色菌落，制备化学感受态细胞，然后将质粒PCP20转化到制备的化学感受态细胞中，涂布在三氯生+氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜，挑取目标菌落，接入含三氯生的培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的目标单菌落同时点种到含三氯生、抗生素β、氨苄青霉素的LB的平板上，培养过夜，只在含三氯生的平板上生长的红色菌落就是整合菌；6)三氯生诱导染色体进化通过不断增加培养基中三氯生的浓度，诱导整合菌染色体进化；7)进化菌的发酵筛选将上述耐受不同浓度三氯生的菌种分别接到相应浓度的三氯生培养基中扩大培养后，转接到发酵培养基中进行发酵，筛选目标产物含量最高的工程菌即为无质粒、无抗生素抗性筛选基因的生物工程菌。所述pXKF3T5b载体中含有含有2个FRT位点、抗生素β抗性筛选基因、复制子 (ori)、噬菌体整合位点(attP)、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)和终止子、连接在多克隆位点后的用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因(fabl)、连接在启动子和三氯生抗性基因(fabl)两侧的2个核苷酸序列相同的外源片段Al和A2 ;抗生素a抗性筛选基因与抗生素β抗性筛选基因为不同的抗性基因，且不是三氯生抗性基因(fabl)。优选的，步骤I)所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。优选的，所述辅助质粒能表达噬菌体ΗΚ022、Ρ21、Ρ22、λ或Φ80整合酶(Int)中任一种。优选的，所述辅助质粒为ρΑΗ121、ρΑΗ69、ρΑΗ123、ρΑΗ130和pINT-ts中任一种。优选的，所述辅助质粒中的抗生素a抗性筛选基因为氨苄青霉素抗性筛选基因， 抗生素a为氨苄青霉素。优选的，所述pXKF3T5b载体的结构为在两个FRT位点之间的一侧依次含有片段 Al、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因(fabl)、片段A2、噬菌体整合位点(attP)，在两个FRT位点的另一侧则依次含有抗生素β抗性筛选基因和复制子(如图I所示)。优选的，所述pXKF3T5b载体中的抗生素β抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因(kan),所述抗生素β为卡那霉素。优选的，所述pXKF3T5b载体中的复制子为大肠杆菌的条件复制子(ori Ry).优选的，所述pXKF3T5b载体中的噬菌体整合位点(attP)为attPHK、attPP21、attPA、 attP$80 和 attPP22 中的任一种。优选的，所述pXKF3T5b 载体中的启动子为 PT5、PT7、Pta。、Ptrc> Pla。、PBAD、PLtet> PLlac 等启动子中的任一种。优选的，步骤3)的具体操作为将5 μ I含有目的基因的pXKF3T5b载体加入到 100 μ I含有ρΑΗ121的宿主细胞中，冰上放置30 50分钟；42°C热击90秒，马上放到冰上 3 5分钟；补加LB培养液600 μ 1，37。。225rpm摇床培养约45 60分钟，然后于42 0CzjC 浴摇床中继续培养30分钟；离心，弃上清液至剩约200 μ 1，灭菌枪头吹打菌体至均匀；涂布棒涂布到LB平板(含I μ M三氯生和卡那霉素25 μ g/ml)，37°C倒置培养过夜。优选的，步骤6)的具体操作为挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落，接种到含I μ M三氯生的LB液体培养基的试管中，37°C培养24h，然后转接到含2 μ M三氯生LB液体培养基的试管中，37°C培养24h，剩余菌种制备甘油种于_80°C保存，将耐2μΜ三氯生的菌种继续转接到含4 μ M三氯生LB液体培养基的试管中，37°C培养24h，剩余菌种制备甘油种于_80°C保存，重复上述步骤，直至三氯生浓度为16 μ M为止。本发明的有益效果在于I)本发明方法通过简单的质粒转化，将目的基因整合到宿主菌的染色体上，然后利用化学诱导染色体进化技术，将整合基因的拷贝数进化到所需要的拷贝数，所得到的基因工程菌的筛选标记是大肠杆菌本身的fabl基因(编码烯酰-乙酰基载体蛋白还原酶)， 是三氯生抗性基因，因此所得到工程菌不会引起环境中抗生素耐药菌泛滥，适合于工业化
生产；2)所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，传代过程中不会丢失，遗传稳定性高,生产性能稳定。
图I是本发明pXKF3T5b质粒的物理图谱；图2是实施例I用于基因整合、三氯生诱导染色体进化的质粒pXKF3T5b的物理3是本发明的基因工程菌的构建流程。
具体实施例方式下面以构建无质粒、无抗生素抗性筛选标记产番茄红素的工程大肠杆菌为例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、 DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002,北京科学出版社)。以下实施例中所用到的引物见表I。
权利要求
1.一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤.1)将表达整合酶的辅助质粒转化到宿主细胞中，得到含有辅助质粒的宿主细胞，所述辅助质粒带有一个抗生素a抗性筛选基因；.2)将目的基因连接到pXKF3T5b载体中，得到含有目的基因的pXKF3T5b载体；.3)基因整合将含有目的基因的pXKF3T5b载体转化入含有辅助质粒的宿主细胞中，培养过夜；.4)辅助质粒的去除挑选目的菌落，接入含三氯生的LB培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的单菌落同时点种到含三氯生、抗生素a的LB的平板上，培养过夜，挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落；.5)抗性筛选基因β的去除挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落，制备化学感受态细胞，然后将质粒PCP20转化到制备的化学感受态细胞中，涂布在三氯生+氨苄青霉素的LB 平板上，培养过夜，挑取目标菌落，接入含三氯生的LB培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的目标单菌落同时点种到含三氯生、抗生素β、氨苄青霉素的LB的平板上，培养过夜，只在含三氯生的平板上生长的菌落就是整合菌；.6)三氯生诱导染色体进化通过不断增加培养基中三氯生的浓度，诱导整合菌染色体进化；.7)进化菌的发酵筛选将上述耐受不同浓度三氯生的菌种分别接到相应浓度的三氯生培养基中扩大培养后，转接到发酵培养基中进行发酵，筛选目标产物含量最高的工程菌即为无质粒、无抗生素抗性筛选基因的生物工程菌；所述pXKF3T5b载体中含有含有2个FRT位点、抗生素β抗性筛选基因、复制子ipri )、噬菌体整合位点、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)和终止子、连接在多克隆位点后的用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因、fabT)、连接在启动子和三氯生抗性基因ifeibi)两侧的2个核苷酸序列相同的外源片段Al和A2 ;抗生素a抗性筛选基因与抗生素β抗性筛选基因为不同的抗性基因，且不是三氯生抗性基因ifabi) 0
2.根据权利要求I所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤I)所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
3.根据权利要求I所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述辅助质粒能表达噬菌体ΗΚ022、Ρ21、Ρ22、λ或Φ80整合酶(Int)中任一种，辅助质粒上的抗生素a抗性筛选基因为氨节青霉素抗性筛选基因，抗生素a为氨节青霉素。
4.根据权利要求I所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体的结构为两个FRT位点的一侧按顺时针方向依次含有片段Al、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因Γ/ /)、片段A2、噬菌体整合位点6 巧，在两个FRT位点的另一侧则含有抗生素β抗性筛选基因和复制子。
5.根据权利要求I或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的抗生素β抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因Oa/ )，所述抗生素β为卡那霉素。
6.根据权利要求I或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的复制子为大肠杆菌的条件复制子WriR Y)。
7.根据权利要求I或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的曬菌体整合位点iattP)为和aii/k中的任一种。
8.根据权利要求I或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的启动子为 Ρ/^、Pfsc、Pfrc、Plac、Pm 、FVtet、FVlac 等启动子中的任一种。
9.根据权利要求I所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，步骤3)的具体操作为 将5μ I含有目的基因的pXKF3T5b载体加入到100 μ I含有ρΑΗ121的宿主细胞中，冰上放置30 50分钟；42°C热击90秒，马上放到冰上3 5分钟；补加LB培养液600 μ 1，37°C 225rpm摇床培养约45 60分钟，然后于42°C水浴摇床中继续培养30分钟；离心，弃上清液至剩约200 μ 1，灭菌枪头吹打菌体至均匀；涂布棒涂布到LB平板(含I μ M三氯生和卡那霉素25 μ g/ml)，37°C倒置培养过夜。
10.根据权利要求I所述的生物工程菌的构建方法，其特征在于，步骤6)的具体操作为挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落，接种到含I μ M三氯生的LB 液体培养基的试管中，37°C培养24h，然后转接到含2μΜ三氯生LB 液体培养基的试管中，37°C培养 24h，剩余菌种制备甘油种于一 80°C保存，将耐2μΜ三氯生的菌种继续转接到含4μ M三氯生LB液体培养基的试管中，37°C培养24h，剩余菌种制备甘油种于-80°C保存，重复上述步骤，直至三氯生浓度为16 μ M为止。
全文摘要
本发明公开了一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法，该方法以pXKF3T5b质粒为载体，将目的基因转化到宿主细胞中，然后依次通过表达整合酶辅助质粒的去除、整合载体中的卡那霉素抗性基因的去除、三氯生诱导染色体进化和进化菌的发酵筛选等步骤，得到一种无质粒、目的基因拷贝数高的基因工程菌，且由于pXKF3T5b质粒的筛选标记是大肠杆菌本身的fabI基因(编码烯酰-乙酰基载体蛋白还原酶)，是三氯生抗性基因，因此所得到的工程菌无抗生素抗性筛选标记，不会引起环境中抗生素耐药菌泛滥，适合于工业化生产。另外，所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，传代过程中不会丢失，遗传稳定性高，生产性能稳定。
文档编号C12N1/21GK102604983SQ20121006010
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者刘紫琦 申请人:刘紫琦