专利名称：一种用于染色体整合、进化的表达质粒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于染色体整合、进化的表达质粒，以及其构建方法。
背景技术：
利用基因工程微生物生产有用物质已成为物质制造的新的模式。目前，通常采用含目的基因的质粒表达系统来构建工程微生物。但是这种质粒表达系统往往有存在质粒易丢失、不稳定、且质粒的存在又将增加宿主菌的代谢负担。更为严重的是质粒往往又含有抗生素抗性筛选标记，这将严重影响环境污染问题，导致环境中抗生素耐药菌泛滥，从而限制了含质粒的工程菌的工业化进程。为了解决质粒表达系统的上述缺陷，将目的基因整合到微生物染色体上是一个非常有效的方法。为此，许多科学家研发了许多质粒来整合基因到染色体上。美国普渡大学Haldimarm and Wanner (2001)开发了一系列条件复制整合调节(CRIM)质粒， 利用该质粒可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点上(Haldimann，Α.，Wanner, B. L. Journal of Bacteriology. 2001,183 :6384-6393)。但是，利用这些质粒整合基因到大肠杆菌的染色体上后，质粒上的抗生素抗性筛选标记和复制子仍然保留在染色体上。所构建的工程菌仍然存在抗生素抗性筛选标记导致环境中耐药菌泛滥的问题。为克服他们的质粒缺陷， 台湾Chiang et al.在他们工作的基础上有开发了一系列用于基因整合的质粒，应用这些质粒同样可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点上，而且所得到的工程菌不含抗生素抗性筛选标记和复制子，可用于工业化生产(Chiang, C. -J.，Chen, P. Τ.，Chao, Y. P. Biotechnology Bioengineering 2008,101 :985-995)。但是，上述2个团队的质粒都只能将目的基因单拷贝地整合到大肠杆菌的染色体上，而实际工作中往往需要整合多拷贝的基因以提高基因的表达水平，从而提高微生物的生产能力。为此，美国麻省理工学院Tyod et al.开发了一种可提高整合基因拷贝数的质粒PTGD，利用λ hCh基因组整合技术，将质粒上的目的基因整合到大肠杆菌染色体上后，因质粒上携带了抗生素抗性基因(与目的基因串列在一起)， 可利用所谓的化学诱导染色体进化技术，提高目的基因在染色体上的拷贝数(Tyo，K. Ε. J.， Ajikumar, P. K. ， Stephanopoulos, G. Nature Biotechnology 2009,27 :760_765) 。 #^111^ 得到的工程菌虽然基因的拷贝数因化学诱导染色体进化得到了增加，但是他们使用的基因整合技术是λ InCh基因组整合技术，需要4个步骤，比较复杂，不利于工业应用，而且工程菌仍然含有抗生素抗性筛选标记，不适合于工业化生产。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的是提供一种用于染色体整合、进化的表达质粒。该表达质粒可以通过直接质粒转化将目的基因插入工程菌的染色体中，并可以通过化学诱导提高目的基因在染色体上的拷贝数。本发明所采用的技术方案是一种用于染色体整合、进化的表达质粒，含有2个FRT位点(可被FLP重组酶识别)、抗性筛选基因a、复制子、噬菌体整合位点(attP)、启动子(P)及其后面的多克隆位点 (MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β、及启动子与抗性筛选基因β两侧连接的2个异源的核苷酸序列相同片段Al和Α2，抗性筛选基因a与抗性筛选基因β为不同的抗性基因。优选的，所述质粒的结构为在两个FRT位点的一侧按顺时针方向依次含有片段 Al、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β、片段Α2、噬菌体整合位点(attP)，在两个FRT位点的另一侧则含有抗性筛选基因a和复制子(如图1所示)。优选的，所述抗性筛选基因a为卡那霉素抗性基因(kan)。优选的，所述复制子为大肠杆菌的条件复制子(ori Ry)0优选的，所述噬菌体整合位点(attP)为attPp attPP21、attPA、attP$80 和 attPP22 中的任一种。优选的，所述启动子为 PT5、PT7、Ptac、Ptrc、Plac、ΡβΑ 、FVtet、^Vlac 等启动子中的任一种。优选的，所述用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β为三氯生抗性基因 (fabl)、氯霉素抗性基因(cat)、氨苄青霉素抗性基因(b/a)、庆大霉素抗性基因(gen)、甲氧苄氨嘧啶抗性基因(dhfr)、壮观霉素抗性基因(aadA)、链霉素抗性基因(aadA)、四环素抗性基因(tetA)、乳酸菌素抗性基因中的任一种。进一步优选的，所述用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β为三氯生抗性基因(fabl)，由于fabl基因是大肠杆菌本身编码编码烯酰-乙酰基载体蛋白还原酶的基因，因此本质粒转化得到的基因工程菌不会引起环境中抗生素耐药菌泛滥，适合于工业化生产。优选的，所述Al、A2片段为来自于除大肠杆菌外的异源片段，在大肠杆菌中的同源性低且不表达，大小为800 12001Λρ，可来自于除大肠杆菌外的任何生物。优选的，以上所述表达质粒转化的宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。本发明的有益效果在于(1)应用本发明的质粒可通过质粒转化将基因整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点，然后在化学诱导下进行染色体进化，以提高整合基因在染色体上的拷贝数，从而构建无质粒甚至无抗生素抗性筛选标记、多拷贝数的重组大肠杆菌，以生产有用物质；(2)应用本发明的质粒的基因整合步骤简单、效率高。所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，传代过程中不会丢失，遗传稳定性高，从而导致生产性能稳定；(3)应用三氯生诱导染色体进化质粒pXKF3I^b所构建的工程菌不含抗生素抗性标记，不会引起环境中抗生素耐药菌泛滥的问题，适于工业化生产，生产的产品安全。
图1是本发明用于染色体整合、进化的表达质粒的物理图谱；
图2是实施例1用于染色体整合、氯霉素诱导染色体进化的质粒pXKF3I^b的物理图谱；图3是实施例2用于基因整合、三氯生诱导染色体进化的质粒pXKF3I^b的物理图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、 DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京科学出版社)。以下实施例中所用到的引物见表1。表 权利要求
1.一种用于染色体整合、进化的表达质粒，含有2个FRT位点、抗性筛选基因a、复制子、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β、噬菌体整合位点fei^)、及启动子与抗性筛选基因β两侧连接的2个异源的核苷酸序列相同片段Al和Α2，抗性筛选基因a与抗性筛选基因β为不同的抗性基因。
2.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，在两个FRT位点的一侧按顺时针方向依次含有片段Al、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β、片段Α2、噬菌体整合位点似炉)，在两个FRT位点的另一侧则含有抗性筛选基因a和复制子。
3.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述抗性筛选基因a为卡那霉素抗性基因(kan)。
4.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述复制子为大肠杆菌的条件复制子{ori Ry)。
5.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述噬菌体整合位点、attP、为 attPm,attP 2l、attJ\ WttPw^l attP 22 中的任一禾中。
6.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述启动子为P 、P 、P&、Pirc、Pla。、 ΡβΑΒ、^Ltet Λ fVlac 等启动子中的任一种。
7.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β为三氯生抗性基因(/ 力/人氯霉素抗性基因(⑵ 人氨苄青霉素抗性基因(力&)、庆大霉素抗性基因(^/？)、甲氧苄氨嘧啶抗性基因(逾/r)、壮观霉素抗性基因 Ca3说)、链霉素抗性基因Caa说)、四环素抗性基因(teM)、乳酸菌素抗性基因中的任一种。
8.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述Al、A2片段为来自于除大肠杆菌外的其他生物的异源片段，在大肠杆菌中的同源性低且不表达，大小为80(Γ 2001Λρ。
9.根据权利要求广8任一项所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒转化的宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。
全文摘要
本发明公开了一种用于染色体整合、进化的表达质粒，其含有2个FRT位点、抗性筛选基因a、复制子、噬菌体整合位点(attP)、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β、及启动子与抗性筛选基因β两侧连接的2个异源的核苷酸序列相同片段A1和A2，抗性筛选基因a与抗性筛选基因β为不同的抗性基因。该表达质粒可以通过简单的质粒转化将目的基因插入工程菌的染色体中，并可以通过化学诱导提高目的基因在染色体上的拷贝数，且操作简单，大大提高了目标产物的生产效率，适合于工业化生产。另外，所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，传代过程中不会丢失，遗传稳定性高，生产性能稳定。
文档编号C12N15/63GK102559729SQ20121006004
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者刘建忠, 崔艳艳, 陈韵妍, 黄明涛 申请人:中山大学