专利名称：一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法。
背景技术：
大豆[Glycine max Merill]是世界上重要的油料和蛋白来源之一，建立有效的转化体系有助于提高大豆产量、提高病虫害抗性以及改善蛋白和油料的品质，并能弥补传统育种的不足和缺陷。另外，大豆功能基因组学研究的快速发展，增强了程序化和有效转化系统的需求。然而，大豆是公认的较难转化的作物之一，同时，由于缺乏有效的和可重复的基因转化体系，致使大豆的遗传改变十分困难(参考文献J. C. Popelka, N. Terryn, T. J. V. Higgins, Gene technology for grain legumes can it contribute to the food chal lenge in developing countries,Plant Sci 167 (2004) 195-206.)。对于大豆遗传转化而言，花粉管通道法和农杆菌介导的子叶节法是最为常用的方法。自从1988年，Hinchee 等应用农杆菌介导的子叶节法获得第一株转基因植株，农杆菌介导的子叶节法被应用于了大豆的遗传转化研究中。随后，人们通过各种努力改进这种体系，虽然应用这种传统的单个子叶节的方法得到了一些转化植株，但是这种方法的转化周期长达7周以上(参考文献 Z. Zhang, A. Xing, P. Staswick，T. E. Clemente. The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean. Plant Cell Tissue Organ Cult 56 (1999) 37-46. ；P. M. Olhoft, K. Lin, J. Galbraith, N. C. Nielsen, D. A. Somers The role of thiol compounds inincreasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-nodecells,Plant Cell Rep 20(2001) 731-737 ;PM Olhoft,LE Flagel，CM Donovan, et al. Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method. Planta，2003，216 :723-735)，严重影响着基因工程技术在大豆遗传改良中的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法，包含外植体的获得，遗传转化及共培养，芽伸长及筛选培养，生根培养；其特征在于以整体子叶节作为外植体，用无菌棉球蘸取携带目标基因的农杆菌工程菌液侵染整体子叶节进行遗传转化。所述的整体子叶节外植体通过如下方法获得取饱满、无病虫害的大豆种子，消毒后将种子在无菌水中浸泡12小时后接种于MSB培养基，培养6-7天当无菌苗的两子叶刚展开，去掉初生叶、上胚轴、根，留取约3-3. 5cm的完整的子叶下轴和两个子叶，在两子叶之间的腑芽和顶端分生组织表面用无菌刀片轻轻的划5-6下，就得到用于转化的整体子叶节外植体。
所述的遗传转化及共培养是用无菌棉球蘸取携带目标基因的农杆菌工程菌液放于两子叶间的划伤组织上，接种在附加3. 5mg/L BAP、0. 2mg/LIBA、0. 2mg/LKT，pH5. 8的MSB 培养基中，于26°C、黑暗条件下与携带目标基因的农杆菌菌液棉球共培养3天。所述的共培养的第二天用移液枪吸取携带目标基因的农杆菌工程菌液滴到所述的无菌棉球上，所用菌液中附加500mg/L的L-半胱氨酸。所述的共培养结束后，去掉棉球，不转换培养基，直接将外植体转入光下，于26°C 培养，7天后，外植体转入附加500mg/L头孢噻肟和150mg/L卡那霉素，pH5. 8的MSB进行为期12天的芽的伸长及筛选培养，当抗性分化芽长至3-4cm时，切下，转入生根培养基附加
I.0mg/LNAA、500mg/L头孢噻肟，pH5. 8的MSB中进行生根10-15天，10-15天后，生根的转基因植株可移栽入土中。有益效果本发明将传统的外植体由单个子叶节的方法转为整体子叶节的方法，转化周期较短，与传统的单个子叶节的方法相比，在转化率不降低的情况下，得到转基因植株的周期可由单个子叶节的8周以上缩短为5-6周，从而提高大豆遗传转化的进程。共培养结束后去掉棉球，不转换培养基，而是直接将外植体放于光下培养，且培养基中不加入抑菌和筛选抗生素，有利于细胞分化和分化芽的快速生长。
图I.用于转化的外植体；图2.共培养后7天的分化芽；图3.筛选培养后的分化芽⑶S染色；图4.筛选培养后的分化芽⑶S染色；图5.转化植株生根；图6.转化植株移栽入土中；图7.转化植株移栽入土中图8.转化植株的PCR-Southern检测泳道I表示阳性对照，泳道2表示转化植株，泳道3表示转化植株，泳道4表示转化植株，泳道5表示阴性对照。图9. F1代转基因植株种子⑶S染色
具体实施例方式实施例II、无菌苗和外植体的获得选择饱满、无病斑的大豆中黄十三种子用0. I %的升汞消毒5分钟后，用无菌蒸馏水冲洗5-6遍，每遍2-3分钟，接种到灭菌的MSB培养基上，26°C、光强2000Lx、16/8h光暗条件下培养。当无菌苗生长6-7天时，去掉初生叶、上胚轴、根，留取约3-3. 5cm的完整的子叶下轴和两个子叶，在两子叶之间的腑芽和顶端分生组织表面用无菌刀片轻轻的划5-6 下，就得到用于转化的整体子叶节外植体(图I)。2、农杆菌的制备及培养
质粒转化农杆菌(I)将_80°C冰箱保存的农杆菌EHA105感受态，置于冰上融化； ⑵取4 ii LPBI 121质粒加入到500 ii L已解冻的感受态细胞EHA105中，冰浴30min，速冻 lmin, 37°C水浴 5min, 100-200rpm、28°C摇 4h 后，4000rpm、4°C离心 5min,去除部分上清后混匀菌体，吸取200uL涂布于YEB固体培养基+Kan 50mg/L+Rif 50mg/L, 28°C培养30_48h至单菌落产生。挑取平板上的单克隆，接种至20mLYEB液体培养基+Kan 50mg/L+Rif 50mg/L, 28°C、220rpm培养至OD6tltl = 0. 5左右，用50%的无菌甘油I : I混合后，_80°C冰箱保存备用。农杆菌的活化将_80°C冰箱保存的菌液用YEB固体培养基+Kan 50mg/L+Rif 50mg/L进行划线培养至单菌落出现，挑取单菌落接种在含有50mg/L Kan和50mg/L Rif 的 YEP培养基中，180rpm/min、28°C振荡培养过夜，吸取5ml菌液转接入50ml含有50mg/L Kan 和50mg/LRif的YEP至OD600为I. 0左右。6000rpm/min离心5min收集菌体，用MSB液体培养基将菌体稀释至0D_约0. 5。3、遗传转化和转基因植株的获得本发明用整体子叶节法用无菌棉球蘸取OD6tltl = 0. 5工程菌液(加入500mg/L的 L-半胱氨酸)工程菌液放于两子叶间的划伤组织上，放于MSB(附加3. 5mg/L BAP、0. 2mg/ LIBA、0. 2mg/LKT，pH5. 8)培养基、26°C、黑暗条件下与携带目标基因的农杆菌菌液棉球共培养3天。棉球蘸菌液时要适中，蘸完菌液放到整体子叶节处，接种时用镊子夹着胚轴靠近子叶节处的膨大部位，将培养瓶和外植体倒着接入，以避免菌液滴到培养基上；为保证侵染的菌液量，在共培养的第2天，用10 y L移液枪吸取菌液滴到原来的棉球上面，所用菌液中附加500mg/L的L-半胱氨酸，滴入时控制菌液量和流速，避免菌液污染培养基和胚轴下方部位、。共培养结束后，去掉棉球，不转换培养基，直接将外植体转入光下，于26°C培养，7 天后(图2)，外植体转入MSB+500mg/L头孢噻肟+150mg/L卡那霉素，pH5. 8)进行为期12 天的芽的伸长及筛选培养，当抗性分化芽长至3-4cm时,切下,转入生根培养基MSB+1. Omg/ LNAA+500mg/L头孢噻肟，pH5. 8中进行生根10天(图5)。12天后，生根的转基因植株可移栽入土中(图6、图7)。传统子叶节法(根据南农CN201010554668方法获得外植体和进行棉棒蘸取菌液转化)取子叶还未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分的下胚轴，保留3-5mm 的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽，即得含子叶节的外植体。 转化时用无菌棉棒蘸取菌液(加入500mg/L的L-半胱氨酸)涂抹于子叶节部位,或将子叶节浸泡于菌液中40min后，用吸水纸吸干外植体表面液体，插入共培养基MSB+3. 5mg/L BAP+0. 2mg/LIBA+0. 2mg/LKT, pH5. 8，黑暗中共培养 3 天后，转入 MSB+3. 5mg/L BAP+0. 2mg/ LIBA+0. 2mg/LKT+500mg/L头孢噻肟，pH5. 8，每12天继代一次，三次后外植体转入芽伸长培养基MSB+500mg/L头孢噻肟+100mg/L卡那霉素，pH5. 8进行为期20天的芽的伸长；20天后切下抗性芽，转入生根培养基MSB+1. 0mg/LNAA+500mg/L头孢噻肟，pH5. 8中进行生根培养。整体子叶节法转化植株检测当筛选培养结束后，用无菌蒸馏水冲洗外植体后，进行GUS整体染色，结果见图3和切下的抗性芽单独染色，结果见图4，移栽入盆中的转化植株进行了 PCR-Southern检测，结果见图8，最后又对F1代转基因种子进行了 GUS染色分析，结果见图 9。GUS 染色时按照 Jefferson 的方法(Jefferson RA (1987). Assaying chimericgenes in plants the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 :387-405.)整体子叶节法和传统子叶节法的效率比较以同一品种大豆外植体为材料，用整体子叶节法和统传方法进行了转化，在转化率(8.3%)高于传统子叶节的前提下，转化周期明显短于传统子叶节法(表I)。表I整体子叶节法和传统方法转化效率比较
权利要求
1.一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法，其特征在于包含外植体的获得，遗传转化及共培养，芽伸长和筛选培养，生根培养；其特征在于以整体子叶节作为外植体，用无菌棉球蘸取携带目标基因的农杆菌工程菌液侵染整体子叶节进行遗传转化。
2.根据权利要求I所述的农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法，其特征在于所述的整体子叶节外植体通过如下方法获得取饱满、无病虫害的大豆种子，消毒后将种子在无菌水中浸泡12小时后接种于MSB培养基，培养6-7天当无菌苗的两子叶刚展开，去掉初生叶、上胚轴、根，留取约3-3. 5cm的完整的子叶下轴和两个子叶，在两子叶之间的腑芽和顶端分生组织表面用无菌刀片轻轻的划5-6下，就得到用于转化的整体子叶节外植体。
3.根据权利要求2所述的农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法，其特征在于所述的遗传转化及共培养是用无菌棉球蘸取携带目标基因的农杆菌工程菌液放于两子叶间的划伤组织上，接种于附加 3. 5mg/L BAP、0. 2mg/LIBA、0. 2mg/LKT，pH5. 8 的MSB 培养基中，于 26°C、 黑暗条件下与携带目标基因的农杆菌菌液棉球共培养3天。
4.根据权利要求3所述的农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法，其特征在于所述的共培养的第二天用移液枪吸取携带目标基因的农杆菌工程菌液滴到所述的无菌棉球上，所用菌液中附加500mg/L的L-半胱氨酸。
5.根据权利要求3所述的农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法，其特征在于所述的共培养结束后，去掉棉球，不转换培养基，直接将外植体转入光下，于26°C培养，7天后，外植体转入附加500mg/L头孢噻肟和150mg/L卡那霉素，pH5. 8的MSB进行为期12天的芽的伸长及筛选培养，当抗性分化芽长至3-4cm时,切下,转入生根培养基附加I. 0mg/LNAA、500mg/ L头孢噻肟，PH5. 8的MSB中进行生根10-15天，10-15天后，生根的转基因植株可移栽入土中。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法。该方法包含外植体的获得，遗传转化及共培养，芽伸长和筛选培养，生根培养；其特征在于以整体子叶节作为外植体，用无菌棉球蘸取携带目标基因的农杆菌工程菌液侵染整体子叶节进行遗传转化。本发明将传统的外植体由单个子叶节的方法转为整体子叶节的方法，转化周期较短，与传统的单个子叶节的方法相比，在转化率不降低的情况下，得到转基因植株的周期可由单个子叶节的8周以上缩短为5-6周，从而提高大豆遗传转化的进程。
文档编号C12N15/84GK102533854SQ20121005964
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者刘坤, 张怡, 张福丽, 徐克东, 李成伟, 王俊生, 葛红莲, 谭光轩, 陈璨 申请人:周口师范学院