专利名称：一种快速筛选产电微生物的方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物检验技术领域，特别涉及一种微生物燃料电池(MFC)产电微生物的筛选方法。
背景技术：
能源与环境问题成为21世纪人类面临的最严重挑战，MFC因其绿色无污染且具有可再生性越来越受到人们的关注。MFC是利用微生物在代谢有机物时产生电子传递到阳极， 即将化学能直接转化为电能的一种能量转换装置，在能源、环境、军事等领域有着广阔的应用前景。尽管1910年微生物燃料电池概念首次提出，也知道所有细胞膜外带正电荷，膜内带负电荷，每个细胞都像一台微型发电机，但如何将这个发电机的电引出来为人们应用，一直是科学家们关心和要解决的难题。微生物代谢将化学能转变为电能，如何把电子转移引到外接电路上使其形成电通路是问题的关键。目前，这些影响MFC的应用并没有取得实质性的进展。究其原因，需要解决的问题包括电池的构造，如阳极、阴极、质子交换膜及电池构型等问题；还有操作条件，如阳极电势、pH、电解液成份及微生物所需氧料补给方式等问题。因此，筛选合适的产电菌是确保MFC所需微生物的关键。微生物代谢其实就是电子转移过程，由于微生物不同，其代谢方式及途径亦有差异，真核生物代谢中有些种类是进行胞内转移电子，其代谢过程在自身内完成；而有的种类则要将电子转移到胞外。由于胞内电子转移一般较难取得，只有电子经过胞外转移才较易于取得。尽管原核微生物的呼吸链是在细胞膜上完成，但原核微生物呼吸链的特点是电子供体、电子受体、细胞色素以及电子传递方式等都是多样性，代谢所得电子转移到阳极表面。在MFC的研究和应用中，快速挑选产电菌并加以驯化来满足MFC的需要非常重要， 比如选择纯种微生物产电还是选择混合微生物产电。而且，微生物的代谢途径等还直接影响MFC的产电效率和产电量，其中，起决定作用的是电子在阳极部分的传递，而产电微生物能否快速地附着在阳极上，并顺利地将电子传递给阳极，阳极材料又是直接的决定因素，所以的筛选出适用的产电微生物步骤非常重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提出一种利用氧化还原法快速简便的筛选出产电微生物方法。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，在微生物培养时，包括在培养基内加入氧化剂的步骤。优选地，一种快速筛选产电微生物的方法,包括如下步骤
(I)配置培养基，(2)在培养基内加入氧化剂，
(3)再加入需要筛选的微生物，
(4)进行培养，挑选产电微生物菌落。优选地，所述步骤(2)和步骤(3)顺序可以互换。优选地,所述的培养基优选为固体培养基。优选地，所述步骤(4)中，根据培养基中菌落边缘的颜色变化来判断选择产电微生物。优选地，所述的氧化剂含有如下离子Ce4+、Ba4+、Fe3+、Cr6+、Sn4+、Mn4+、Cu2+中的一种或两种以上。优选地，所述的氧化剂为氧化铈、二氧化钡、三氧化二铁、铬酸钾、二氧化锡、二氧化锰或硫酸铜中的一种或两种以上。优选地，所述的氧化剂的用量为O. 001 10. OmmoI/Lο优选地，所述的氧化剂的用量为O. 01 10. OmmoI/Lο优选地，对于不同的氧化剂，在实际使用时用量具体不同，如Ce4+的用量范围为
O.I 5 mmol/L，Ba4+的用量范围为O. 01 O. 8 mmol/L，Fe3+的用量范围为O. I 10 mmol/ L, Cr6+的用量范围为O. 005 10 mmol/L, Sn4+的用量范围为O. 05 I. 2 mmol/L, Mn4+的用量范围为O. 05 I mmol/L。但对于某些嗜Cr的菌类，氧化剂Cr6+的用量范围在100 mmol/L以上。在本文中，术语“培养基”指的是培养基是供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等，当然还可以添加抗菌素和色素。包括现有技术中各种液体培养基，或者可以加入琼脂粉的液体培养基、半固体培养基和固体培养基，包括但不限为细菌培养基、放线菌培养基、真菌培养基、 霉菌培养基。在本文中，术语“微生物”指的是一切肉眼看不到或看不清楚，因而需要借助显微镜观察的微小生物，具体包括原核微生物，如细菌、真核微生物，如真菌，及放线菌等种类。在本文中，术语“氧化剂”指的是氧化还原反应里得到电子或有电子对偏向的物质，也即由高价变到低价的物质。氧化剂从还原剂处得到电子自身被还原变成还原产物。本发明中，氧化剂包含但不限为如下离子Ce4+、Fe3+、Sn4+、Mn4+中的任一种或两种以上。由于氧化剂和还原剂是相互依存的，氧化还原总是同时发生的，它们是相互依存地。只有得到电子的还原作用，而没有失去电子的氧化作用，电子就没有来源；只有失去电子的氧化作用， 而没有得到电子的还原作用，电子就没有去路，氧化还原都是不可能的。本发明就是利用微生物作为还原剂为培养基中添加的氧化剂提供电子致氧化剂被还原这一原理来筛选产电微生物的。在进行微生物培养时，在培养基内加入氧化剂，微生物在生长过程中，有电子转移到细胞壁外时就作用于氧化剂使之发生被还原反应，根据氧化剂被还原情况判定菌落电子是否可以传递到细胞壁外以判定该菌是否为产电菌。也就是利培养基中的氧化剂从产电微生物处得到电子而被还原情况来判断该珠微生物是否为产电菌，如用在培养基中加入0. I 5mmol/L的二氧化锰，培养基呈浅灰色，电子可将二氧化锰还原为氢氧化锰，这样当菌落周围出现白色环时，说明该细菌代谢过程中有电子传递到细胞壁外，可确定该菌落即为产电菌落。这样就可以挑选该菌落培养保存培养用于产电量高的细菌进行驯化应用。
相比于现有技术中的解决方案，本发明优点是
I.操作简单，本发明的方法实际上只需要将氧化剂加入到常规培养基中培养并检测， 操作步骤简单、方便，耗时短，无需复杂仪器及特别技巧，可在实际的科研、产业进行推广应用。2、准确性高，由于本发明是利用氧化还原反应原理，能保证结果的正确性，大大降低了假阳性结果出现的几率。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
图I为本发明一实施例的培养检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例I
如图I所示，选择适合细菌、放线苗、酵母茵、霉菌等各种微生物生长的培养基(牛肉膏 1.5g 15g，蛋白胨 2. Og 20g，酵母浸膏 l 6g，胆盐 O. 5 3. 5g，乳糖 0 10g，NaCl 2 .5g 7，氯化镁0 0. 3g，氯化钙0 0. 31g，磷酸二氢钾0 0. 9g，磷酸氢二钾0 0.7g，琼脂O. 5 2g，调pH6. 8 8. 0，加水至1000ml)配制好后和培养皿一起高压灭菌，121°C灭菌 10 20min。在培养基中加入含O. I lmmol/L 二氧化锰进行混合，这时培养基呈黑色。待培养基温度降至50 56°C时，倒入10 30ml含有待测Iml菌液的培养皿中，待培养基凝固后于12 48°C培养12 96小时，观测菌落边缘氧化剂被还原程度。如图I所示，菌落周围出现白色环11的颜色变化，说明该细菌代谢过程中有电子传递到细胞壁外，可确定该菌落即为产电菌落10，这样就可以挑选该菌落培养保存，用于产电量高的细菌进行驯化应用；而周围没有出现白色环的菌落，为非产电菌落20。实施例2
选择适合细菌、放线苗、酵母茵、霉菌等各种微生物生长的培养基(牛肉膏
1.5g 15g,蛋白胨 2. 0g 20g,酵母浸膏 l 6g，胆盐 O. 5 3· 5g，乳糖 0 10g, NaCl
2.5g 7，氯化镁0 0· 3g，氯化钙0 0· 31g，磷酸二氢钾0 0· 9g，磷酸氢二钾0 0· 7g，琼脂0. 5 2g，调pH6. 8 8. 0，加水至1000ml)配制好后和培养皿一起高压灭菌，121°C灭菌 10 20min。在培养基中加入O. I 10mmol/L硫酸铜进行混合，这时培养基呈天蓝或略带黄色。待培养基温度降至50 56°C时，倒入10 30ml含有待测Iml菌液的培养皿中，待培养基凝固后于12 48°C培养12 96小时检测。观测菌落边缘氧化剂被还原程度。如果菌落周围出现灰黑色环，说明该细菌代谢过程中有电子传递到细胞壁外，可确定该菌落即为产电菌落，这样就可以挑选该菌落培养保存培养，用于产电量高的细菌进行驯化应用。实施例3
选择适合细菌、放线苗、酵母茵、霉菌等各种微生物生长的培养基(牛肉膏
1.5g 15g,蛋白胨 2. 0g 20g,酵母浸膏 l 6g，胆盐 O. 5 3· 5g，乳糖 0 10g, NaCl
2.5g 7，氯化镁0 0· 3g，氯化钙0 0· 31g，磷酸二氢钾0 0· 9g，磷酸氢二钾0 0· 7g，琼脂0. 5 2g，调pH6. 8 8. 0，加水至1000ml)配制好后和培养皿一起高压灭菌，121°C灭菌 10 20min。在培养基中加入O. 05 3mmol/L铬酸钾进行混合，这时培养基呈淡黄色。温度在50 56°C时，倒入10 30ml含有待测Iml菌液的培养皿中，待培养基凝固后于 12 48°C培养12 96小时检测，菌落边缘有六价铬被还原为三价铬时，目测可见菌落边缘有一圈浅淡绿色。说明该细菌代谢过程中有电子传递到细胞壁外，可确定该菌落即为产电菌落，这样就可以挑选该菌落培养保存，用于产电量高的细菌进行驯化应用。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，在微生物培养时，包括在培养基内加入氧化剂的步骤。
2.根据权利要求I所述一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤(1)配置培养基，(2)在培养基内加入氧化剂，(3)再加入需要筛选的微生物，(4)进行培养，挑选产电微生物菌落。
3.根据权利要求2所述一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)顺序可以互换。
4.根据权利要求I所述一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，所述的培养基优选为固体培养基。
5.根据权利要求2所述的一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，所述步骤(4) 中，根据培养基中菌落边缘的颜色变化来判断选择产电微生物。
6.根据权利要求1-5任一项所述一种快速筛选产电微生物的方法,其特征在于,所述的氧化剂含有如下离子Ce4+、Ba4+、Fe3+、Cr6+、Sn4+、Mn4+、Cu2+中的一种或两种以上。
7.根据权利要求6所述一种快速筛选产电微生物的方法,其特征在于,所述的氧化剂为氧化铈、二氧化钡、三氧化二铁、铬酸钾、二氧化锡、二氧化锰或硫酸铜中的一种或两种以上。
8.根据权利要求I所述的一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，所述的氧化剂的用量为0. 001 10. OmmoI/Lo
9.根据权利要求I所述的一种快速筛选产电微生物的方法，其特征在于，所述的氧化剂的用量为0. 01 10. OmmoI/Lo
10.根据权利要求6所述的一种快速筛选产电微生物的方法,其特征在于，Ce4+的用量范围为0. I 5 mmol/L,Ba4+的用量范围为0. 01 0. 8 mmol/L,Fe3+的用量范围为0. I 10 mmol/L, Cr6+ 的用量范围为 0. 005 10 mmol/L, Sn4+ 的用量范围为 0. 05 I. 2 mmol/ L, Mn4+的用量范围为0. 05 I mmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种快速筛选产电微生物的方法，在微生物培养时，包括在培养基内加入氧化剂的步骤，所述的氧化剂含有如下离子Ce4+、Ba4+、Fe3+、Cr6+、Sn4+、Mn4+、Cu2+中的一种或两种以上。本发明的方法实际上只需要将氧化剂加入到常规培养基中培养并检测，操作步骤简单、方便，耗时短，无需复杂仪器及特别技巧，可在实际的科研、产业进行推广应用。此外，由于本发明是利用氧化还原反应原理，能保证结果的正确，大大降低了假阳性结果出现的几率。
文档编号C12Q1/04GK102586389SQ20121005929
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者唐祖明, 戎非, 梅茜, 郁颖蕾, 顾忠泽 申请人:东南大学