专利名称：一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法
技术领域：
本发明涉及一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，属于核酸应用技术领域。
背景技术：
基因组是指包含在该生物的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,以下简称 DNA)[部分病毒是核糖核酸(Ribonucleic acid，以下简称RNA)]中的全部遗传信息。更精确的讲，基因组指的是一套染色体中的完整的DNA序列。研究生物基因组和如何利用基因的一门学问则就叫基因组学。随着基因组学等分子生物学研究的发展，利用大片段DNA的研究步入了一个重要的位置。大片段D N A在测序，图位克隆基因、基因结构及其功能分析等研究具有重要作用。传统获得大片段基因组脱氧核糖核酸一般采用十六烷基三甲基溴化铵法(即 CTAB法，以下简称CTAB法)，CTAB法虽然经过繁琐操作可以获得大片段基因组脱氧核糖核酸，但操作过程麻烦，且中间过程需要进行有机抽提，不仅对人体有害，也会对环境造成污染。
发明内容
本发明的目的是提出一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，简化脱氧核糖核酸的提取工艺，而且不需接触有机试剂，以便安全、快速地获得大片段基因组脱氧核糖核酸用于基因组学研究。本发明提出的快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，包括以下步骤(I)向含抗凝剂的血液中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5 次，得到第一混合液，对第一混合液进行离心分离，在2000 Xg离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，所述的缓冲液A的组成为柠檬酸钠75-150毫摩尔/升，吐温-20质量体积比为2-10%，采用柠檬酸调pH值至7. O ;(2)在上述细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5 次，得到第二混合液，对第二混合液进行离心分离，在2000 Xg离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保细胞沉淀在管中；(3)配制缓冲液B和蛋白酶K的混合液，缓冲液B和蛋白酶K的体积比为100 I， 得到第三混合液，所述的缓冲液B的组成为盐酸胍2-4摩尔/升，pH值为8. O的三羟甲基氨基甲烷盐酸10-50毫摩尔/升，采用盐酸调pH值7. O ;(4)在上述步骤(2)的细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1/2的第三混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，得到第四混合液；(5)将第四混合液于65摄氏度水浴10-30分钟，同时颠倒混匀数次；(6)向第四混合液中加入体积为血液初始体积1/2的异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组脱氧核糖核酸，得到第五混合液；
(7)对第五混合液进行离心分离，在2000 X g离心分离3分钟，倒弃上清液，留下脱氧核糖核酸沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保脱氧核糖核酸沉淀在管中；(8)在上述步骤(7)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/2、体积百分比浓度为70%的乙醇，涡旋振荡5秒钟，在2000 Xg离心分离3分钟，倒弃上清液；(9)重复步骤(8)，最后将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟以上，使脱氧核糖核酸沉淀在管中；(10)在空气中使步骤(9)的脱氧核糖核酸沉淀干燥5分钟以上，直至所有的液体挥发干净；(11)在上述步骤(10)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/10的洗脱缓冲液C，低速涡旋5秒，65摄氏度加热I小时，溶解后即脱氧核糖核酸溶液，所述的缓冲液C的组成为pH值为8. O的三羟甲基氨基甲烷盐酸10毫摩尔/升，pH值为8. O的乙二胺
四乙酸二钠盐I毫摩尔/升。本发明提出的快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，其优点是安全快速、 获得DNA片段大。不同于传统CTAB法，本发明方法的操作步骤简便，而且不涉及有机抽提， 无需使用对人体有害的有机物质。本发明方法是基于调整盐浓度和PH值的原理，所开发的快速大片段DNA提取技术，可用于基因组的多项研究，不仅节省了大量时间，同时获得了高质量的大片段DNA。使用本发明方法提取的大片段基因组脱氧核糖核酸，具有较高的纯度， 操作过程中杂质残留降到最低；而且产量高，可满足下游的多种应用。
图I是本发明方法的一个实施例中提取的Iml血液基因组脱氧核糖核酸的电泳图。图2是本发明方法的另一个实施例中提取的5ml血液基因组脱氧核糖核酸的电泳图。
具体实施例方式本发明提出的快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，包括以下步骤(I)向含抗凝剂的血液中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5 次，得到第一混合液，对第一混合液进行离心分离，在2000 Xg离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，所述的缓冲液A的组成为柠檬酸钠75-150毫摩尔/升，吐温-20质量体积比为2-10%，最终采用柠檬酸调pH值至7. O ;(2)在上述细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5 次，得到第二混合液，对第二混合液进行离心分离，在2000 Xg离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保细胞沉淀在管中。(3)配制缓冲液B和蛋白酶K的混合液，缓冲液B和蛋白酶K的体积比为100 I， 得到第三混合液，所述的缓冲液B的组成为盐酸胍2-4摩尔/升，pH值为8. O的三羟甲基氨基甲烷盐酸10-50毫摩尔/升，最终采用盐酸调pH值7. O ;(4)在上述步骤(2)细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1/2的第三混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，得到第四混合液；
(5)将第四混合液于65摄氏度水浴10-30分钟，其间颠倒混匀数次；(6)向第四混合液中加入体积为血液初始体积的1/2异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA，得到第五混合液；(7)对第五混合液进行离心分离，在2000Xg离心分离3分钟，倒弃上清液，留下脱氧核糖核酸沉淀；将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保DNA沉淀在管中。(8)在上述步骤(7)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/2、体积百分比浓度为70%的乙醇，涡旋振荡5秒钟，在2000 Xg离心分离3分钟，倒弃上清液；(9)重复步骤(8)，最后将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟以上，使脱氧核糖核酸沉淀在管中；(10)在空气中使脱氧核糖核酸沉淀干燥5分钟以上，直至所有的液体挥发干净；(11)在上述步骤(10)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/10的洗脱缓冲液C，低速涡旋5秒，65摄氏度加热I小时，溶解后即脱氧核糖核酸溶液，所述I缓冲液C的组成为pH值为8. O的三羟甲基氨基甲烷盐酸10毫摩尔每升，pH值为8. O的乙二胺四乙酸二钠盐I毫摩尔每升。本发明提出的快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，属于核酸应用技术领域。本方法中使用全血为材料，进行大片段DNA的提取，应用于基因组学相关研究。本发明技术中，所用的化学试剂可以从北京精益公司购买；蛋白酶K由天根生化科技(北京)有限公司生产。以下介绍本发明的实施例，在实施例中分别使用Iml和5ml人类抗凝全血为材料， 采用本发明所述提取方法，快速提取血液大片段基因组DNA。实验方法如下I)按本发明方法分别进行Iml全血和5ml全血的基因组DNA提取2)电泳条件用O. 5 X TBE电泳缓冲液配制2% (W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含量为 O. 5/ml的溴化乙啶。按比例将2μ I的核酸溶液与上样缓冲液均匀混合，然后加入到凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪上观察并照相。实施例一(I)向Iml含抗凝剂的血液中加入体积为2ml的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第一混合液，对第一混合液进行离心分离，在2000 X g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀；(2)在上述细胞沉淀中加入体积为Iml的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第二混合液，对第二混合液进行离心分离，在2000 Xg离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀， 将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保细胞沉淀在管中；(3)配制缓冲液B和蛋白酶K的混合液，缓冲液B和蛋白酶K的体积比为100 I， 得到第三混合液；(4)在上述步骤(2)的细胞沉淀中加入体积为O. 5ml的第三混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，得到第四混合液；(5)将第四混合液于65摄氏度水浴10分钟，同时颠倒混匀数次；
(6)向第四混合液中加入体积为O. 5ml的异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组脱氧核糖核酸，得到第五混合液；(7)对第五混合液进行离心分离，在2000Xg离心分离3分钟，倒弃上清液，留下脱氧核糖核酸沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保脱氧核糖核酸沉淀在管中；(8)在上述步骤(7)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为O. 5ml、体积百分比浓度为 70%的乙醇，涡旋振荡5秒钟，在2000 X g离心分离3分钟，倒弃上清液；(9)重复步骤(8)，最后将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟以上，使脱氧核糖核酸沉淀在管中；(10)在空气中使步骤(9)的脱氧核糖核酸沉淀干燥5分钟以上，直至所有的液体挥发干净；(11)在上述步骤(10)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为O. Iml的洗脱缓冲液C， 低速涡旋5秒，65摄氏度加热I小时，溶解后即脱氧核糖核酸溶液。反应结束后取2 μ I脱氧核糖核酸溶液，琼脂糖凝胶电泳检测。用Tiangen公司产品分子量标准物λ DNA/HindIII作为对照，结果如图I所示。由图I可见，采用本发明对人来源的全血进行大片段基因组DNA提取，得到的DNA 片段大，无降解，得率高，所以用本方法技术完全能够满足提取大片段DNA的要求。实施例二(I)向5ml含抗凝剂的血液中加入体积为IOml的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第一混合液，对第一混合液进行离心分离，在2000 X g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀；(2)在上述细胞沉淀中加入体积为5ml的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第二混合液，对第二混合液进行离心分离，在2000 Xg离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀， 将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保细胞沉淀在管中；(3)配制缓冲液B和蛋白酶K的混合液，缓冲液B和蛋白酶K的体积比为100 I， 得到第三混合液；(4)在上述步骤(2)的细胞沉淀中加入体积为2. 5ml的第三混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，得到第四混合液；(5)将第四混合液于65摄氏度水浴30分钟，同时颠倒混匀数次；(6)向第四混合液中加入体积为2. 5ml的异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组脱氧核糖核酸，得到第五混合液； (7)对第五混合液进行离心分离，在2000 X g离心分离3分钟，倒弃上清液，留下脱氧核糖核酸沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保脱氧核糖核酸沉淀在管中；(8)在上述步骤(7)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为2. 5ml、体积百分比浓度为 70%的乙醇，涡旋振荡5秒钟，在2000 X g离心分离3分钟，倒弃上清液；(9)重复步骤(8)，最后将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟以上，使脱氧核糖核酸沉淀在管中；(10)在空气中使步骤(9)的脱氧核糖核酸沉淀干燥5分钟以上，直至所有的液体挥发干净；(11)在上述步骤(10)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为O. 5ml的洗脱缓冲液C，低速涡旋5秒，65摄氏度加热I小时，溶解后即脱氧核糖核酸溶液。反应结束后取2 μ I反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。用Tiangen公司产品分子量标准物ADNA/Hindlll作为对照，结果见图2。由图2可见，采用本发明对人来源的全血进行大片段基因组DNA提取，得到的DNA 片段大，无降解，得率高，所以用本方法技术完全能够满足提取大片段DNA的要求。
权利要求
1.一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)向含抗凝剂的血液中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5次， 得到第一混合液，对第一混合液进行离心分离，在2000 X g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，所述的缓冲液A的组成为柠檬酸钠75-150毫摩尔/升，吐温-20质量体积比为2-10%，采用柠檬酸调pH值至7.0 ;(2)在上述细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1-2倍的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第二混合液，对第二混合液进行离心分离，在2000 X g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保细胞沉淀在管中；(3)配制缓冲液B和蛋白酶K的混合液，缓冲液B和蛋白酶K的体积比为100: 1，得到第三混合液，所述的缓冲液B的组成为盐酸胍2-4摩尔/升，pH值为8. O的三羟甲基氨基甲烷盐酸10-50毫摩尔/升，采用盐酸调pH值7. O ;(4)在上述步骤(2)的细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1/2的第三混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，得到第四混合液；(5)将第四混合液于65摄氏度水浴10-30分钟，同时颠倒混匀数次；(6)向第四混合液中加入体积为血液初始体积1/2的异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组脱氧核糖核酸，得到第五混合液；(7)对第五混合液进行离心分离，在2000X g离心分离3分钟，倒弃上清液，留下脱氧核糖核酸沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保脱氧核糖核酸沉淀在管中；(8)在上述步骤(7)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/2、体积百分比浓度为70%的乙醇，涡旋振荡5秒钟，在2000 Xg离心分离3分钟，倒弃上清液；(9)重复步骤(8)，最后将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟以上，使脱氧核糖核酸沉淀在管中；(10)在空气中使步骤(9)的脱氧核糖核酸沉淀干燥5分钟以上，直至所有的液体挥发干净;(11)在上述步骤(10)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/10的洗脱缓冲液C，低速涡旋5秒，65摄氏度加热I小时，溶解后即脱氧核糖核酸溶液，所述的缓冲液 C的组成为pH值为8. O的三羟甲基氨基甲烷盐酸10毫摩尔/升，pH值为8. O的乙二胺四乙酸二钠盐I毫摩尔/升。
全文摘要
本发明涉及一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，属于核酸应用技术领域。本发明的提取方法中，先后依次向含抗凝剂的血液中加入各种试剂，包括缓冲液A，缓冲液B，蛋白酶K，异丙醇，70％乙醇及洗脱缓冲液C，经过细胞裂解、异丙醇结合、核酸洗涤和核酸洗脱，最后得到脱氧核糖核酸溶液。本发明方法基于调整盐浓度和pH值的原理，操作步骤简便，节省了大量时间，同时获得了高质量的大片段DNA，而且产量高，可满足下游的多种应用。
文档编号C12N15/10GK102586231SQ20121005872
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者俞萍, 孙克非, 李晓晨, 柯海燕 申请人:天根生化科技(北京)有限公司