专利名称：一种检测高度近视的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测高度近视的试剂盒，具体地说检测与高度近视疾病相关ZNF644基因变异的试剂盒。
背景技术：
高度近视(high myopia,HM)又称为病理性近视、恶性近视，是指屈光度在-6. OOD以上的近视，有眼轴延长、眼后极部的变形改变，巩膜变薄、脉络膜萎缩变薄等病理性改变，并伴有弱视、青光眼、白内障、玻璃体混浊、视网膜脱离等多种并发症。高度近视是ー种致盲性眼病，其病因、发病机制非常复杂。高度近视有家族性并有明显的遗传倾向，且患病率高，有种族差异。在我国，高度近视是常染色体隐性遗传，表现为 儿童学龄(前)期出现近视，近视度数进行性増加，眼底视网膜脉络膜病变逐年加重。到目前为止，对高度近视的治疗方法很有限且效果不显著。光学矫正如戴眼镜或接触镜矫正近视眼的屈光缺陷，虽然有助于暂时恢复正常或接近正常的视力，却不能有效地控制近视进展；针对部分高度近视伴有黄斑病变所采用的玻璃体手术与激光治疗，以及通过手术控制眼轴延长延缓眼底病变出现的时间并减轻其病变程度，是临床上最常采用的干预方法，这些治疗手段能使术后视力提高或保持稳定，屈光度稳定或減少，眼轴增长趋于缓慢，对功能性改变有轻度改善作用，但这些治疗并不能对所有患者有效，且手术存在一定的风险性，手术并发症主要有术后视网膜脱离和涡静脉、睫状动脉损伤，其远期效果也还尚待考证。另外有报道通过药物控制眼轴增长和高度近视的病理改变，但仍处于实验阶段，还有待进一步研究。因此，早期诊断发现，及早干预，延缓病程，減少病人的视カ丧失是非常重要的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了ー种新的试剂盒。本发明提供了一种检测高度近视的试剂盒，包括任选的用于检测ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的ー个或者多个基因位点变异的试齐 。所述的1901位变异为A — G变异，2156位变异为A — G变异，2180位变异为C — G变异，2238位变异为G — A变异，4138位变异为C — G变异，4718位为G — A变异。上述试剂盒中的试剂为测序用试剂。该测序用试剂包括引物I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ；和/或引物2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和/或引物3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ；和/或引物4 TGAATTGGGAGTTTTGATGT和/或引物5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。上述试剂盒中的试剂为限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、SnaPshot用试剂、基因芯片用试剂。上述试剂盒还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的ー个或者多个基因位点的基因片段的试剂。该试剂为引物对A:上游弓I 物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT；和/或引物对B:上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；和/或引物对C :上游引物CCCCACAAGACTTGCATAGA下游引物CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。本发明上述试剂盒含有本发明特异性扩增目的片段的PCR引物对和特异性測定目的基因的碱基的引物，以及用于PCR扩增和进行测序的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。用本发明上述试剂盒检测待检样品，确定ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位六个SNP位点的多态性，样品没有限制，如体液(血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。本发明还提供了一种检测高度近视的试剂盒，包括任选的用于检测ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异的试剂。所述的第587位变异是第587位I — V变异，第672位变异是672位S — G变异，第680位变异是672位R — G变异，第699位变异是699位C — Y变异。所述的试剂为检测氨基酸序列用试剂。本发明又提供了 ZNF644基因在制备检测高度近视的试剂中的用途。所述用途是指ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的ー个或者多个基因位点变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。所述的1901位变异为A —G变异，2156位变异为A — G变异，2180位变异为C — G变异，2238位变异为G — A变异，4138位变异为C — G变异，4718位为G — A变异。上述用途中所述的试剂为测序用试剂。该测序用试剂包括所述的测序用试剂包括引物I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ；和/或引物2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和/或引物3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ；和/或引物4 : TGAATTGGGAGTTTTGATGT ；和/或引物5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。
、
上述用途中所述的试剂为限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、SnaPshot用试剂、基因芯片用试剂。上述用途中的试剂还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点的基因片段的试剂。所述的试剂为弓丨物对A:上游弓I 物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG
下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT ；和/或引物对B: 上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；和/或引物对C :上游引物C : CCCCACAAGACTTGCATAGA下游引物C : CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。本发明还提供了 ZNF644基因编码的蛋白质在制备检测高度近视的试剂中的用途。所述用途是指ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。所述的第587位变异是第587位I — V变异，第672位变异是672位S — G变异，第680位变异是672位R — G变异，第699位变异是699位C — Y变异。所述的试剂为检测氨基酸序列用试剂。待检样品组织可以是待检者的肝组织、胎盘、视网膜或者视网膜色素上皮细胞。本发明公开了 ZNF644基因的上述多态性位点与高度近视的相关性，提供了ー种预测病理性近视易感性的方法，该方法可用于高度近视的早期筛查、辅助诊断，为易患者实施早期预防和治疗提供依据，具有良好的市场应用前景。
图I高度近视家系(951)的家系图谱图2高度近视家系(951)的家系(III :2)的临床眼底照片图3PCR产物直接测序检测2156位A — G突变的序列图谱图4PCR产物直接测序检测1901位A — G突变的序列图谱图5PCR产物直接测序检测2180位C — G突变的序列图谱图6PCR产物直接测序检测2238位G — A突变的序列图谱图7PCR产物直接测序检测4138位C — G突变的序列图谱图8PCR产物直接测序检测4718位G — A突变的序列图谱图9散发高度近视患者的临床眼底照片图10ZNF644基因在人体肝组织、胎盘、视网膜和视网膜色素上皮细胞中的表达情况。
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进ー步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例I样本收集和基因组DNA的提取
家系及病例样本均来自由四川省医学科学院·四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室承担的国家自然科学基金(课题号30900809，81170883)、国家杰出青年基金(81025006)、973项目子课题(2011CB504604)以及四川省科技厅课题(2010SZ0138)收集的样本。高度近视家系(951)成员共计30人(20人存活)，其中高度近视患者10人(6人存活)；散发高度近视患者300例，平均年龄33. 6± 12. 6岁，其中男性占46. 3%，正常对照600例(入选标准为40岁以上，长期从事近距离工作，屈光度> -I. 0D)，平均年龄55. 8±9. 2岁，其中男性占47. 8% (表I)。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这ー研究也得到了伦理委员会批准。表I散发高度近视病例和正常対照的基本临床资料
临床资料正常対照高度近视患者
人数600300
年龄55·8±9·233·6±12·6**
男性比例287(47.8%)139(46. 3% )
屈光度(D)-0·27±0·53-10. 36±4· 03**
眼轴(rnn)23·91±1·9827·95±2·02**注**，P<0.01。每人采集EDTA抗凝血样5 10ml，酚-氯仿法提取基因组DNA，具体步骤为在抗凝剂EDTA存在下,将收集的5ml人外周血在3000rpm离心分离30分钟除去血清；接着加入O. 2% NaCl溶液，使总体积为30ml ;轻轻振荡溶液5_6次，并使其放置于冰上15分钟；此后，在3000rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物；用O. 2%的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤；在如此获得的沉淀物中，加入IOmM Tris-HCl (pH8. O)和IOmM EDTA(4ml),以悬浮该沉淀物；将10% SDS,25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16 μ I和20 μ I,接着上下颠倒悬液轻轻混合；然后,在37°C过夜温育悬液；过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物；以3000rpm离心分离10分钟除去水层；将水层与4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟，除去水层；最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC (pH5. 2)，两倍量的冷无水こ醇，使DNA沉淀；用70%的こ醇洗涤以获得基因组DNA。将所得的基因组DNA溶解于TE中，定量测定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液浓度校正至30ng/ μ 1，置_20°C冰箱保存。实施例2ZNF644基因2156位A — G突变位点的检测一、检测方法I、提取高度近视家系(951)存活成员的的血液基因组DNA2、ZNF644基因2156位A — G突变位点的检测(I) PCR 扩增
以步骤I得到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO. I 2所示引物对A(上游引物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ;下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT)为引物，采用天根公司的PCRmix试剂盒进行PCR扩增。体系2XPCRmix10 μ 1，上下游引物(5pm)各 I μ 1，模板 DNA (30ng/μ I) I μ 1，ddH20 7 μ I ο程序95°C变性5分钟；95°C 30秒、52°C退火30秒、72°C延伸I分钟，35个循环；72°C延伸7分钟，12°C保温。扩增产物是如SEQ ID NO. 3 4所示的序列(879bp)ACCAGGAGAGAAGACAGAAGttgatggaggaaattcgtgaattgaaagaacttcaggatgaaggaaga agtgcacgattacagtgtcctcagtgtgtgtttggtaccaattgccctaaaacatttgtgcaacatgctaaaacccatgaaaaagataaaaggtactactgctgtgaagagtgtaacttcatggcagtgacagaaaatgaattggaatgccatcgaggcattgcacatggggcagtggtaaaatgccctatggtcacttctgatattgcccagagaaaaacacaaaaaaagactttcatgaaagactctgtagtaggatcatccaaaaaatcagctacctacatatgtaagatgtgtccttttactacttcagccaaaagtgttttaaaaaagcacacggagtacttgcatteatcatcatgtgttgattcatttggtagtcctcttggacttgataaaagaaaaaatgacatccttgaagaacctgtagatagtgatagcactaaaacattaactaaacaacagtcaaccacatttccaaagaactctgctttaaaacaagatgtgaagcgaacatttggatcaacctcacaatca A/G gtagtttttcaaaaattcataagcggccacacagaatacagaaagctcggaaaagcattgcccaatcaggtgtaaacatgtgcaatcaaaacagctctcctcataagaatgttacaattaaaagcagcgttgaccaaaaacctaagtatttccatcaagcagcaaaagaaaagtctaatgccaaggcaaatagccactatttgtatagacacaaatatgaaaactataggatgatcaaaaaatcaggtgaatcATATCCTGTGCATTTCAAAA(2) PCR产物纯化取步骤(I)的PCR产物5 μ 1，加入USB公司ExoSAP_IT(US PCR纯化试剂)1μ I。程序37°C 20 分钟，75 °C 15 分钟，12 °C 保温。(3)测序反应以步骤(2)的产物为模板，以SEQ ID NO. 5所示的序列(引物I)CCCTATGGTCACTTCTGATA为引物，采用ABI公司DNA片段测序试剂盒测序。反应体系纯化好的PCR产物1μ l，5XBufferly 1，测序引物(2ρπι)0·5μ I(或5pm O. 2μ I)，seq-RPlOO O. 5 μ 1，ddH20 2 μ I (或 2· 3 μ I)。程序96で 15 秒，50で 10 秒，600C 4分钟，30个循环；12°C保温。(4)测序反应产物纯化每个反应加入70%こ醇25 μ 1，避光静置15分钟，4000转/分钟离心30分钟，吸弃上清液，沉淀静置20分钟晾干，加入9 μ I上机缓冲液溶解，上机测序。(5)上机测序分析采用ABI 3130XL测序仪进行测序分析。ニ、检测结果2156位A — G突变的测序图谱如图3所示，根据测序图和951家系成员基本情况绘制表2 表2951家系成员基本情况及ZNF644基因测序结果
权利要求
1.一种检测高度近视的试剂盒，其特征在于包括任选的用于检测ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个位点变异的试剂。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的1901位变异为A—G变异，2156位变异为A — G变异，2180位变异为C — G变异，2238位变异为G — A变异，4138位变异为C — G变异，4718位为G — A变异。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂为测序用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot用试剂或者基因芯片用试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的测序用试剂包括引物 I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ； 和 / 或引物 2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和 / 或引物 3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和 / 或引物 4 TGAATTGGGAGTTTTGATGT ； 和 / 或引物 5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点的基因片段的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的用于扩增的试剂包括 引物对A: 上游引物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG 下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和/或引物对B: 上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT 下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA ； 和/或引物对C : 上游引物CCCCACAAGACTTGCATAGA 下游引物CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。
7.一种检测高度近视的试剂盒，其特征在于包括任选的用于检测ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的第587位变异是第587位I— V变异，第672位变异是672位S — G变异，第680位变异是680位R — G变异，第699位变异是699位C —Y变异。
9.ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的1901位变异为A— G变异，2156位变异为A — G变异，2180位变异为C — G变异，2238位变异为G — A变异，4138位变异为C — G变异，4718位为G — A变异。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述的试剂为测序用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot用试剂或者基因芯片用试剂。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于所述的测序用试剂包括 引物 I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ；和 / 或引物 2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和 / 或引物 3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和 / 或引物 4 TGAATTGGGAGTTTTGATGT 和 / 或引物 5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。
13.根据权利要求9所述的用途，其特征在于还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点的基因片段的试剂。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于所述的用于扩增的试剂包括 引物对A:上游弓 I 物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和/或引物对B: 上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT 下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA ； 和/或引物对C : 上游引物CCCCACAAGACTTGCATAGA 下游引物CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。
15.ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于所述的第587位变异是第587位I— V变异，第672位变异是672位S — G变异，第680位变异是680位R — G变异，第699位变异是699位C —Y变异。
全文摘要
本发明提供了一种检测高度近视的试剂盒，包括任选的用于检测ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个位点变异的试剂。还提供了ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个位点变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。本发明提供的试剂盒可以预测待检样本对高度近视的易感性，可用于早期监控、检测高度近视的高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。
文档编号C12Q1/68GK102732607SQ201210057779
公开日2012年10月17日 申请日期2012年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者刘小琦, 尹烨, 杨旭, 杨正林, 石毅, 蒋涛, 金鑫, 鲁芳 申请人:四川省医学科学院(四川省人民医院), 深圳华大基因科技有限公司