专利名称：白皮松父系鉴定方法
技术领域：
本发明涉及基因检测方法，具体而言涉及白皮松父系鉴定方法。
背景技术：
植物的种源鉴定、父本分析是物种保存、种子园设计的重要内容，旨在通过解读种子或个体的可能父本来源，判断产地以及花粉或种子散播方式。现在常规方法是利用大量的分子标记组合分析植物个体的基因型，推断子代可能的父本。在松科植物中主要采用叶绿体微卫星标记。一般认为叶绿体微卫 星具有父系遗传、变异率高的特点，能够通过数个甚至十余个基因的组合鉴定个体的遗传特征，排除非亲本个体。白皮松(Pinus bungeana)是我国特产的珍稀濒危植物，因其树形优美而成为园林绿化的优良品种。为保存白皮松种质资源、合理规划种子园、满足亲本识别的要求，高变异叶绿体基因片段的筛选成为当务之急。现有技术通常利用叶绿体微卫星(cpSSR)高变异的特点，植物个体的DNA通过PCR扩增多个cpSSR位点，然后把所有位点的基因组合在一起当作一个基因型，再寻找与该基因型相一致的基因组合，结合产地植物群体特征，确定种质来源与可能父本。可以看出，现有技术方案很大程度依赖与cpSSR变异的高低。cpSSR变异越高则父本识别效率越高，所需位点越少，成本越低。反之，则效率降低、成本增加。
发明内容
然而我们通过对白皮松叶绿体微卫星的研究表明，其变异率远较其它近缘种低，诸多微卫星位点没有变异，不能够用于种质鉴定与父系分析。因此，如何鉴别白皮松的父系需要采用其它方法来实现。本发明的目的一方面是提供一种白皮松父系鉴定方法，为了实现本发明的目的，采用如下技术方案本发明一方面涉及白皮松父系鉴定方法，包括如下步骤(I)提取待测白皮松样品的DNA ；(2)使用引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5，-AATTCTGCACAGCCTCGTC-3，对 DNA 样品进行 PCR 扩增；(3)扩增产物进行测序，将测序结果与SEQ NO =Hl-HlO的序列进行比对以鉴别其父系。在本发明的一个优选实施方式中，所述的鉴定方法包括如下步骤(I)用CTAB法提取白皮松DNA ；(2)合成引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’(3)采用步骤2中的引物对DNA样品进行PCR扩增PCR 的反应体系(25ii L) :PCR-Mix 13. 5 y L ;正反向引物各 0. I y M ;DNA 模板50ng，ddH20不足体积。PCR在MJ Research Inc.生产的PTC-200型热循环仪上进行，反应程序为94°C预变性4min ;94°C变性45sec ；50. 3°C退火45sec ;72°C延伸Imin ；36个循环，72°C延伸 5min ;10°C保存；(4)扩增产物进行测序，将测序结果与Hl-HlO的序列进行比对以鉴别其父系。本发明另一方面还涉及SEQ NO =Hl-HlO或其互补序列在白皮松父系鉴定中的应用。本发明通过对珍稀濒危植物白皮松叶绿体基因检测，能够利用单一基因对不同地理种源的进行有效鉴定，大幅度提闻了白皮松父本的检测效率，弥补了现有叶绿体基因标记变异率低，需要的标记量大的不足。
图I :不同产地白皮松叶绿体基因类型及频率。
具体实施例方式实施例I :采集源于5个不同产地的15个皮松样本，通过如下步骤对其父系进行鉴定(I)用CTAB法提取白皮松DNA ；(2)合成引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’(3)采用步骤2中的引物对DNA样品进行PCR扩增PCR 的反应体系(25ii L) :PCR_Mix 13. 5 ii L ;正反向引物各 0. I ii M ;DNA 模板50ng，ddH20不足体积。PCR在MJ Research Inc.生产的PTC-200型热循环仪上进行，反应程序为94°C预变性4min ;94°C变性45sec ；50. 3°C退火45sec ;72°C延伸Imin ；36个循环，72°C延伸 5min ;10°C保存；(4)扩增产物进行测序，将测序结果与Hl-HlO的序列进行比对以鉴别其父系。鉴定结果鉴定结果如图I所示，例如四川白皮松固定特殊的H2基因，秦岭南坡种源以H5为主，黄土高原群体以Hl和H3的组合为主，该标记的高变异性表明其可用于个体识别与父系鉴定。当理解的是，以上具体实施方式
仅仅是举例性说明，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.白皮松父系鉴定方法，包括如下步骤 (1)提取待测白皮松样品的DNA； (2)使用引物Pb-F:5，-TGGCATTATGGATTCTCC-3，，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’ 对 DNA 样品进行 PCR 扩增； (3)扩增产物进行测序，将测序结果与SEQNO =Hl-HlO的序列进行比对以鉴别其父系。
2.根据权利要求I所述的白皮松父系鉴定方法，所述的鉴定方法包 括如下步骤 (1)用CTAB法提取白皮松DNA； (2)合成引物Pb-F:5’ -TGGCATTATGGATTCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’ (3)采用步骤2中的引物对DNA样品进行PCR扩增 PCR的反应体系(25 μ L) =PCR-Mix 13. 5 μ L ;正反向引物各O. I μ M ;DNA模板50ng，ddH20不足体积。PCR在MJ Research Inc.生产的PTC-200型热循环仪上进行，反应程序为:94°C预变性 4min ;94°C变性 45sec ；50. 3°C退火 45sec ;72°C延伸 Imin ；36 个循环，72°C延伸5min ;10°C保存； (4)扩增产物进行测序，将测序结果与Hl-HlO的序列进行比对以鉴别其父系。
3.基因序列SEQNO =Hl-HlO或其互补序列在白皮松父系鉴定中的应用。
全文摘要
本发明公开了白皮松父系鉴定方法，包括如下步骤(1)提取待测白皮松样品的DNA；(2)使用引物Pb-F5’-TGGCATTATGGATTCTCC-3’，Pb-R5’-AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’对DNA样品进行PCR扩增；(3)扩增产物进行测序，将测序结果与SEQ NOH1-H10的序列进行比对以鉴别其父系。本发明通过对珍稀濒危植物白皮松叶绿体基因检测，能够利用单一基因对不同地理种源的进行有效鉴定，大幅度提高了白皮松父本的检测效率，弥补了现有叶绿体基因标记变异率低，需要的标记量大的不足。
文档编号C12Q1/68GK102676649SQ201210057230
公开日2012年9月19日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者刘占林, 刘宇佳, 杨佳 申请人:西北大学