专利名称：新城疫病毒和鸭瘟病毒二重pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测试剂盒。
背景技术：
新城疫(NewcastleDiseases,简称 ND)和鸭痕(Duck Plague,简称 DP)均常见于鸭、鹅等雁行目禽类的急性、败血性和高度接触性传染病，这两种疾病流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率高，均是目前对世界范围水禽危害最为严重的疫病之一。给水禽业带来巨大的经济损失。这两种疾病呈急性败血症过程中都侵害神经系统，同时出现呼吸道症状，排绿色粪便，其临床表现、病理变化、流行病学等方面都十分相似，这两种疾病发生时，很容易混淆。目前对NDV和DPV的鉴别诊断主要依靠传统的病原分离鉴定与血清学试验，但这些方法存在诊断时间长，特异性差，敏感性低，而且操作繁琐等的缺点，不利于快速诊断这两种疾病。PCR检测方法由于具有敏感性高、特异性好、快速、简便等特点，已被广泛应用于各种禽病病原体的检测。二重PCR是ー种特殊的PCR形式，其突出特点是，一次PCR反应，能同时检测并鉴别出两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。
发明内容
本发明的ー个目的是提供一种检测新城疫病毒和鸭瘟病毒的引物组。本发明提供的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为(0.1-0. 2) (0. 1-0. 2) (1. 5-2) 1. 87 ；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体为0. 13 0. 13 1. 87 1. 87。本发明的另ー个目的是提供一种检测新城疫病毒和鸭瘟病毒的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR缓冲液和水组成；所述引物组中的引物I在所述PCR试剂中的终浓度具体为0. 1-0. 2umol/L ；所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为0. 1-0. 2 u mo I/L ；所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为1. 5-2 u mo I/L ；所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为1. 5_2iimol/L。所述引物组中的引物I在所述PCR试剂中的终浓度进ー步具体为0. 13umol/L ；所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度进ー步具体为0. 13umol/L ；所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度进ー步具体为1. 87umol/L ；所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度进ー步具体为1.87iimol/L。
上述PCR缓冲液购自天根，产品目录号为KT201。本发明的第三个目的是提供一种检测新城疫病毒和鸭瘟病毒的PCR试剂盒。本发明提供的PCR试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂。上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒和/或鸭瘟病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；或上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒和鸭瘟病毒中的应用。上述应用为用上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。上述应用中，所述二重PCR扩增的退火温度为50°C -55°C，所述二重PCR扩增的退火温度具体为55で。上述二重PCR扩增的模板为待测样本的cDNA或DNA。本发明的第四个目的是提供一种检测新城疫病毒的引物对A。本发明提供的引物对A，由上述的引物组中的所述引物I和所述引物2组成。本发明的第五个目的是提供ー种检测鸭瘟病毒的引物对B。本发明提供的引物对B，由上述的引物组中的所述引物3和所述引物4组成。含有上述引物对 A的PCR试剂A或试剂盒A是本发明保护的范围；含有上述引物对B的PCR试剂B或试剂盒B也是本发明保护的范围。上述的引物对A或上述的PCR试剂A或试剂盒A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒产品中的应用是本发明保护的范围。上述的引物对B或上述的PCR试剂B或试剂盒B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭瘟病毒产品中的应用是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明的二重PCR仅需要一次PCR反应，能同时检测并鉴别出新城疫病毒与鸭瘟病毒，与依靠单次检测单种病毒、依靠传统的病原分离鉴定和血清学试验相比，二重PCR具有特异性好、敏感性高、快速、简便等特点，在临床上具有很高的应用价值。
图1为二重PCR特异性试验结果图2为二重PCR敏感性试验结果图3为临床样品检测的部分结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1、引物的设计针对新城疫(Newcastle Diseases,简称ND)病毒和鸭痕(Duck Plague,简称DP)病毒的保守基因(ND保守基因是F基因genbank号JN872152.1的第1676-2094位核苷酸，DP保守基因是EU08288. 2的第55471-56072位核苷酸)，结合DNAstar、Primer5及NCB1-blast生物学软件的综合分析结果,设计两对特异性引物，引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列參数如表1:表I为NDV、DPV引物的核苷酸序列
引物名称_引物序列(5’ -3’ )_
NDV-FTGC AAC CGC TGC ACA GAT AAC (序列 I)NDV-PTCA GGC CGC TAC CM TTA ATG AG (序列 2)
DPV-FTGA GGC TGG TAT GCG TGA CAT A (序列 3)
画DPV-PHG GTT TCT GAG TTG GCA GAG G (序列 4)实施例2、引物在二重PCR检测中的特异性和敏感性试验1、二重PCR特异性试验新城疫病毒NDV-F48E9购自中国兽医药品监瞀所；新城疫病毒NDV-Lasota购自中国兽医药品监瞀所；新城疫病毒C3tl株购自中国兽医药品监瞀所；鸭瘟地方分离株I (为鸭瘟病毒，以下简称DPV)记载在“用聚合酶链反应检测鸭瘟病毒的研究”，中国兽药杂志2000，34(4) : 10 12，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得;小鸭肝炎病毒记载在“用聚合酶链反应检测鸭瘟病毒的研究”，中国兽药杂志，2000，34(4) 10 12，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；番鸭细小病毒记载在“用聚合酶链反应检测鸭瘟病毒的研究”，中国兽药杂志2000，34(4) 10 12，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；小鹅瘟病毒记载在“用聚合酶链反应检测鸭瘟病毒的研究”，中国兽药杂志2000，34(4) 10 12，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；禽呼肠孤病毒记载在“应用多重反转录_聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研究”，中国预防兽医学报，2000, 22⑵126-129，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；H6亚型禽流感病毒记载在“H6亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法的建立”，“微生物学通报”DEC 20，2011，38 (12) : 1855-1861，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；鸭疫巴氏杆菌记载在“应用多重反转录_聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研究”，中国预防兽医学报，2000, 22⑵126-129，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得； 将新城疫病毒NDV-F48E9、NDV-Lasota、NDV-C3(l株、鸭瘟病毒地方分离株I (以下简称DPV)、小鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒、鸭圆环病毒、禽呼肠孤病毒、H6亚型禽流感病毒、鸭疫巴氏杆菌分别接种正常健康的鸭，分别得到感染新城疫病毒NDV-F48E9鸭、感染NDV-Lasota鸭、感染NDV-C3tl株鸭、感染DPV鸭、感染小鸭肝炎病毒鸭、感染番鸭细小病毒鸭、感染小鹅瘟病毒鸭、感染鸭圆环病毒鸭、感染禽呼肠孤病毒鸭、感染H6亚型禽流感病毒鸭、感染鸭疫巴氏杆菌鸭。I) cDNA模板制备
取感染新城疫病毒NDV-F48E9鸭、感染NDV-Lasota鸭、感染NDV-C3tl株鸭、感染小鸭肝炎病毒鸭、感染禽呼肠孤病毒鸭、感染H6亚型禽流感病毒鸭的咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于500 L生理盐水中，然后将棉拭子充分捻动，在试管壁上挤压干净后，以6000r/min离心15min，取上清250iiL，加入480iiL TRIzol LS reagent，轻轻混匀后室温静置lOmin，加A 200 u L氯仿，轻微振荡混匀，室温静置5mim，12000rpm离心lOmin，取上清约500 u L，加入500 ii L异丙醇，混匀后-20°C静置10min，12000rpm离心lOmin，弃上清，加入75%こ醇1000 u L，混匀，12000rpm离心lOmin，弃上清，干燥后加入35ul DEPC-H2O,分别得到RNA。再向RNA中加入1.5 ii L自由引物(购自TaKaRa公司，D3802)，置于70°C水浴中lOmin，然后取出置冰上5min，再加入如下试剂5XRT Buffer(购自TaKaRa公司，D2620)，IOu L, 10mmol/L dNTP 2 u L, 5U/ u L AMV1. Ou L, Ribonuclease Inhibitor(购自 TaKaRa公司，D2313A)40U/ii L 0. 5 u L ;混匀后42°C水浴90min，分别获得的新城疫病毒NDV-F48E9cDNA、NDV-Lasota cDNA、NDV-C30株cDNA、小鸭肝炎病毒cDNA、禽呼肠孤病毒cDNA、H6亚型禽流感病毒cDNA。2) DNA模板制备分别均匀剪取感染DPV鸭、感染番鸭细小病毒鸭、感染小鹅瘟病毒鸭、感染鸭圆环病毒鸭和感染鸭疫巴氏杆菌鸭的肝脏(也可以是脾脏、肺脏等组织)与双抗生理盐水以体积比1: 5的比例研磨制成病料悬料,分装1. 5ml EP管，12000rpm离心lOmin,取250 ii L上清移至另一新1.5ml EP管，按照抽提DNA试剂盒(购自天根，产品目录号DP304-02)的说明书进行提取，分别得到DPV DNA、番鸭细小病毒DNA、小鹅瘟病毒DNA、鸭圆环病毒DNA、鸭疫巴氏杆菌DNA。3) 二重 PCR 扩增分别取2ul上述得到的cDNA或DNA作为模板进行二重PCR扩增，反应体系总体积^25uL,2XTaq PCR Master Mix (购自天根 KT201) 12. 5 ii L，2 ii L 模板，加入终浓度分别为 0. 13 ii mol/L 的 NDV-F、NDV-P 各 0. 33 y L,各加入终浓度分别为1. 87 u mol/L 的 DPV-F,DPV-P各0. 86 iiし最后用双蒸水补至25 uし上述模板具体分别为NDV-F48E9 cDNA、NDV-Lasota cDNA、NDV-C3tl 株 cDNA、DPVDNA、NDV-F48E9 cDNA+DPV DNA (混合的体积比为1: 9)、NDV-Lasota cDNA+DPV DNA (混合的体积比为1: 9)、NDV-C3tl株cDNA+DPV DNA、小鸭肝炎病毒cDNA、番鸭细小病毒DNA、小鹅瘟病毒DNA、鸭圆环病毒DNA、禽呼肠孤病毒cDNA、H6亚型禽流感病毒cDNA、鸭疫巴氏杆菌DNA。PCR 反应程序为94 0C 5min ；94 °C 40s, 50 °C lmin，72 °C 40s, 30 个循环；72°C IOmin。结果如图1 所示，M :1OObp DNA Ladder ；1 :NDV_F48E9 ；2 =NDV-Lasota ；3 =NDV-C30株；4 DPV ；5 NDV-F48E9+DPV ；6 NDV-Lasota+DPV ；7 :NDV-C3tl株+DPV ；8 :小鸭肝炎病毒；9 番鸭细小病毒；10 :小鹅瘟；11 :鸭圆环病毒；12 :禽呼肠孤病毒；13 H6亚型禽流感病毒；14 :鸭疫巴氏杆菌， 可以看出，1-3得到419bp的片段，4得到602bp的片段;5_7得到419bp和602bp的片段；8-13没有这两种大小的片段。从上述结果可以看出，该引物及方法可以见到出新城疫病毒和鸭瘟病毒，且对新城疫病毒和鸭瘟病毒特异性高。
因此，上述引物和方法可应用于鉴定未知样本是否感染新城疫病毒(NDV，)和鸭瘟病毒(DPV):若得到419bp的片段，则样本中含有NDV，反之则没有；若得到602bp的片段，则样本中含有DPV，反之则没有；若得到419bp和602bp的片段，则样本中含有NDV和DPV，反之则没有。2、二重PCR敏感性试验用DU 800紫外分光光度计测得新城疫病毒cDNA浓度和鸭瘟病毒DNA浓度分别为20ng/ul，70ng/ul，然后连续10倍稀释至cDNA为0. 4fg/ul，DNA为126fg/ul，将不同稀释倍数的混合物作为模板，模板具体如下4ng/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 126ng/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；0. 4ng/ul NDV-C30 株 cDNA 和 12. 6ng/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；4pg/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 1260pg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；0. 4pg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 126pg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；0. 04pg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 12. 6pg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；4fg/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 1260fg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；0. 4fg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 126fg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；按照上述I的3)方法进行二重PCR。结果如图2 所示，其中，M 为 IOObp DNA Ladder ；1 为 4ng/ul NDV-C30 株 cDNA 和126ng/ul DPV(体积比为 I 9)DNA ;2 为 0. 4ng/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 12. 6ng/ul DPV(体积比为 I 9)DNA ;3 为 4pg/ul NDV-C3tl 株 cDNA 和 1260pg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；4为 0. 4pg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 126pg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；5 为 0. 04pg/ulNDV_C30株 cDNA 和 12. 6pg/ul DPV (体积比为 I 9) DNA ；6 为 4fg/ul NDV-C30 株 cDNA 和 1260fg/ul DPV (体积比为 I 9)DNA ;7 为 0. 4fg/ul NDV-C3。株 cDNA 和 126fg/ul DPV (体积比为
I 9)DNA ;8为阴性对照(H20，2ul);可以看出，1_4均得到419bp和602bp的片段，说明新城疫病毒NDV-C3tl cDNA最小检出0. 4pg，鸭瘟病毒DPV的DNA最小检出126pg。结果表明该技术敏感性高。实施例3、临床样品二重PCR检测对采集的7份(编号为1-7)鸭病料，1-3采肝、4-5采脾脏、6_7采肺脏，将其磨成悬液再进行病毒分离鉴定，分别提取鸭病料DNA和RNA，并将RNA反转录得到cDNA，将各个样本的DNA和cDNA混合(体积比为1:1),得到编号为1-7的混合样本。分别将上述编号为1-7的混合样本作为模板，按照实施例2的I的3)方法进行ニ重PCR检测。若得到419bp的片段，则样本中含有NDV，反之则没有；若得到602bp的片段，则样本中含有DPV，反之则没有；若得到419bp和602bp的片段，则样本中含有NDV和DPV，反之则没有。结果如图3所示，M为IOObp DNA Ladder ；1为阳性对照(NDV_C3Q+DPV) ;2_8分别对应样本1-7 ;可以看出，样本1-7仅得到419bp的片段，说明样本1-7均仅含有NDV。将编号为1-7的鸭病料经过处理后接鸡胚，从中收获尿囊液，用血凝试验检测，结果7份病料含有的病毒均能凝集鸡红细胞，说明7份病料没有DPV病毒；再将编号为1-7份病料的cDNA作为模板，用NDV病毒的特异引物XZ9 :5’GGA GGA TGT TGG CAGCAT-3’ ；XZlO :5’ GAC AAC ATA TAC ACC TCA TC-3’ ；扩增片段为 310bp，说明 1-7 感染 NDV(见于文章“2000-2004年间广西新城疫病毒强毒株的分离与鉴定”)。为了进ー步证明，编号为1-7的鸭病料的确没有DPV病毒，将编号为1-7样本的DNA 作为模板用 DPV 病毒的特异引物 XZ43 :5，_GCA AGC TTG GCT GGT ATG CGT GAC AT-3，;XZ44 :5’ -TTC TGC AGG TAT TGG TTT CTG AGT TGG C-3’，(见于文章用聚合酶链反应检测鸭瘟病毒的研究”，中国兽药杂志，2000，34 (4) :10 12)引物进行扩增，没有得到602bp的片段，说明1-7不感染DPV。 结果与本发明的方法一致，说明本发明的引物和方法正确。
序列表
<110〉广西壮族自治区兽医研究所
<120〉新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测试剂盒
く 160〉4
<210〉 I
<211〉 21
<212〉 DNA
く 213〉人丄序列
<220〉
<223〉
<400〉 I
tgcaaccgct gcacagataa c21
<210〉2
く211〉23
<212〉DNA<213〉人工序列<220〉
<223>
<400〉 2
tcaggccgct accaattaat gag23`<210〉3
<211〉22
<212>DNA<213〉人工序列<220〉
く 223〉
<400〉 3
tgaggctggt atgcgtgaca ta22
く210〉 4〈211〉 22く212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
く 223〉
く400〉 4
ttggtttctg agttggcaga gg2权利要求
1.检测新城疫病毒和鸭瘟病毒的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为(0.1-0.2) (0.1-0. 2)(1.5-2) 1.87 ； 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体为0.13 0.13 1.87 1.87。
3.检测新城疫病毒和鸭瘟病毒的PCR试剂，由权利要求1或2所述的引物组、PCR缓冲液和水组成； 所述引物组中的引物I在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.1-0.2 μ mol/L ； 所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.1-0.2 μ mol/L ； 所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为1.5-2 μ mol/L ； 所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为1.5-2 μ mol/L ； 所述引物组中的引物I在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为0.13ymol/L ； 所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为0.13μmol/L ； 所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为1.87 μ mol/L ； 所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为1.87 μ mol/L。
4.检测新城疫病毒和鸭瘟病毒的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂。
5.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒和鸭瘟病毒产品中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述应用为用权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于 所述二重PCR扩增的退火温度为50°C-55°C，所述二重PCR扩增的退火温度具体为55℃。
8.—种检测新城疫病毒的引物对A，由权利要求1或2所述的引物组中的所述引物I和所述引物2组成； 或一种检测鸭瘟病毒的引物对B，由权利要求1或2所述的引物组中的所述引物3和所述引物4组成。
9.权利要求8所述的引物对A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒产品中的应用； 或权利要求8所述的引物对B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭瘟病毒产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测试剂盒。本发明提供的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，一次PCR反应，能同时检测并鉴别出新城疫病毒与鸭瘟病毒，与依靠传统的病原分离鉴定与血清学试验相比，二重PCR具有特异性好、敏感性高、快速、简便等特点，在临床上具有很高的应用价值。
文档编号C12N15/11GK103031385SQ20121005638
公开日2013年4月10日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者谢芝勋, 陈安莉, 谢丽基, 刘加波, 谢志勤, 庞耀珊, 邓显文, 范晴 申请人:广西壮族自治区兽医研究所