专利名称：全人源的抗人白介素21受体的单链抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可与人白介素21受体特异结合的高亲和力全人源单链抗体。
背景技术：
人白介素21 (IL-21)是最近发现的一种具有“四螺旋束”结构的I型细胞因子，其结构与IL-2、IL-4和IL-15相似。IL-21主要由活化的⑶4+T细胞产生，在淋巴细胞成熟及增殖中发挥重要作用。人白介素21受体(IL-21R)是淋巴组织，尤其是NK、B和T细胞所表达的I型细胞因子受体，是细胞因子IL-21的特异性受体。人白介素21受体的基因定位于16pll，其 cDNA的ORF编码538个氨基酸。IL-21R蛋白由前导序列、WSXWS基元、跨膜结构域、细胞外结构域和细胞内结构域组成，其结构与IL-2受体P链和IL-4受体a链高度同源。与配体结合时，IL-21R与共有的Y细胞因子受体链UC)结合，引起STATl和STAT3或STAT5 磷酸化产生生物学效应。IL-2IR在淋巴组织中广泛分布，包括脾、胸腺、外周血淋巴细胞和淋巴结。此外，流量血细胞计数还发现IL-21R表达于Jurkat (人急性T淋巴细胞白血病)、 Raji (人Burkitt淋巴瘤)、NK-92、頂_9(人B细胞系)等细胞表面。IL-21R的广泛淋巴细胞分布暗示其可能在免疫调控中起重要作用。事实上已研究征实，IL-21与IL-21R结合显著地调节B细胞、⑶4+T细胞以及NK细胞的增殖和活性， IL-21还介导由T细胞、NK细胞、巨噬细胞和滑膜细胞分泌的细胞因子和趋化因子的表达。 在一些动物模型中已研究证实，通过降低IL-21R活性可改善关节炎、移植排斥等自身免疫性疾病，如在胶原诱发关节炎小鼠爪中，IL-21R mRNA表达上调；类风湿性关节炎患者外周血单核细胞中，IL-21R mRNA表达明显增加；在哮喘模型中，IL-21R缺陷型小鼠表现出症状减轻；IL-21R缺陷型小鼠，其B细胞合成的抗原特异性IgG数量减少。此外，在急性淋巴瘤及滤泡瘤细胞可检测到大量IL-21R，抗IL-21R的抗体可治疗IL-21R应答细胞活性异常相关的过度增殖性疾病，如白血病癌症、骨髓和淋巴组织的肿瘤。因此抑制IL-21R的活性会调节IL-21R介导的免疫应答，可用于治疗、改善和预防包括炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎(RA)、移植排斥、银屑病、哮喘和系统性红斑狼疮(SLE)的炎性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤。抗人IL-21R抗体还可作诊断使用或作为祀向抗体向表达IL-21R的细胞传递治疗性或细胞毒性试剂。近10儿年来，抗体治疗免疫系统疾病已成为研究热点。随着免疫学和分子生物学的不断发展，尤其是噬菌体表面展示技术的不断完善，为制备用于早期诊断和靶向治疗免疫性疾病的特异性抗体提供了一个高效的平台。目前国内外治疗自身免疫性疾病的抗体大部分是嵌合抗体或人源化的鼠源性抗体。尽管人源化在很大程度上可以减少鼠源性抗体的免疫原性，但不能彻底去除其免疫原性，因而在临床治疗中不可避免地会中和抗体而降低其治疗价值。采用噬菌体筛选技术从全人源的单链抗体库中获得的抗体完全为人源，对人体没有免疫原性，可更为有效激活人体的生物效应功能，并且单链抗体(scFv)分子量小，保留了全分子抗体结合抗原的部位(重链和轻链可变区)，是理想的靶向药物。因此，从全人源的单链抗体库中直接筛选高亲和力的抗人白介素21受体的单链抗体将为自身免疫性疾病及肿瘤的早期诊断和靶向性治疗药物研究作出重要贡献。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人白介素21受体的单链抗体。本发明单链抗体的特征为特异性结合人IL-21R胞外区，在体外能够抑制表达 IL-21R的Jurkat细胞增殖。技术方案一种全人源的抗人白介素21受体的单链抗体，其特征在于抗人白介素21受体单链抗体包括重链可变区域和轻链可变区域，重链可变区域和轻链可变区域分别包括3个互补决定区⑶R1-3，且重链可变区域和轻链可变区域之间通过柔性肽连接，柔性肽的氨基酸序列为SSGGGGSGGGGSGGSA，SEQ ID NO :9。所述的抗人白介素21受体的单链抗体，具有重链⑶R3域，该域包含SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受体的单链抗体具有轻链CDR3域，该域包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。所述的抗人白介素21受体的单链抗体，具有重链⑶R2域，该域包含SEQ ID NO 4 的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受体的单链抗体具有轻链CDR2域，该域包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。所述的抗人白介素21受体的单链抗体，具有重链⑶Rl域，该域包含SEQ ID NO 3 的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受体的单链抗体具有轻链CDRl域，该域包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。所述的抗人白介素21受体的单链抗体，其特征在于重链可变区域的氨基酸序列为SEQ IDNO :1，轻链可变区域的氨基酸序列为SE ID NO :2，一种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码所述的全人源抗人白介素21受体的单链抗体。—种表达载体，含有所述的核酸。一种重组宿主细胞，含有所述的表达载体。上述任一项的抗体或抗体片段的偶联物。上述任一项的抗体或偶联物的应用，其特征在于制备抑制或中和IL-21R活性的诊断试剂和治疗剂。发明进一步说明本发明中全人源抗人白介素21受体单链抗体的基因序列全长732个核苷酸，有 244个氨基酸。具有116个氨基酸的重链可变区(SEQ ID NO I)和112个氨基酸的轻链可变区(SEQID NO :2)，通过16个氨基酸的柔性肽连接(SEQ ID NO 9)。
含有本发明白介素21受体单链抗体基因的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗IL-21R单链抗体的方法。本发明通过噬菌体展示抗体库技术，以人白介素21受体胞外区蛋白为靶抗原， 筛选得到一个能特异性结合IL-21R的全人源单链抗体C2 ;用0. lmmol/L IPTG诱导表达；利用超声破碎细胞，低温离心去除细胞碎片，将上清过镍亲和层析柱进行分离纯化；经 SDS-PAGE及Western Blot鉴定分离纯化得到的可溶性单链抗体C2，分子量约为30kD ;定量ELISA检测单链抗体C2与白介素21受体的亲和力；细胞增殖实验检测单链抗体C2对的表达IL-21R的Jurkat细胞的生长抑制作用。本发明得到的抗白介素21受体单链抗体与白介素21受体的结合具有高特异性， 亲和力达到I. 32X10_8M，体外抑制细胞生长实验结果表明，本发明得到的单链抗体可以明显抑制高表达IL-21R的.Jurkat细胞的生长，并且抑制作用与单链抗体C2呈浓度依赖性， IC50约7. 8X 10_8M。本发明为治疗和诊断以白介素21受体抗原的表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫性疾病及肿瘤。
图I单链抗体C2的结构示意图。图2单链抗体C2的重链可变区的氨基酸序列，在所述互补决定区VH-⑶R1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 下划线。图3单链抗体C2的轻链可变区的氨基酸序列，在所述互补决定区VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 下划线。图4SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的C2通过镍柱亲和层析纯化后的结果，泳道M为蛋白分子量标准，泳道1、2为菌体周质提取物上清，泳道3为20mM咪唑洗涤流出液，泳道4 7为50mM咪唑洗涤流出液，泳道8、9为IOOmM咪唑洗脱目的蛋白。图5Western Blot鉴定分离纯化得到的C2。图6C2的亲和力测定。图7MTT法测定全人源抗IL-21R单链抗体C2对Jurkat细胞的生长抑制作用。以下借助非限制性实施例举详细描述本发明。对本领域技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干部件的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
具体实施例方式实施例中涉及的百分比，其中固体试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。实施例I全人源抗IL-21R单链抗体的筛选以包被缓冲液(IOOmM Tris, NaCl 150mM, pH9. 0)稀释IL-21R胞外区蛋白(购自北京义翘神州生物技术公司)至IOOy g/ml，取4ml加入到免疫管中，室温包被过夜；次日， 弃上清，以PBS迅速洗管3次；将免疫管中注满2% MPBS (含有2%脱脂牛奶的PBS)，37°C封闭2h ;弃封闭液,用PBS迅速洗管3次;将卩遼菌体抗体库(1012 IO13P. f. u) (Dana library, 哈佛医学院捐赠)悬浮于4ml 2%MPBS并加入到免疫管中，室温反复倒转30min后，于室温静置90min以上；弃上清，以含有0. 1% Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污剂JfPBS吸干后加入Iml IOOmM三乙胺(700 7. 18mol/L三乙胺加入到50ml水中)，室温反复倒转IOmin,进行特异性洗脱；加入0. 5ml I M Tris (pH7. 4)迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体感染处于对数期的大肠杆菌TGl ;再用辅助性噬菌体超感染的方法从感染并扩增了的TGl制备噬菌体，进行第二轮筛选如此反复进行“吸附洗脱-感染-扩增”的筛选过程共4轮。实施例2抗IL-21R单链抗体的可溶性表达及分离纯化挑选测序正确的TGl菌株，收集噬菌粒，按常规操作(抗体药物工程，P51)感染表达大肠杆菌HB2151，培养至0D600nm ^ 0. 6，加入终浓度0. ImM的IPTG，20°C诱导过夜，12% SDS-PAGE检测诱导表达结果。6000rpm 4°C离心5min,收集菌体；PBS重悬菌体,加入lmmol/L的苯甲基磺酰氟化物，超声破碎(超声2s,间隙2s,共IOmin) ；12000rpm 4°C离心20min,收集上清；将上清过镍亲和层析柱(购自GE)，用不同浓度的咪唑洗脱；12% SDS-PAGE检测纯化的结果(见图 4)，_20°C保存目的蛋白，命名为C2，其氨基酸序列为SEQ ID NO :I和SEQ ID NO :2，由SEQ ID NO :9 相连。实施例3抗IL-21R单链抗体的Western Blot鉴定纯化得到的C2进行变性SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12 % ；4°C, IOOmA恒流转印2h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore);转印结束后，将膜在5 % MTBS (含有 5%脱脂牛奶的TBS)中4°C封闭过夜；用5% MTBS按I : 2000稀释anti-His鼠抗体 (购 Millipore)，37°C 孵育 I. 5h，TBS 洗 3 遍，每次 5min ;用 5 % MTBS 按 I : 5000 稀释 HRP-anti-Mouse 二抗(购自联科生物)，37°C孵育I. 5h，TBS洗3遍，每次5min ;用DAB显色。(见图5)实施例4可溶性单链抗体C2的亲和力鉴定用Iy g/ml和0. g/ml两种不同浓度的IL-21R重组蛋白包被ELISA板过夜， 次日，PBS洗板3次，每孔加入200 ill 3% BSA-PBS室温封闭2h，然后加入从10 y g/ml 到10ng/ml两倍倍比稀释的纯化过的单链抗体C2，室温孵育90min，以PBST (含有0. 05% Tween20的PBS)洗板3次，每孔加入100 U I用封闭液I : 1000稀释后的anti-His鼠抗体，室温孵育90min ；以PBST洗板3次，加入100 U I用封闭液I : 5000稀释后的HRP-羊抗小鼠IgG，室温孵育90min ;以PBST洗板3次，再以PBS洗板3次，最后用TMB显示；根据 ELISA读数绘制亲和力曲线，求出l/2Max 0D450对应I y g/ml和0. 5 y g/ml IL-21R的抗体浓度，分别记为[Ab](对应于I u g/ml IL-2 IR)和[Ab] ’ (对应于0. 5 u g/ml IL-2 IR)，然后用公式2[Ab] ’ -[Ab]计算单链抗体的亲和力。根据图6，我们得出以下结论本发明中的单链抗体C2与重组人白介素21受体胞外区蛋白的亲和力达到1.32X10_8M.因此，本发明的人源性单链抗体C2具有高亲和力、特异性结合人白介素21受体胞外区的功能及免疫疾病诊断与靶向治疗的潜在价值。实施例5抗IL-21R单链抗体对Jurkat细胞的生长抑制作用10ng/ml乙酰豆蘧佛波酯PMA和I ii g/ml Ionomycin (购自福麦斯生物)刺激16h的Jurkat细胞(购自上海细胞库)，以2 X 106/ml接种96孔细胞培养板，50 U I/孔，将培养的Jurkat细胞分为5组，按照分组要求加入无血清1640培养液2倍梯度稀释的单链抗体C2，每孔50iU，在37°C 5% CO2培养箱中培养48h，观察细胞生长状况后每孔加入Ilyl 的MTT，37°C继续培养4h，3000rpm离心5min，倾去上清，每孔加入150 u I DMS0，用酶标仪测定每孔570nm/630nm波长处的吸光值(0D值)，记录结果，以单链抗体C2的浓度为横坐标， 570/630nm光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线，并通过标准方法测定IC5(I。结论由于人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞经PMA和Ionomycin刺激后表面可大量表达IL-21R，为了检测单链抗体C2对表达有天然构象IL-21R的Jurkat细胞的作用，我们用不同浓度C2测定其对Jurkat细胞的生长抑制作用。结果表明，本发明得到的单链抗体可以明显抑制Jurkat细胞生长，并且抑制作用与单链抗体C2呈浓度依赖性，IC50约 7.8X10_8M。具体结果由图7所示。
权利要求
1.抗人白介素21受体单链抗体包括重链可变区域和轻链可变区域，重链可变区域和轻链可变区域分别包括3个互补决定区⑶R1-3，且重链可变区域和轻链可变区域之间通过柔性肽连接，柔性肽的氨基酸序列为SSGGGGSGGGGSGGSA，SEQ ID NO :9。
2.根据权利要求I所述的抗人白介素21受体的单链抗体，其特征在于所述的抗人白介素21受体的单链抗体，具有重链CDR3域，该域包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受体的单链抗体具有轻链CDR3域，该域包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求I所述的抗人白介素21受体的单链抗体，其特征在于所述的抗人白介素21受体的单链抗体，具有重链CDR2域，该域包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受体的单链抗体具有轻链CDR2域，该域包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
4.根据权利要求I所述的抗人白介素21受体的单链抗体，其特征在于所述的抗人白介素21受体的单链抗体，具有重链CDRl域，该域包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受体的单链抗体具有轻链CDRl域，该域包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
5.根据权利要求I所述的抗人白介素21受体的单链抗体，其特征在于重链可变区域的氨基酸序列为SEQ ID NO :1，轻链可变区域的氨基酸序列为SEQ ID NO :2。
6.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求I的全人源抗人白介素21受体的单链抗体。
7.—种表达载体,含有权利要求6所述的核酸。
8.—种重组宿主细胞，含有权利要求7所述的表达载体。
9.偶联物含有权利要求I 5任一项的抗体或抗体片段。
10.权利要求I 4或9中任一项的抗体或偶联物的应用，其特征在于制备抑制或中和 IL-21R活性的诊断试剂和治疗剂。
全文摘要
本发明属基因工程抗体技术领域，具体地公开了一种全人源抗人白介素21受体的单链抗体C2，及其制备方法和用途。本发明还公开了C2的重链可变区和轻链可变区免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括对应于互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列。本发明还提供表达C2的方法，从天然人源噬菌体抗体库中筛选得到一株全人源抗人白介素21受体单链抗体C2，通过原核系统分泌表达、镍柱亲和层析纯化获得单链抗体。本发明的单链抗体可特异性结合于人白介素21受体，能抑制白介素21受体的活化，适应于治疗与白介素21受体有关的疾病，包括类风湿性关节炎、移植排斥的自身免疫疾病和其它免疫系统疾病，亦可以应用于偶联于可检测物质和治疗剂。
文档编号C12N15/13GK102532320SQ20121005569
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者吴沁航, 张娟, 王彤, 王旻, 罗辰 申请人:中国药科大学