一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体设及一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和 禽腺病毒=联灭活疫苗。
【背景技术】
[0002] 鸡新城疫具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养 殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。
[0003] 禽流感是由A型流感病毒引起的、主要流行于动物和人类中的一种传染性、死亡率 高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，并且经常变异，对人类和养禽业危害很 大。
[0004] 通过对I群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，可通过水平 和垂直两种途径传播，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围也越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、 蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病，特别是2010年W后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流 行。许多I群禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但是I群4型 禽腺病毒例外，可直接引起鸡群发病，主要病变表现为屯、包积液和肝、肾肿大，本病于1963 年首次在美国发生，随后在世界各地相继出现，是全世界家禽和野禽常见的传染病原。1976 年我国台湾省首次发生本病，之后全国各地均有发生本病的报道，且呈逐年上升趋势，给鸡 养殖业带来严重的危害。
[0005] 近些年来，鸡新城疫、朋亚型禽流感是较为常见的严重威胁家禽的巧巾重要疾病； 而鸡群对I群4型禽腺病毒的感染愈来愈多，此病很容易引起继发感染疫病，给禽业养殖户 带来很多烦恼，而且多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多 次抓鸡的注射应激，还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来毒株的 不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，所W需 要筛选获得新的流行毒株来应对变异所造成的新的危害。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒=联灭活疫苗， 从而弥补现有技术的不足。
[0007] 本发明的=联灭活疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病 毒；
[000引其中鸡新城疫病毒优选为鸡新城疫病毒La Sota株；
[0009] 其中禽流感病毒优选为H9亚型禽流感病毒孤Y株(Avian influenza virus)，于 2015年4月29日保藏在中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCC N0:V201517。
[0010] 禽腺病毒为I群4型禽腺病毒YBAV-4株，于2015年10月15日保藏在中国武汉，武汉 大学的中国典型培养物保藏中屯、，其保藏编号为CCTCC No.V201541。
[0011] 上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醒灭活；
[0012] 本发明的灭活疫苗的制备方法如下：
[001引 1)油相制备：
[0014] 取矿物油95份，硬脂酸侣1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80°C后，再加5份 司本80 (Span-80 )，至溫度达到115 °C时维持40分钟，冷却后完成油相制备；
[0015] 2)水相制备：
[0016] 将灭活的新城疫病毒液、禽流感病毒液、I群禽腺病毒毒液混合;取混合抗原液95 份，灭菌的5份吐溫80，充分混匀；
[0017] 其中新城疫病毒液、禽流感病毒液、I群禽腺病毒的数量比优选为1:1:2;
[001引 3)乳化
[0019] 取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再W3500r/min揽拌30~40分钟完成乳 化制备。
[0020] 本发明的疫苗所使用的朋亚型禽流感病毒QDY株和I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒 株的TCIDso/EI化0效价高、免疫原性好并能抵御朋亚型及禽腺病毒病各地方分离毒的攻击。 本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期 试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，=联 苗无明显差异，均稳定有效;效力试验结果证明，=联苗和=种单苗抗体均保持高水平，比 同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴性。
【具体实施方式】
[0021] 申请人筛选获得了一株新型变异的I群4型禽腺病毒，将该病毒与鸡新城疫病毒、 禽流感病毒一起来制备联合疫苗，从而促成了本发明。
[0022] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0023] 实施例l:YBAV-4株毒株的筛选
[0024] 1、流行病学调查自2010年W来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现 了一种W死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、屯、包积水为特点的疾病，经临床调查和实验 室检测，初步诊断为I群C-4型禽腺病毒引起的屯、包积水肝炎综合征。2010年，发明人从山东 溜博某养殖场有包涵体肝炎和屯、包积水典型症状的病死鸡肝脏中成功分离到1株病毒。
[0025] 2、病毒分离取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液； 反复冻融3次后，300化/min离屯、30min，取上清;加入青霉素和链霉素各lOOOOIU/ml，4°C过 夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液W〇. 2ml/胚的剂量， 经卵黄囊途径接种6.5日龄SPF鸡胚，弃2地内死胚，取接种4她~16化内死亡鸡胚的尿囊液 和胎儿，用上述方法处理后连续传代，观察第3代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、胚体矮 小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎儿，一20°C保存。
[0026] 3、病毒的鉴定
[0027] 3.1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液5~IOml,反复洗3~5次，末次用生理盐 水将血细胞泥稀释成0.8%、1%和2%浓度，4°C保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具 有凝集运些红细胞的特性。同时设虹群禽腺病毒抓SV-76为凝集反应阳性对照。结果：分离 毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。虹群禽腺病毒 EDSV-76能够凝集鸡、鸭的红细胞。
[00%] 3.2理化特性检验参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别W5-漠尿喀晚-2'- 脱氧核巧(BUDR)、氯仿、乙酸、盐酸(pH3)、氨氧化钢(pHlO)、溫度(60°Cah)处理后，接种鸡 胚(0.2ml/胚），另设生理盐水处理组作为对照。接种5d后观察鸡胚病变。结果:分离毒分别 经BUDR、氨氧化钢(pHl0)和60°C、化处理后，接种鸡胚，鸡胚表现正常，PCR检测阴性。表明 BUDR能抑制病毒在鸡胚中的复制，分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60 °C，化可被灭活。而经乙酸、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒在鸡胚中的增殖，出 现明显的鸡胚病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有脂质囊膜，对乙酸和氯仿有抵抗力，耐 酸。
[00巧]3.3血清学鉴定
[0030] 3.3.1群特异性鉴定利用琼脂凝胶扩散试验(AGP)制备琼脂凝胶平板对分离毒株 进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm，孔 距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔力日I群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株 标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37°C作用，24~4她观察是否出现凝 集沉淀线。结果:分离毒抗原仅能与I群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与m群 禽腺病毒邸SV-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。
[0031] 3.3.2型特异性鉴定I群禽腺病毒1~12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再按 2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法，将I群禽腺病毒1~12型标准毒株、分离 毒对I群禽腺病毒1~12型标准阳性血清进行交叉中和试验，记录中和效价结果。结果:分离 毒测4型标准阳性血清的中和效价（1:501)与4型标准毒株测4型标准阳性血清的中和效价 (1:537)较接近;分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1: IOW下。表明分离株是 血清4型。
[0032] 3.4PCR检测及基因测序病鸡肝脏无菌研磨，反复冻融3次，利用柱式动物DNA提取 试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测。1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性样品进行Hexon基 因测序，并进行遗传进化分析。根据化xon基因序列比对和遗传进化分析结果可W看出，分 离毒与I