一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF为具有序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子的质粒。本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂GM-CSF，可以有效提高免疫效果，极大缩短免疫空白期，同时可抵抗母源抗体，提高免疫保护率。本发明对于新城疫病的防治具有重大价值。
【专利说明】一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002]新城疫病(Newcastle Disease, ND),又称亚洲鸡痕,是由新城疫病毒(NewcastleDisease Virus,NDV)引起的一种禽类高度接触性和急性败血性的传染病，是严重危害世界养禽业的重大烈性传染病之一。NDV是一种RNA病毒，几乎可以感染所有禽类，病鸡是该病的主要传染源，鸡感染后临床症状出现前24h，其口、鼻分泌物和粪便就有病毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。在流行间歇期的带毒鸡，也是本病的传染源。鸟类也是重要的传播者。病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。该病一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场内的鸡一旦发生本病，可于4~5d内波及全群。
[0003]目前，预防新城疫的主要方法是接种疫苗免疫。由于弱毒疫苗使用方便且能够诱导体液免疫和局部黏膜免疫，在国内外被普遍应用。但此类疫苗常常需要在首次接种后的15天左右才能产生相应保护抗体，即存在免疫空白期。如果新城疫一旦爆发在疫苗接种的免疫空白期，鸡群将无法得到有效的免疫保护。因此，在新城疫的预防工作中，迫切需要一种可以刺激机体快速产生抗体从而缩短免疫空白期的高效安全的新型弱毒疫苗。此外，母源抗体的干扰是新城疫疫苗早期免疫失败的重要原因之一，抵抗母源抗体干扰的新城疫疫苗，在新城疫免疫实践中具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。
[0005]本发明提供的鸡新城疫病毒毒株(命名为rClone30-GM-CSF病毒)，其制备方法包括如下步骤:将重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL_P质粒和pBL_L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF为具有序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30-GM_CSF病毒的基因组DNA。
[0006]所述重组质粒pBrClone30-GM_CSF具体可为序列表的序列3所示的质粒。
[0007]所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
[0008]rClone30-GM_CSF病毒的制备方法具体如下:
[0009] (I)将所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL_P质粒和pBL_L质粒共转染BHK-21 细胞(每1\106个细胞转染14 8重组质粒？81"(:101^30-61^5?、0.54 8 pBL-N质粒、0.25 μ g pBL-P质粒和0.1 μ g pBL-L质粒)，置于5% C02、37°C环境中静置培养72h ;
[0010](2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(其中含有rClone30-GM-CSF 病毒)。
[0011]rClone30-GM-CSF病毒的制备方法具体如下:
[0012](I)将所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL_P质粒和pBL_L质粒共转染BHK-21 细胞(每1\106个细胞转染14 8重组质粒？81"(:101^30-61^5?、0.54 8 pBL-N质粒、0.25 μ g pBL-P质粒和0.1 μ g pBL-L质粒)，置于5% C02、37°C环境中静置培养72h ;
[0013](2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
[0014](3)取步骤⑵得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
[0015](4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
[0016](5)将步骤⑵得到的鸡胚尿囊液、步骤(3)得到的鸡胚尿囊液和步骤⑷得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为rClone30-GM-CSF病毒液。
[0017]本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株(命名为rClone30-GM-CSF病毒)，其基因组DNA如序列表的序列3自5 ’末端第2703-18408位核苷酸所示。
[0018]本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。
[0019]本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗，包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。
[0020]本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株，命名为rClone30-GM_CSF，因此简称毒株rClone30-GM-CSFo毒株rClone30-GM_CSF是将chGM-CSF多肽的编码基因插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30 (简称毒株Clone30，弱毒株，为现有的新城疫病活疫苗)的基因组的F基因和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-GM-CSF免疫鸡群后，可以使鸡快速产生抗体，将免疫空白期从15天缩短为7天，弥补了现有新城疫活疫苗产生抗体时间过长的缺点，在母源抗体存在的情况下仍可以激发幼鸡产生抗体，解决了现有疫苗不能抵抗母源抗体的缺点。
[0021]本发明构建的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。
[0022]本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂GM-CSF，可以有效提高免疫效果，极大缩短免疫空白期，同时可抵抗母源抗体，提高免疫保护率。本发明对于新城疫病的防治具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为重组质粒pBrClone30-GM_CSF的元件示意图。
[0024]图2为混合液的HA效价和HI效价结果。
[0025]图3为PCR鉴定电泳图。
[0026]图4为实施例2的结果。
[0027]图5为实施例3的结果。
[0028]图6为实施例4的结果。
[0029]图7为实施例5的结果。
【具体实施方式】
[0030]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0031]提及“pBrClone30 质粒”的文献！“Enhancement of ant1-tumor activity ofNewcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase，，, ZhengLVj Asian Pac J Cancer Ptev.。
[0032]提及“pBL-N 质粒”、“pBL-P 质粒”和 “pBL_L 质粒”的文献！Geneticallyengineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drugcandidate for cancer immunotherapy, Fuliang Baij Immunology letters.。
[0033]pBK:lone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之间具有HpaI和MluI酶切识别位点。将pBK:lone30质粒、PBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL_N质粒、pBL_P质粒和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组)，得到毒株Clone30。
[0034]提及“NDV强毒BJ株”的文献:“鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其遗传变异分析”，校海霞，河北农业大学硕士学位论文。
[0035]BHK-21 细胞:ATCC 编号为 CRL-13001。
[0036]DF-1 细胞:ATCC 编号为 CRL-12203。
[0037]SPF级白色来航鸡:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
[0038]chGM-CSF多肽的全称为鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，如序列表的序列2所示，其编码基因的开放阅读框如序列表的序列I自5’末端第16至450位核苷酸所示。
[0039]完全DMEM培养基即为含有5%胎牛血清的DMEM培养基。
[0040]鸡血红细胞凝集(HA)试验的具体方法如下:⑴在血凝板第一排的1-12孔各加Λ 50 μ L生理盐水；(2)在第I孔中加入50 μ L待测病毒液，混匀后吸50 μ L到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除50yL ;(3)在1-12孔中各加入50 μ LI %鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
[0041]鸡血红细胞凝集抑制(HI)试验的具体方法如下:(I)在血凝板的1-12孔各加入25 μ L生理盐水；(2)第I孔加入待检血清25 μ L，混匀后吸25 μ L至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第10孔混匀后弃除25 μ L ; (3)在1-12孔中各加入25 μ L实施例1制备的rClone30病毒液(4个血凝单位)，室温静置30min ； (4)在1_12孔中各加入25 μ LI %鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
[0042]实施例l、rClone30-GM_CSF病毒液的制备
[0043]一、重组质粒的构建
[0044]1、合成序列表的序列I所示的双链DNA分子。
[0045]序列表的序列I中，自5’末端第I至6位核苷酸为限制性内切酶HpaI的识别序列，第10-15位核苷酸为Kozac序列，第16至450位核苷酸为chGM-CSF多肽的编码基因，第451至456位核苷酸为限制性内切酶Mlu I的识别序列。
[0046]2、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切步骤I得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
[0047]3、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约16000bp的载体骨架。
[0048]4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30-GM-CSFo重组质粒pBrClone30-GM_CSF的核苷酸序列如序列表的序列3所示(序列表的序列3中，自5’末端第2703-18408位核苷酸为rClone30-GM_CSF病毒的基因组)。重组质粒pBrClone30-GM-CSF的元件示意图见图1。
[0049]二、重组病毒的制备
[0050]1、将重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL_N质粒、pBL-P质粒和pBL_L质粒共转染BHK-21 细胞(每 I X 16 个细胞约转染 I μ g 重组质粒 pBrClone30-GM-CSF、0.5 μ g pBL-N质粒、0.25 μ g pBL-P质粒和0.1 μ g pBL-L质粒)，置于5% C02、37°C环境中静置培养72h。
[0051]2、取步骤I得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为4096，HI效价为256)。
[0052]3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为2048，HI效价为1024)。
[0053]4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为1024，HI效价为512)。
[0054]5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液(该混合液的HA效价为2048，HI效价为512，见图2)。
[0055]6、取步骤5得到的混合液，提取总RNA并反转录为cDNA，采用Fl和Rl组成的引物对进行 PCR 鉴定(Fl:5 , -GTTAACGCCGCCACCATGCTGGCACAGCTGACTATTCTGC-3 , ；R1:5 , -ACGCGTTTAGATGCAGTCTTTCTCCTCTGGC-3 ^ )，结果见图3。PCR扩增片段大小约为450bp，与预期相符。
[0056]结果表明，成功制备了具备感染性的表达chGM-CSF多肽的NDV病毒，将步骤5得到的混合液命名为rClone30-GM-CSF病毒液。
[0057]三、对照病毒的制备
[0058]用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30-GM_CSF进行步骤二的I至5,得到的混合液命名为rClone30病毒液。
[0059]实施例2、检测病毒液中chGM-CSF的表达量
[0060]1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量感染实施例1制备的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM_CSF病毒液用完全DMEM培养基稀释)，37°C静置孵育lh，然后用完全DMEM培养基洗涤三遍，然后加入含I μ g/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基并置于5% C02、37°C环境中静置培养48h，然后反复冻融3次，取上清液。
[0061]2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-GM-CSF病毒液，其它同步骤
1
[0062]3、采用GM-CSF试剂盒(CSB-E17363C，Cusab1)并按说明书进行操作，分别检测步骤I得到的上清液和步骤2得到的上清液中的chGM-CSF的浓度。
[0063]结果见图4。结果表明，rClone30-GM-CSF病毒能够稳定表达chGM-CSF，而rClone30 病毒不表达 chGM-CSF。
[0064]实施例3、rClone30-GM_CSF病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线
[0065]1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量将实施例1制备的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM_CSF病毒液用完全DMEM培养基稀稀释)接种于细胞单层，采用含I μ g/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基，置于5% CO2、37°C环境中静置培养96h，每隔24h取上清液并测定TCID5Q。
[0066]2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-GM_CSF病毒液，其它同步骤
1
[0067]结果见图5。rClone30-GM-CSF病毒与rClone30病毒保持着一致的繁殖滴度。结果表明，chGM-CSF的编码基因的插入并不影响rClone30病毒的增殖能力。
[0068]实施例4、rClone30-GM-CSF病毒或rClone30病毒免疫鸡后的HI抗体效价
[0069]参照农业部标准，青年鸡的抗体效价> 51og2时判为合格。特别是在30日龄前后抗体水平低于此标准，如果在此期间有强毒侵入，就有可能暴发新城疫。如果鸡群能在此期间达到此标准，将不受新城疫病毒的威胁。
[0070]取30日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下(均为单次免疫):
[0071]第一组:每只通过滴鼻点眼的方式免疫200 μ L实施例1制备的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM-CSF病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为15TCID50A).1ml)；
[0072]第二组:每只通过滴鼻点眼的方式免疫200 μ L实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID5(l/0.lml)；
[0073]第三组:每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L0.9%生理盐水。
[0074]分别于免疫后7d、14d、21d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。
[0075]结果见图6。免疫后7d，第一组血清的HI效价高于51og2，第二组的效价低于31og2,即rClone30-GM-CSF病毒液将可以实现早期保护效果，使鸡免受新城疫病毒的威胁，而rClone30病毒液将无法在免疫后7d实现有效保护鸡免受新城疫病毒的威胁。
[0076]实施例5、重组病毒rClone30-GM_CSF或rClone30免疫含母源抗体的鸡后的HI抗体效价
[0077]在养鸡生产中，一个鸡群的母源抗体水平往往参差不齐，其中一些母源抗体水平较低的雏鸡在其幼龄阶段易感染野毒和带毒，当其它雏鸡母源抗体水平下降时，它们亦依次受感染，使野毒在鸡群中的传播连绵不断，遗留很大的潜在威胁。据有关文献报道，蛋鸡出雏后在不同日龄测定其新城疫母源抗体水平，结果显示:1日龄母源抗体为6.61og2 ；7日龄时抗体水平下降为4.71og2 ;到10日龄时抗体水平降到41og2以下，如果以抗体效价41og2为临界保护值，I日龄雏鸡母源抗体保护率为95%，7日龄母源抗体保护率为80%，到10日龄时母源抗体保护率只有50%。
[0078]取I日龄的含母源抗体的白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下(均为单次免疫):
[0079]第一组:每只通过滴鼻点眼的方式免疫200 μ L实施例1制备的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM-CSF病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为15TCID50A).1ml)；
[0080]第二组:每只通过滴鼻点眼的方式免疫200 μ L实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID5(l/0.lml)；
[0081]第三组:每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L0.9%生理盐水。
[0082]分别于免疫后OcU 6d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。
[0083]结果见图7。
[0084]实施例6、攻毒试验
[0085]将30日龄SPF级白色来航鸡随机分为3组，每组30只。分别处理如下(均为单次免疫):
[0086]第一组:实验第I天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L实施例1制备的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM_CSF病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为15TCID5tlA).lml)；
[0087]第二组:实验第I天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为15TCID50A).1ml)；
[0088]第三组:实验第I天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L0.9%生理盐水。
[0089]实验第8天，采用NDV强毒BJ株进行攻毒(每只鸡采用14 ELD5tl的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml)，实验第18天，统计各组的发病与死亡情况。结果见表1。
[0090]表1各组的发病与死亡情况统计(三次试验的平均值)
[0091]
【权利要求】
1.一种鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤:将重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL_L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClOne30-GM-CSF为具有序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子的质粒。
2.如权利要求1所述的鸡新城疫病毒毒株，其特征在于:所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF为序列表的序列3所示的质粒。
3.如权利要求1或2所述的鸡新城疫病毒毒株，其特征在于:所述哺乳动物细胞为BHK-21 细胞。
4.一种鸡新城疫病毒毒株，其基因组DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示。
5.权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。
6.一种鸡新城疫病疫苗，包括权利要求1 至4中任一所述的鸡新城疫病毒毒株。
【文档编号】A61K39/17GK104164410SQ201410386913
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月7日 优先权日:2014年8月7日
【发明者】李德山, 王卉, 张天援, 何金娇 申请人:哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司