专利名称：重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及禽副粘病毒(APMV)和APMV序列。本发明涉及用于插入和表达外源基因以用作保护免受多种病原体侵害的安全免疫媒介物的病毒载体。其涉及在反向遗传学体系中用于产生活减毒疫苗的载体疫苗。其还涉及可用于在体外表达载体中产生亚单位或用作待被整合入病毒或质粒类型体内表达载体的序列的多核苷酸。本发明涉及未修饰的和经修饰的APMV病毒，其制备和使用方法以及某些DNA和蛋白质序列。更具体地，本发明涉及其中病毒的天然基因组已被改变的APMV病毒(“APMV突变体“或“重组APMV” )和涉及制备及使用此类APMV变体或重组APMV的方法。
背景技术：
病毒载体疫苗代表疫苗开发的最快速成长领域之一。主要的全球感染性疾病HIV、 肺结核(tuberculosis)和疟疾的许多处于临床开发中的疫苗是基于病毒载体。动物的病毒载体疫苗已上市，例如用于陪伴动物(companion animal)和家禽的禽痘病毒疫苗、用于家禽的禽疱疹病毒载体疫苗和用于野生动物的痘苗病毒载体疫苗。但其它家畜类载体疫苗处于开发中。病毒载体疫苗的有利方面是它们可被安全地施用，这是由于使用已被大大减毒并且其本身在动物中不引发疾病的载体主链所致。目前使用的病毒载体的不利方面是母传抗体或因以往感染而获得的抗体的存在。此类抗体将中和载体病毒，从而减少载体疫苗的成功。载体疫苗开发的一个主要动力是最先在亚洲、随后在欧洲和非洲发生的高致病性流感病毒H5W的出现。已开发了几种载体疫苗候选物，包括禽痘病毒(Taylor等人， 1988)、痘苗病毒(Chambers等人，1988)、劳氏肉瘤病毒(Hunt等人，1988)、腺病毒(Tang等人，2002，Gao等人，2006)，委内瑞拉马脑炎病毒Gchultz-Cherry等人、2000)、新城疫病毒 (US6, 719，979，Veit s 等人，2006，Swayne 等人，2002，Park 等人，2006)、传染性喉气管炎的疱疹病毒(Veits等人2003)，火鸡的疱疹病毒(Darteil等人，19%)以及基于腺病毒的载体疫苗(Hoelscher等人，2008，Toro等人，2007)。已在首次用于实验的鸟中测试了这些载体疫苗的功效，但到目前为止还没有公布关于这些载体疫苗在对所述病毒载体和/或由所述插入物编码的蛋白质有预存免疫的鸟类中的功效的报导。副粘液病毒科包括人(麻疹，腮腺炎，副流感和呼吸道合胞病毒)和动物病原体 (新城疫病毒和牛瘟病毒)，所述病毒对公共卫生以及全球经济造成重大影响(Lamb等人， 2007)。该病毒科的成员定义为具有单组分(monopartite)反义单链RNA基因组。副粘液病毒科由两个亚科即副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和肺炎病毒亚科(Pneumovirinae) 组成。根据最近的重新分类，副粘病毒亚科包括5个属即麻疹病毒属(Morbillivirus)、亨尼波病毒属(Henipavirus)、Rubulavirus、呼吸系病毒属(Respirovirus)禾口 Avulavirus， 而月市炎病毒亚科包括月市炎病毒属(Pneumovirus)和偏月市病毒属(Metapneumovirus) (Mayo,2002)。禽副粘病毒(APMV)被分类在腮腺炎病毒属中，包括已使用血凝抑制(HI)试验 (Alexander, 1988)确定的9个抗原上不同的血清型。在这9个血清型中，属于APMV-I亚型的分离株可引起商业家禽的灾难性疾病，并且被分类为速发型新城疫病毒(NDV)。NDV 的更温和形式被称为中发型和缓发型分离株，其中后一种形式在家禽中大多无症状。属于 APMV-2、3、6和7的分离株也与家禽的疾病相关。具体地，APMV-2和3的分离株引起的感染可引发轻度呼吸性疾病和蛋质量和数量上的问题(Bankows ki等人，1981 ；Redmann等人， 1991 ；Tumova等人，1979 ；Zhang等人，2007)。已知APMV-6和7的分离株感染火鸡、鸭和候鸟并且可诱导呼吸性疾病，所述疾病可牵涉继发感染(Saif等人，1997 ；Shortridge等人， 1980)。在另一方面，已从鸭、水禽和其它野生鸟类分离了 APMV-4、5、8和9的分离株，但所述鸟类在病毒感染后极少显示临床症状(Alexander等人，1983 ；Capua等人，2004 ；Gough 等人，1984 ；Maldonado 等人，1995 ；Shortridge 等人，1980)。几个NDV分离株的完整基因组序列已被确定并且用于阐释NDV毒力的各种决定簇(de Leeuw 等人，1999 ;Krishnamurthy 等人，1998 ;Zou 等人，2005)。在最近两年中， 除APMVl外的几种APMV序列已被公布，例如APMV-2的GenBank登录号EU338414、APMV-3 的 EU403085、APMV-4 的 FJ177514、APMV-6 的 EU622637、APMV-7 的 FJ231524、APMV-8 的 FJ215863、FJ215864和FJ619036、APMV-9的EU910942。除了序列信息外，关于致病因子知之甚少。APMV 2-9的分离株大部分是从候鸟分离的。有趣地，鲜见用此类分离株对鸡进行实验性感染的报导(Saif等人，1997)。由于这些APMV在野生鸟类中广泛传播，并且在某些情况下已从有时引起它们死亡(Saif等人，1997 ；Shihmanter等人，1998 ；Shihmanter等人，1998)的商业鸟群中(aiang等人，2007)分离到所述APMV，因此需要了解关于它们在禽类中的毒力的知识。大多数APMV分离株引起相对轻度的疾病，所述疾病在伴随细菌或病毒感染存在时可恶化，这可能导致经济影响。具体地，APMV-2最早在1956年作为二级病原体从南加利福尼亚的受急性喉气管炎影响的鸡中分离到(Bankowski等人，1960)。由于该血清型的许多株已从几个鸟类物种分离到，这表明APMV-2在世界上被广泛传播(Andral等人，1984 ； Bradshaw 等人，1979 ；Fleury 等人，1979 ；Goodman 等人，1988 ；Lang 等人，1975 ；Lipkind 等人，1982 ；Lipkind等人，1979 ；Zhang等人，2006)。Bankowski等人报导了产蛋雌火鸡对APMV-2的自然以及人工暴露造成了孵化率和家禽产率(poultry yield)的显著下降 (Bankowski等人，1981)。APMV-4分离的最初实例是从美国密西西比候鸟迁栖所经路径上的猎人杀死的野生鸭(Webster等人，1976)以及在家禽的流行性感冒监测分析(influenza surveillance programs of poultry)期间在香港从鸡、鸭和鹅(Alexander 等人，1979)分离至IJ。除了来自患有出血性肠炎的环颈鸭的分离株(Gough等人，1984)外，所有其它分离株在家禽中似乎是非致病性的，并且发现它们在全世界的水禽中具有广泛分布(Manislawek 等人，2002 ；Tumova等人，1989 ；Yamane等人，1982)。Gough等人报导在用来自环颈鸭的分离株鼻内接种1周龄小鸭子和2周龄鸡后未获得临床体征，并且HI滴度极低(1 :8或更低) (Gough等人，1984)。类似地，作为流感监测项目的结果，APMV-6的第一个分离株也是来自香港的家禽，并且据报导在鸡中是非致病性的(基于来自实验性感染的鸡的低HI滴度) (Shortridge等人，1980)。然而，已报导了导致轻度呼吸性疾病和产蛋问题的火鸡APMV-6 感染(Alexander，2003)。
APMV-8(鹅/特拉华/1053/76)最早在美国从猎人杀死的加拿大鹅(黑额黑雁 (Brantacanadensis))分离而来(Rosenberger等人，1974)。南西班牙的猎鸟的血清学研究(1990至199 显示，APMV-8抗体在达到43 %的测试血清中大量存在(Maldonado等人，1995)。就APMV感染测定新西兰的活的健康驯化野鸭的状态的另一个血清学研究显示， APMV-8抗体在56%的测试血清中存在Gtanislawek等人，200 。Warke等人Q008)描述了 16%至31%的被研究鸡血清可能本来具有APMV-8抗体。但因现有的抗APMVl的高滴度， 假阳性HI测试的可能性也可能存在，因为血清在HI测定中不能非常特异性地反应。除当就禽流感病毒研究群体时分离的APMV-8的少数水禽分离株外(Stallknecht等人，1991)， 一直缺乏关于该病毒的流行和致病性的信息。用于NDV的负链RNA基因组的反向遗传学体系的开发使得可能将外源基因序列插入基因组，从而使得可能产生用于接种和基因治疗的重组NDV载体(Krishnamurthy等人， 2000 ；Peeters等人，1999 ；Roemer-Oberdoerfer等人，1999)。已报导了表达外源病毒蛋白例如流感病毒A型的Hl亚型的HA蛋白(Nakaya等人，2001)、传染性腔上囊病病毒的VP2 蛋白(IBDV) (Huang 等人，2004)、H5 亚型(Veits 等人，2006 ；Ge 等人，2007)和亚型 H7 (Park 等人，2006)的禽流感染病毒血凝素的重组NDV载体。然而，仅在SPF禽中证明了大多数此类疫苗的功效。NDV在家禽中引起灾难性疾病，导致家禽工业的严重经济损失。因此在世界上大多数国家常规地给商业鸡接种抗NDV的疫苗。因此，来自已免疫的亲代群体的鸡具有高水平的母传抗体。常规活NDV疫苗即使在这些抗体存在的情况下也提供保护作用。然而，重组NDV疫苗(具有外源基因插入)与活NDV疫苗相比较通常更加减毒，它们的功效在 NDV母传抗体存在的情况下可被削弱。因此，存在对可为用于表达异源抗原的安全疫苗提供基础的载体疫苗平台的需要。理想地，重组疫苗可诱导强体液免疫反应，可适用于大量施用，并且廉价。发明概述本发明涉及包含⑴重组APMV和(ii)药用或兽医学可接受的载体的疫苗或组合物。本发明包括用于修饰APMV的基因组以产生重组APMV病毒或APMV病毒载体的方法；通过此类方法制备的经修饰的APMV ；DNA和蛋白质序列；以及利用此类重组APMV感染细胞和宿主动物以引起所述细胞和宿主动物扩增外源DNA和由该外源DNA编码的蛋白质(包括抗原性蛋白质)的方法。本发明的一个方面涉及APMV病毒、参与制备经修饰的或重组的病毒的DNA和蛋白质序列。本发明的一个实施方案涉及APMV-2、4、6或8的基因组和蛋白质序列。本发明的另一个方面涉及经修饰的重组APMV病毒(所述病毒具有增强的安全性、 强体液免疫反应)以及制备此类重组病毒的方法。本发明的另一个方面涉及与已知的APMV或其它重组疫苗相比具有升高的安全水平的重组APMV病毒疫苗或组合物。在另一个方面，本发明提供了用于在宿主中表达基因产物的未修饰的和经修饰的 APMV病毒载体。本发明的另一个方面涉及通过将来自任何来源的DNA插入APMV基因组的基因间区域或非必需区域而修饰的重组APMV病毒。根据本发明使用具有编码和表达抗原的异源基因的合成地修饰的APMV病毒重组体来产生新型组合物或疫苗，
本发明的另一个方面涉及提供反向遗传学体系的APMV病毒载体，其中所述载体可在不同的宿主动物中用作主链用于重组疫苗或组合物。在一个方面，本发明涉及用于在以组合物或疫苗接种的宿主动物中诱导免疫反应的药物组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括药用可接受的载体和经修饰的APMV重组病毒或病毒载体。在本发明的另一个方面，所述重组APMV病毒或病毒载体在病毒基因组的非必需区域内包括编码来源于病原体的抗原性蛋白质的异源DNA，其中当给宿主施用时，所述组合物或疫苗能够诱导特异于由所述病原体编码的蛋白质的免疫反应。本发明的另一个方面涉及用于在动物中诱导对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括用含有经修饰的重组APMV病毒或病毒载体(所述载体包含和表达所述动物的病原体的抗原决定簇)的疫苗或药物组合物接种动物。本发明的另一个方面涉及在初免-加强方案中诱导动物的对抗原的免疫反应的方法。本发明的另一个方面涉及通过向细胞引入经修饰的重组APMV病毒来在体外细胞培养物中表达基因产物的方法，其中所述基因可以是来源于病原体的抗原性蛋白。附图概述可结合附图理解通过举例给出的下列详细描述，这些实例并不意在将本发明限定于所描述的具体实施方案，其中
图1是显示在用APMV_2、4、6于含胚鸡蛋中进行实验性感染后从鸡的几个器官进行的病毒分离列表。图2是显示在用APMV_2、4、6进行实验性感染后鸡的几个器官的组织学结果列表。图3描述了利用APMV-2、4或6实验性接种的SPF鸡中的HI抗体滴度。对感染后第2、4、7、14和25天收获的鸡血清样品进行HI测试以分析HI抗体的存在情况。图4显示利用APMV-8实验性感染的SPF鸡和鸭内的HI抗体滴度。利用剂量为 IO6EID50的APMV-8鼻感染鸡和鸭。在感染后第2、4、7、14和观天收集血清样品，利用APMV-8 抗原通过HI测试分析所述样品。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。图5显示在利用APMV-8的初免/加强接种方案过程中SPF鸡中HI抗体滴度的发展情况。在第1天(初免)和第14天(加强)利用剂量为IO6EID5tl的APMV-8感染1日龄 SPF鸡。在第一次感染后第7天和第14天获得血清样品，在第二次感染后第7天和第14天获得血清样品。对血清进行HI测试。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。图6显示通过琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR产物。在感染后第2天从非感染的鸭 (C1-C5)和APMV-8感染的鸭(11-15)获取气管组织。将组织勻浆，制备RNA以用于RT-PCR。 平行制备水对照(W)。在1.5%琼脂糖凝胶上分离反应产物。通过使用IOObp分子量梯度 (New Eng 1 andBiolabs)作为片段大小的对照。DNA片段的大小显示于右边。图7是显示来自用APMV-8实验性感染的鸡和鸭的病毒分离列表。在含胚鸡蛋中进行鸡组织的病毒分离，通过RT-PCR检测来自鸭组织的病毒RNA。图8是显示在用APMV-8感染鸡和北京鸭后几个器官的组织学检查结果的列表。图9显示在用不同剂量的APMV-8感染后在SPF鸡中HI抗体滴度的发展情况。在第1天用不同感染剂量(ID)的APMV-8感染或用病毒转运液(VTM)模拟感染1日龄SPF鸡。 在感染后第7天和第14天获取血液，通过HI测试分析获得的血清样品。HI血清滴度(以 log2表示)示于左轴上。血清样品的几何平均滴度(GMT)示于最底行。
图10显示在用不同剂量的APMV-8感染后北京鸭中HI抗体滴度的发展情况。在第1天用不同感染剂量(ID)的APMV-8感染或用病毒转运液(VTM)模拟感染1日龄SPF北京鸭。在感染后第7天和第14天获取血液，通过HI测试分析获得的血清样品。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。血清样品的几何平均滴度(GMT)示于最底行。图11是显示相应DNA和蛋白质序列的SEQ ID NO的列表。图12描述了 APMV-8株(APMV-8 =SCffDS ID :MA_7，从野鸭分离的)的全长基因组序列和全长APMV-8基因组的遗传图谱。图12描述了编码APMV-8核蛋白(NP)的DNA序列(SEQ ID NO 2)和NP蛋白序列 (SEQ ID NO :3)。图13描述了编码APMV-8磷蛋白(P)的DNA序列(SEQ ID NO 4)和P蛋白序列 (SEQ ID NO :5)。图14描述了编码APMV-8基质蛋白(M)的DNA序列(SEQ ID NO 6)和M蛋白序列 (SEQ ID NO :7)。图15描述了编码APMV-8融合蛋白(F)的DNA序列(SEQ ID NO 8)和F蛋白序列 (SEQ ID NO 9)。图16描述了编码APMV-8血凝素/神经氨酸苷酶(HN)的DNA序列(SEQ ID NO 10)和 HN 蛋白序列(SEQ ID N0:11)。图17描述了编码APMV-8聚合酶(L)的DNA序列(SEQ ID NO 12)禾口 L蛋白序列 (SEQ ID N0:13)。该 APMV_8L(1)蛋白是从位于 SEQ I D NO 1 的位置 8273-8275 处的 ATG 密码子翻译的。图18描述了 APMV-8聚合酶(L)的蛋白质序列(2) (SEQ ID NO 14)。该APMV_8L(2) 蛋白是从位于SEQ ID NO :1的位置8297-8299处的ATG密码子翻译的。SEQ ID N0:14不包含SEQ ID NO 13的前8个氨基酸。图19A是APMV-8反向遗传学体系的流程图。图19B描述了 APMV-8病毒在MDCK 细胞中的复制结果。图20描述了在APMV-8接种2周后商业肉鸡的HI测试结果。图21描述了在APMV-8接种4周后商业肉鸡的HI测试结果。图22显示在卵内接种(in ovo vaccination)后第18天HI测试的结果(研究 1)。图23描述了在卵内接种后第19天HI测试的结果(研究2)。图M显示了在卵内接种后第18天HI测试的结果(研究3)。图25描述了 5，-全长基因组(5，-FLG)和3，-全长基因组(3，-FLG)序列，包括侧翼序列。图 26 描述了 pcNDA-NP，pcNDA-P，pcDNA-L 和 pcDNA3_T7 的质粒图谱。图 27 描述了 pUC18-MG-APMV-8 和 pCITE4A_EGFP 的质粒图谱。图 28 描述了 pUC57-FL-APMV-8 的质粒图谱。图四描述了微型基因组APMV-8序列。图30显示NP蛋白质序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。图31显示P蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
图32显示M蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。图33显示F蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。图34显示HN蛋白序列比对及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。图35显示L蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性，发明详述应理解在本公开内容，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”、“含有”等可具有美国专利法中所赋予的意义；例如，它们可意指“包括”、“包含”、“含有”等；并且术
语例如“基本上由......组成”和“基本上由......构成”具有美国专利法中所赋予的意
义，例如，它们允许有未明确记载的要素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新特征的要素。除非另外指出，否则按照常规惯用法使用技术术语。分子生物学中的常见术语的定义可见于 Benjamin Lewin 的 Genes V,由 Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)出版；Kendrew等人(eds. )，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.，1994 (ISBN 0-632-02182-9)出版；和 Robert A. Meyers (ed.)， Molecular Biology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference, 由 VCH Publishers, Inc. ,1995 (ISBN 1-56081-569-8)出版。除非另外明确地指出，否则单数“一种/个(a)”、“一种/个(an)”、“该/所述 (the)”包括所指物的复数形式。类似地，除非另外明确地指出，单词“或”意指包括“和”。 单词“或”意指特定列表的任一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。应指出，在本公开内容和所述权利要求和/或段落中，术语“禽副粘病毒”或 “APMV” 可互换使用，意指和包括 APMV-l、APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-5、APMV-6、APMV-7、 APMV-8 及 APMV-9。术语“动物”在本文中包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。本文中使用的动物可选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、丛林狼(coyote)、豺(jackal))、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫科动物以及其它猫科动物包括猎豹和山猫)、 牛类动物(例如，牛)、猪类(例如，猪)、羊类(例如，绵羊、山羊、美洲驼、野牛)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、鸦、鸵鸟、食火鸟(emu)和食火鸡)、灵长类动物 (例如，原猴、跗猴、猴、长臂猿、猿)、人和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段(包括胚胎期和胎儿期)中的个体动物。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，意指连续氨基酸残基的聚合物。术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指RNA、DNA、cDNA(互补DNA) 或cRNA(互补RNA)及其衍生物，例如包含经修饰主链的形式。应理解，本发明提供了包含与本文中描述的序列互补的序列的多核苷酸。本发明中涉及的“多核苷酸”包括正向链(5’ 至3’ )和反向互补链(3’至5’)。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式制备(例如， 通过化学合成，通过基因克隆等)并且可采取不同形式(例如，线性或分支的，单链或双链的，或其杂交体、引物、探针等)。术语“基因组DNA”或“基因组”可互换使用，是指宿主生物的可遗传的遗传信息。 基因组DNA包括细胞核的DNA (也指染色体DNA)，而且还包括质体(例如，叶绿体)和其它细胞器(例如，线粒体)的DNA。本发明中涉及的基因组DNA或基因组也指病毒的RNA。所述RNA可以是正链或负链RNA。本文中涉及的术语“基因组DNA”包括包含与本文中描述的序列互补的序列的基因组DNA。术语“基因组DNA”也指信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA) 和互补RNA (cRNA)。本文中使用的术语“基因组RA (核酸)”包括RNA、mRNA、cRNA、DNA禾口 cDNA,术语“基因”被广泛地用于指与生物学功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因或多核苷酸包括内含子和外显子(如在基因组序列中)或只是编码序列(如在cDNA中)， 例如开放阅读框(ORF)，其始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)、终于终止信号(终止密码子)。基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达(例如转录起始、翻译和转录终止)的区域。因此，还包括的是启动子和核糖体结合区(一般地，这类调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至250个核苷酸；Doree SM等人.；Pandher K等人.；ChungJY等人)、转录终止子(一般地，终止子位于编码序列或基因的终止密码子的下游约50个核苷酸内；Ward C K等人)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能RNA、或者编码特定蛋白质以及包括调控序列的核酸片段。本文中使用的术语“异源DNA ”是指来源于不同生物体例如与受者不同的细胞类型或不同的物种的DNA。该术语还指宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中将所述异源DNA插入基因组内与其原始位置不同的区域。如本文中所使用的，术语“抗原”或“免疫原”意指诱导宿主动物的特定免疫反应的物质。抗原可包括杀死的、减毒的或活的完整生物体；生物体的亚单位或部分；包含具有免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递至宿主动物后诱导免疫反应的一段DNA或 DNA片段；多肽、表位、半抗原或其任何组合。可选择地，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒
ο本文中使用的术语“免疫原性蛋白质或肽”包括具有免疫活性的多肽，其意义是所述多肽在当给宿主施用时其能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应。优选所述蛋白质片段是这样的片段，所述片段具有与完整蛋白质大体上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由或由其组成。“免疫原性”蛋白质或多肽，如本文中所使用的，包括该蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包括一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。可使用本领域内公知的许多表位作图技术鉴定此类片段。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第 66 卷(Glenn Ε. Morris,Ed.，1996)。例如，线性表位可通过例如在固体支持物上同时合成大量肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)，将所述肽与抗体反应(同时肽仍然连接于支持物上)来确定。此类技术在本领域内是已知的，并且描述于例如美国专利No. 4，708, 871 ；Geysen等人，1984 ；Geysen等人，1986。 类似地，构象表位可通过例如利用诸如χ射线晶体学和2维核磁共振测定氨基酸的空间构象来容易地鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocol s，同上。术语“免疫原性蛋白质或肽”还涉及对序列的缺失、添加和置换，只要所述多肽能够产生如本文中定义的免疫反应即可。术语“保守性改变”意指用另一个生物学上相似的残基对氨基酸残基的置换，或核酸序列中核苷酸的置换从而所编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上相似的残基)。在这方面，特别优选的置换通常在性质上是保守的，即在氨基酸的家族内发生的置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；( 碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；C3)非极性一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。保守性改变的实例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残基的置换，或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换、谷氨酸对天冬氨酸的置换或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或用结构上相关的、对生物活性不具有重大影响的氨基酸对氨基酸的类似保守替换。因此，与参照分子具有大体上相同的氨基酸序列但具有最少氨基酸置换、基本上不影响蛋白质的免疫原性的蛋白质在所述参照多肽的定义内。通过这些修饰产生的所有多肽包括在本文中。术语“保守性改变”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲代氨基酸，只要针对该取代的多肽产生的抗体也与该未被取代的多肽免疫反应即可。“宿主细胞”表示已被遗传改变或能够通过施用外源多核苷酸例如重组质粒或载体而被遗传改变的原核或真核细胞。当指遗传改变的细胞时，该术语是指原始改变的细胞和其后代。可将包含期望的序列的多核苷酸插入适当的克隆或表达载体，然后可将所述载体引入适当的宿主细胞以进行复制和扩增。可利用本领域已知的任何方法将多核苷酸引入宿主细胞。可利用许多适当方法中的任何方法将包含目的多核苷酸的载体引入宿主细胞，所述方法包括直接摄入、胞吞、转染、交配、电穿孔、利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、 DEAE-葡聚糖或其它物质进行的转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(其中载体是感染性的，例如逆转录病毒载体)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。对组合物或疫苗的“免疫反应”是在宿主中产生针对目的组合物或疫苗的细胞/ 或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括但不限于下列效应中的一种或多种特异于包含在目的组合物或疫苗中的(一种或多种)抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，从而对新型感染的抗性得到增强和/或减轻疾病的临床严重度。这样的保护作用可通过由被感染的宿主通常显示的症状的减轻或不存在、被感染宿主的更快的恢复时间和/或更低的病毒滴度来证明。本发明的一个实施方案提供了 APMV-8的基因组DNA序列和编码的蛋白质序列。本发明的APMV-8株的互补基因组DNA(cDNA)序列具有SEQID NO 1中所示的多核苷酸序列。 APMV-8 基因组 cDNA 序列(SEQ ID NO 1)与 APMV-1 基因组 DNA(SEQ ID NO 15)具有 48% 的序列同一性，与APMV-2基因组DNA(SEQ ID NO 16)具有61 %的序列同一性，与APMV-3基因组 DNA(SEQ ID NO :17)具有 47. 2%的序列同一性，与 APMV-4 基因组 DNA(SEQID NO :18) 具有47. 6%的序列同一性，与APMV-6基因组DNA(SEQ ID NO :19)具有52%的序列同一性， 与APMV-7基因组DNA (SEQ ID NO 20)具有53%的序列同一性，与APMV-8基因组DNA (SEQ ID NO: 37)具有 99. 的序列同一性，与 APMV-8 基因组 DNA (SEQ ID NO :38)具有 96. 5% 的序列同一性，与APMV-8基因组DNA (SEQ ID NO 39)具有96. 4%的序列同一性，与APMV-9 基因组DNA(SEQ ID NO :40)具有48%的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID N0:l、2、4、6、8、10或12所示序列的多核苷酸及其变体或片段。本发明还包括与本文中描述的多核苷酸互补的链。在另一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13或14中所示序列的多肽及其变体或片段。此外，来自APMV例如APMV-8、APMV-2、APMV-4、APMV-6株的多核苷酸或多肽的同源物意欲包括在本发明的范围内。如本文中所使用的，术语“同源物”包括直向同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能、但在不相关生物中分别进化的两种多核苷酸或多肽。术语“直向同源物”是指来自不同物种、但通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两种多核苷酸或多肽。通常，直向同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过在基因组内复制而关联的两种多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。野生型APMV多肽的类似物、直向同源物和旁系同源物可以通过翻译后修饰、因氨基酸序列差异或两者而与野生型APMV多肽不同。具体地，本发明的同源物通常与APMV-8的多核苷酸或多肽序列的全部或部分展示至少 80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，并且展示相似的功能。在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO :1中所示序列的APMV-8基因组 cDNA。在另一个实施方案中，所述多核苷酸是具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸的反向互补链。在另一个实施方案中，所述多核苷酸或本发明多核苷酸的反向互补链与具有 SEQ ID NO :1中所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个实施方案中，本发明提供了编码AMPV-8多肽的多核苷酸的片段，所述多核苷酸例如编码具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13或14所示序列的多肽的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了编码多肽或保守变体、等位基因变体、同源物或包含这类多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段或这类多肽的组合的多核苷酸，所述多肽与具有SEQ ID NO :3，5，7，9，11，13或14所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID N0:l、2、4、6、8、10或12所示核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一个实施方案中，所述多核苷酸是具有SEQ ID N0:1所示序列的多核苷酸的反向互补链。在另一个方面，本发明提供了与SEQ ID N0:l、2、4、6、8、10或 12所示序列的多核苷酸之一具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95^^96%,97^^98%或99%的序列同一性的多核苷酸或其反向互补链，或其变体。在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13或14所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、 98%或99%的序列同一性的多肽。在另一个方面，本发明提供上文中鉴定的APMV多肽(SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13或14)的片段和变体，其可由本领域技术人员使用公知的分子生物学技术来容易地制备。变体是具有与SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13或14所示氨基酸序列有至少75 %、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的同源多肽。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指包含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列改变并且存在于天然群体(例如，病毒种类或变种)中。此类天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内1-5%的差异。等位基因变体可通过对许多不同物种的目的核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定这些物种内相同基因座来容易地进行。任何和所有此类核酸变异以及因天然等位基因变异而产生的并且不改变目的基因功能活性的所得氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的范围内。关于序列的术语“同一性”可以是指例如相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以两个序列中更短序列的核苷酸或氨基酸数目，其中可按照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和 Lipman)测定这两个序列的比对。两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包Qnvitrogen, 1600Faraday Ave., Carlsbad, CA)来测定。当RNA序列被称为与DNA序列相似，或具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为与RNA序列中的尿苷(U)等同。因此，RNA序列在本发明的范围内并且可以从DNA序列衍生而来，其中DNA序列中的胸苷(T)被视为与RNA 序列中的尿苷(U)等同。在一个方面，本发明涉及用于在用疫苗或组合物接种的宿主动物中诱导免疫反应的药物组合物或疫苗，所述疫苗或组合物包含药用可接受载体和经修饰的APMV重组病毒或病毒载体。在本发明的另一个方面，所述重组APMV病毒或病毒载体在病毒基因组的非必需区域内包括异源DNA序列，所述异源DNA序列编码来源于病原体的抗原性蛋白质，其中所述组合物或疫苗当给宿主施用时能够诱导特异于由该病原体编码的所述蛋白质的免疫反应。“载体”是指包含待被体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA 质粒、噬菌体或病毒。所述异源多核苷酸可包括用于预防或治疗目的的目的序列，并且任选地可以以表达盒的形式存在。如本文中所使用的，载体不一定能够在最终的靶细胞或受试者中复制。该术语包括用于克隆的载体以及病毒载体。术语“工程改造的”或“重组的”意指非天然存在的或以非天然发现的排列方式与另一个多核苷酸相连接的半合成或合成来源的多核苷酸。术语“非必需区域”是指病毒基因的区域，所述区域不是病毒在组织培养中复制和增殖所必需的，并且其缺失或失活可降低在多种动物系统中的毒力。任何非必需区域或其部分可从APMV基因缺失，或可将外源序列插入其中，由缺失或插入而引起的重组APMV的活力和稳定性可用于确定缺失的区域或其部分是否确实是非必需的。在一个实施方案中， APMV基因组的非必需区域是APMV-2、4、6或8基因组上的不编码聚合酶(L)的任何区域。 在另一个实施方案中，非必需区域包括编码非必需蛋白质的开放阅读框。在这方面，开放阅读框选自核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)和血凝素/神经氨酸苷酶 (HN)。在一个实施方案中，非必需区域位于NP基因的上游。在另一个实施方案中，非必需区域位于L基因的下游。在另一个实施方案中，非必需区域是非编码区或基因间区域。在这方面，非编码或基因间区域可以是APMV-2、4、6或8基因组上的NP与P基因之间、P与 M基因之间、M与F基因之间或F与HN基因之间的区域。在另一个实施方案中，非必需区域可在 SEQ ID NO 1 的核苷酸位点 1-140、1526-1692、四10-3085、4195-4498、6130-6382、 8116-8272,8116-8289 或 15013-15342 的区域中。在另一个方面，本发明包括APMV嵌合体，其中APMV载体的一个部分或完整的基因或者几个部分或完整的基因被来自其它病毒(特别是属于副粘液病毒科的病毒)的相似基因替代。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自禽病原体，包括、但不限于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、鸡产蛋下降综合征病毒(EDQ或传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽腺病毒、马雷克病病毒(MDV)、禽痘病毒、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭细小病毒、禽流感病毒、APMV例如 APMV-I等，及其组合。在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自猫科动物病原体，例如但不限于猫疱疹病毒(FHV)、猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒O^eLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫科动物细小病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、狂犬病病毒等，及其组合。在另一个实施方案中，本发明的疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自犬病原体，包括但不限于狂犬病病毒、犬疱疹病毒(CHV)、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、 犬副流感病毒2 (CPI2)、犬冠状病毒、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、出血性黄疸钩端螺旋体(L印tospiraicterohaemorragiae)、感冒伤寒性钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、■{白氏疏电累旋体(Borrelia burgdorferi)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)等，及其组合。在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自马科动物病原体，例如马疱疹病毒(1型或4型)、马流感病毒、破伤风病毒、西尼罗病毒、马动脉病毒等，或其组合。在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自牛、绵羊或山羊病原体，例如狂犬病病毒、牛轮状病毒、牛副流感病毒3型(bPIV-3)、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛瘟病毒(RPV)、小反刍动物瘟疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus) (PPRV)、恶性卡他热病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBR)、大肠杆菌、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德 lif (Pasteurellahaemolytica) ，1 !^^^在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自猪病原体，例如但不限于猪流感病毒(SIV)、猪环状病毒2型(PCV-2)、猪繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRS)、假性狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、FMDV、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、红丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopa thiae)、多杀巴斯德菌 (Pasteurella multocida)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchis印tica)、大肠杆菌等，及其组合。重组病毒的构建在本领域是公知的，如描述于例如美国专利No. 4，769，330、 4，722, 848,4, 603，112,5, 174，993 和 5，756，103、6，719，979 中。具体地，可在两个步骤中构建重组APMV病毒。首先，将待插入病毒的目的基因(例如来自APMV-I (NDV)或禽流感病毒或其它生物体的抗原的开放阅读框)置于大肠杆菌(E. coli)质粒构建体中，该质粒构建体中插入有与APMV的cDNA的一部分同源的cDNA。分开地，待插入的cDNA基因序列之前有启动子区(基因起始区)，之后有特异于APMV载体的基因末端区域。该基因起始/外源抗原/基因末端DNA片段侧翼连接含有独特限制性内切酶切割位点的与APMV-8cDNA同源的 cDNA片段。随后通过在大肠杆菌细菌中生长来扩增所得的质粒构建体，分离质粒构建体。 然后将重组质粒用于限制性内切酶消化以切出侧翼连接有与APMV-8cDNA同源的cDNA的所述基因起始/外源抗原/基因末端DNA片段，将该片段连接至适当切割的APMV-8全长构建体中。将含有目的基因的全长构建体与含有用于表达APMV核蛋白(NP)、APMV磷蛋白(P) 和APMV RNA聚合酶(L)以及T7RNA聚合酶的多核苷酸的质粒一起转染入细胞。所有APMV cDNA构建体处于T7聚合酶启动子的控制之下。如Riimer-Oberdiirf er等人，1999中所述和如图19A中所示进行感染性病毒的拯救。可通过不同的方法(包括包含T7RNA聚合酶的表达盒的质粒DNA、表达T7RNA聚合酶的重组病毒(例如鸡痘或金丝雀痘病毒)的转染) 或在表达T7RNA聚合酶的细胞中获得T7RNA聚合酶在转染细胞中的表达。在另一个方面， 用于表达APMV核蛋白(NP)、APMV磷蛋白(P)以及APMV RNA聚合酶(L)和全长病毒cRNA 的多核苷酸处于人巨细胞病毒的立即早期启动子的控制之下。如^10皿K，等人，2003中所述进行病毒的拯救。通过修饰的感染性病毒成功地表达插入的目的cDNA (外源cDNA或异源cDNA)需要两个条件。首先，为使所述经修饰的病毒保持存活，必须将插入物引入病毒的基因组的区域。插入cDNA表达的第二个条件是存在允许所述基因在病毒背景中表达的调控序列(例如基因起始区、基因终止区、启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、基因间和非翻译区域)。一般而言，利用在真核细胞中具有功能的强启动子是有利的。在一个实施方案中， 用于通过病毒RNA聚合酶转录病毒mRNA的启动子是“基因起始序列”。“基因起始序列”是 L蛋白结合并且将下游定位的病毒RNA转录成病毒mRNA的结合位点。在一个实施方案中，本发明提供了施用治疗有效量的APMV疫苗以将抗原、表位或免疫原递送入靶细胞并且表达。治疗有效量的确定对于本领域技术人员来说是常规实验。 在一个实施方案中，APMV疫苗制剂包含含有多核苷酸的表达载体以及药用或兽医学可接受的载体、媒介物或赋形剂，所述多核苷酸编码抗原、表位或免疫原。在另一个实施方案中，所述药用或兽医学可接受的载体、媒介物或赋形剂有利于转染和/或促进载体或蛋白质的保存。所述药用或兽医学可接受的载体或媒介物或赋形剂对于本领域技术人员来说是公知的。例如，药用或兽医学可接受载体或媒介物或赋形剂可以为0. 9% NaCl (例如，盐水) 溶液或磷酸缓冲液。可用于本发明的方法的其它药用或兽医学可接受载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药用或兽医学可接受载体或媒介物或赋形剂可以是有利于所述载体(或从本发明的载体体外表达的蛋白质)的施用，或有利于所述载体(或蛋白质)的转染和/或改善其保存的任何化合物或化合物的组合。剂量和剂量体积在本文综述部分有论述，并且可由本领域技术人员结合本领域知识通过阅读本公开内容来确定，而不需要任何过度实验。在另一个实施方案中，药用或兽医学可接受的载体、赋形剂或媒介物可以是油包水乳剂。适当的油包水乳剂的实例包括在4°C下稳定并且为流体的基于油的油包水疫苗乳齐U，其包含；6至50V/V%的含抗原水相，12至25V/V%、50至94V/V%的全部或部分含有不可代谢的油(例如，矿物油例如石蜡油)和/或可代谢的油(例如，植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的油相，0. 2至20p/v%的表面活性剂，3至8p/v%的后者全部或部分为聚甘油酯，或存在于聚甘油酯的混合物中，所述聚甘油酯为聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或其它氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳剂中的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨糖醇酯(例如，可从AppliChem，he.，Cheshire，CT获得的聚氧乙烯Q0)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN80 )和可从Sigma Aldrich, St. Louis, MO获得的脱水山梨糖醇酯(例如，脱水山梨糖醇单油酸酯(SPAN80 ))。此外，关于油包水乳剂，也参见美国专利No. 6，919，084。在某些实施方案中，含抗原水相包括含有一种或多种缓冲剂的盐水溶液。 适当的缓冲溶液的实例为磷酸缓冲盐溶液。在一个实施方案中，油包水乳剂可以为水/油 /水(ff/0/ff)三重乳剂(参见，例如，美国专利No. 6，358，500)。其它适当的乳剂的实例描述于美国专利No. 7，371,395中。根据本发明的药物组合物和疫苗可包括一种或多种佐剂或基本上由其组成。用于本发明实施的适当的佐剂为(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、顺丁烯二酸酐的聚合物和烯基衍生共聚物，(2)免疫刺激序列(I SS)，例如具有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996 ；W098/16247)，(3)水包油乳剂，例如由M. Powe 11,M. Newman, Plenum Press (1995)出版的"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach，，中第147页上描述的SPT乳剂，和相同著作中第183页上描述的乳剂MF59，(4)包含季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或⑶通过引用并入本申请中的任何文献中论述的其它佐剂，或(9)其任何组合或混合物。特别适合于病毒载体的水包油乳乳剂(3)可基于液态石蜡(欧洲药典型类型)、 类异戊二烯油例如角鲨烷、角鲨烯、由烯烃例如异丁烯或癸烯的寡聚化而产生的油、酸或具有直链烷基的醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯或分支的脂肪醇或酸的酯，特别地异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合用于形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如(一方面)脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇与(另一方面)油酸、异硬脂酸、蓖麻酸或羟硬脂酸的酯，所述酯任选地被乙氧基化，或为聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic，例如L121。在(1)型佐剂聚合物中，优选交联的丙烯酸或甲基丙烯酸 (特别是通过糖或多元醇的聚链烯基醚(polyalkenyl ether)交联的)的聚合物。此类化合物称为卡波姆(Pharmeuropa，第8卷，no. 2，June 1996)。本领域技术人员也可参考美国专利No. 2，909，462，其提供了此类通过具有至少3个羟基(优选不超过8个这样的基团)的多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，至少3个羟基的氢原子被具有至少两个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选基团为包含2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它乙烯系不饱和基团。不饱和基团还可包含其它取代基，例如甲基。以名称Carbopol (BTOoodrich， Ohio, USA)销售的产物是特别适合的。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。 在它们当中，可提及的有卡波姆974P、934P和971P。关于顺丁烯二酸酐-烯基衍生物共聚物，优选EMA (Monsanto)，其为直链或交联的乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物，它们例如通过二乙烯醚交联。也可参考J. Fields等人，1960。关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的基本单位形成
权利要求
1.一种组合物或疫苗，其包含(i)重组APMV病毒载体和(i i)药用或兽医学上可接受的载体。
2.权利要求1的组合物或疫苗,其中所述APMV为APMV-8、APMV-2、APMV-4或APMV-6。
3.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中所述APMV病毒载体包含与具有SEQID NO 1 中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID N0:1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
4.权利要求1-3中任一项的组合物或疫苗，其中所述APMV病毒载体还包含编码抗原的分离的多核苷酸，并且其中所述多核苷酸被插入在APMV基因组的非必需区域内。
5.权利要求3的组合物或疫苗，其中所述非必需区域选自下述区域位于NP开放阅读框上游的非翻译区、APMV基因组的两个开放阅读框之间的基因间区域和位于L开放阅读框下游的非翻译区。
6.用于产生重组APMV病毒载体的方法，其中所述方法包括将分离的多核苷酸在APMV 基因组的非必需区域内引入所述APMV基因组。
7.权利要求6的方法，其中所述APMV为APMV-8、APMV-2、APMV-4或APMV-6。
8.权利要求6或7的方法，其中所述APMV包含与具有SEQID NO=I中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述非必需区域选自下述区域位于NP开放阅读框上游的非翻译区、APMV基因组的两个开放阅读框之间的基因间区域和位于L开放阅读框下游的非翻译区。
10.权利要求6-9中任一项的方法，其中所述方法包括步骤a)制备表达NP、P和L基因的表达质粒；b)制备在全长APMV基因组的非必需区域中包含分离的多核苷酸的转录质粒；c)将所述表达质粒和转录质粒转染入宿主细胞；d)从所述宿主细胞拯救/回收感染性APMV病毒。
11.权利要求6-9中任一项的方法，其中所述方法包括步骤a)制备表达NP、P和L基因的表达质粒；b)制备在全长APMV基因组的非必需区域中包含分离的多核苷酸的转录质粒；c)制备表达T7聚合酶的表达质粒；d)将所述表达质粒和转录质粒转染入宿主细胞；e)从所述宿主细胞拯救/回收感染性APMV病毒。
12.用于在动物中诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括用包含重组APMV病毒载体的组合物或疫苗接种所述动物，其中所述重组APMV病毒载体包含和表达所述动物的病原体的抗原。
13.权利要求12的方法，其中以初免-加强方案诱导动物的对所述抗原的免疫反应。
14.权利要求12的方法，其中所述动物是禽类、马科动物、犬科动物、猫科动物、猪类、 牛类、羊类或人。
15.包含选自下列序列的多核苷酸的未修饰或经修饰的APMV病毒a)与具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；b)与编码具有SEQID NO :3中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；c)与编码具有SEQID NO :5中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；d)与编码具有SEQID NO :7中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；e)与编码具有SEQID NO :9中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；f)与编码具有SEQID NO :11中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO 10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；和g)与编码具有SEQID NO :13中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与编码具有SEQ ID NO :14中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ IDNO 12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO 12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
16.权利要求15的经修饰的APMV病毒，其还包含插入在APMV基因组的非必需区域中的分离的多核苷酸。
17.一种分离的多核苷酸，其选自a)与具有SEQID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸， 或与同具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；b)与编码具有SEQID NO :3中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；c)与编码具有SEQID NO :5所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；d)与编码具有SEQID NO :7中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；e)与编码具有SEQID NO :9中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；f)与编码具有SEQID NO :11所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO :10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；和g)与编码具有SEQID NO :13中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与编码具有SEQ ID NO :14中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ IDNO 12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO :12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
全文摘要
本发明包括工程化APMV组合物或疫苗。所述疫苗或组合物可以是重组APMV组合物或疫苗。本发明包括用于修饰APMV的基因组以产生重组APMV的方法；利用此类方法制备的经修饰的APMV；DNA和蛋白质序列；以及利用这样的重组APMV感染细胞和宿主动物的方法。
文档编号C07K14/115GK102573901SQ201080045564
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月20日 优先权日2009年8月21日
发明者E·蒙德特, J·普利特查德, M·巴布洛特, T·梅巴特森 申请人:佐治亚州大学研究基金会, 梅里亚有限公司