使用胰高血糖素样激素再靶向内肽酶治疗癌症的方法

专利名称：：使用胰高血糖素样激素再靶向内肽酶治疗癌症的方法使用胰高血糖素样激素再靶向内肽酶治疗癌症的方法本专利申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2009年8月14日提交的第61/233，978号美国临时专利申请(将其通过引用整体并入本文)的优先权。癌症是超过100种疾病的组群，在所述疾病中一組细胞显示不受控制的生长(超出正常限制的細胞分裂)。在大多数情况下，癌細胞形成一団称为肿瘤的細胞，尽管在某些癌症如白血病中，细胞不形成肿瘤。肿瘤可以是恶性的或良性的。此外，恶性肿瘤(或癌症)包括具有异常遗传物质的細胞并且通常经历快速不受控制的細胞生长，侵袭并且破坏邻近组织，并且有时通过淋巴液或血液扩散至身体的其它位置(即，转移)。癌症与死亡的高发生率相关，因为如果不终止癌症在整个身体中的侵袭和转移，那么癌細胞将侵袭生命器官，并且导致器官的功能障碍，最终导致死亡。癌症的恶性性质使它们区别于良性肿瘤，所述良性肿瘤通常缓慢生长并且具有自限性，不侵袭或转移，这样，它们通常不威胁生命。在局部、局域或远距离阶段上的癌症被认为是侵袭性的。仅在少数几层细胞中发现的非常早期的癌症(称为原位癌)被认为是非侵袭性的。癌症是它们的病因和生物学有很大不同的不同种类的疾病。癌症可由多种单独作用或組合作用的因素引起。某些癌症由外部因素例如烟草、饮食、某些化学药品、辐射和病毒引起。其它癌症由内部因素例如激素、免疫状况和固有的遗传突变引起。从暴露于引发癌症的因素至疾病可被检测通常经历10年或更多年的时间。癌症通常通过与肿瘤相似的細胞的类型来分类，因此，组织假定为肿瘤的来源。癌是衍生自上皮細胞的恶性肿瘤。该组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。肉瘤是衍生自结缔组织或间充质細胞的恶性肿瘤。胚细胞瘤通常是与未成熟或胚胎组织相似的恶性肿瘤。此类肿瘤中的许多肿瘤在儿童中最常见。淋巴瘤和白血病是衍生自造血(形成血液的)細胞的恶性肿瘤。最后，生殖細胞肿瘤是衍生自全能細胞的肿瘤。在成人中，最常见地见于睾丸和卵巣中；在胎儿、婴儿和幼儿中，最常见地见于身体中线，特別地在尾骨的尖端。癌症是美国的第二大死亡原因，据估计在1998年发生1，2，600例新病例和564，800例死亡。在过去的50年中，癌症的死亡率一直在稳定上升，主要归因于因吸烟引起的肺癌死亡率的大大上升。癌症在所有年齢的人中发生，但其发生在45岁以上的人中极大地増加。然而，癌症是美国35至65岁的人的第一大死因，并且其也是15岁以下美国儿童中的非事故死亡的第一大原因。男性因癌症而具有比女性更高的死亡率，并且黑人具有任何主要人种组的最高癌症死亡率。在美国，男性发生癌症的终生危险为约1/2，女性具有约1/3的终身风险。随着预期的心脏病和中风引起的死亡的持续減少，癌症到2010年将成为整个美国人ロ的总体上第一大死因。癌症的诊断通常需要由病理学家对组织活检样本进行组织学检查，虽然恶性肿瘤的最初指标可以是症状或放射摄影影像异常。一旦被诊断，通常通过手术、化学疗法、放射疗法或靶向疗法如免疫疗法、激素疗法或血管生成抑制剂疗法来治疗癌症。治疗的选择取决于肿瘤的位置和分级及疾病的分期，以及患者的一般健康状况(体力状态)。此外，取决于癌症的类型和分期，可同时组合或相继使用这些类型的癌症治疗的两种或更多种治疗。虽然完全除去癌症而不损害身体的其余部分是治疗的目的，但目前治疗癌症的方法只获得有限的成功。关于手术，这部分归因于个别或少数癌細胞侵袭邻近组织或转移至远距离部位的倾向性，从而限制局部手术治疗的功效。化学疗法和放射疗法的功效通常受到对身体正常组织的毒性和损伤的限制。虽然靶向疗法具有前景，但正如它们的名称所暗示的，这类治疗通常特异于ー种特定类型的癌症。因此，对于癌症的治疗高度期望可靶向癌細胞(无论它们的位置如何)的化合物和方法。此外，可靶向目前无靶向疗法的特定类型的癌症的化合物和方法也是高度期望的。梭菌毒素例如肉毒毒素(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)抑制神经元传递的能力正被用于许多治疗禾ロ美容应用中，參见例如WilliamJ.Lipham,CosmeticandClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack,Inc.，2004)。作为药物组合物的商购可得的梭菌毒素包括BoNT/A制剂，例如BOTOX丨(Allergan,Inc.,Irvine,CA)>DYSPORT/RELOXIN,(BeaufourIpsen,PortonDown,England)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)BTX-A(LanzhouInstituteBiologicalProducts,China)禾ロXEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.，Frankfurt,Germany)；以及BoNT/B制剂，例如，MY0BL0CTM/NEUR0BL0C(SolsticeNeurosciences,Inc.SanFrancisco,CA)。例如，BOTOX目前在一个或多个国家被批准用于下列适应症失弛缓症、成人痉挛状态(adultspasticity)、肛门裂、背痛、眼睑痉挛、夜磨牙症、颈肌张力障碍、特发性震颤、眉间皱纹(glabellarlines)或运动过度面部皱纹(hyperkineticfaciallines)、头痛、半面痉挛、膀胱的活动过度、多汗症、青少年脑瘫、多发性硬化、肌阵挛障碍(myoclonicdisorder)、鼻唇皱纹(nasallabiallines)、痉挛性发音困难(spasmodicdysphonia)、斜视和VII神经障碍。梭菌毒素治疗通过中断用于将神经递质分泌入突触间隙的胞吐过程来抑制神经递质释放。该中断最终通过包含酶促结构域的梭菌毒素轻链的細胞内递送来实现，所述轻链在所述酶促结构域中切割胞吐过程所必需的SNARE蛋白。制药エ业极其期望使梭菌毒素疗法的用途超出其目前的肌肉松弛应用，扩展至治疗其它疾病例如多种基于感觉神经的疾病如慢性疼痛、神经原性感染和泌尿生殖器疾病以及基于非神经障碍例如胰腺炎和癌症。目前被利用于扩展基于梭菌毒素的治疗的ー个方法包括修饰梭菌毒素以便经修饰的毒素对于非梭菌毒素靶细胞具有改变的细胞靶向能力。该再靶向能力通过用靶向性结构域(显示对于存在于非梭菌毒素靶细胞中的非梭菌毒素受体的选择性结合活性)替代梭菌毒素的天然存在的靶向性结构域来实现。对靶向性结构域的此类修饰导致能够选择性结合存在于非梭菌毒素靶细胞的非梭菌毒素受体(靶受体)(被再靶向)。具有对于非梭菌毒素靶细胞的靶向性活性的经修饰的梭菌毒素可结合存在于非梭菌毒素靶细胞上的受体，转移进入細胞质，然后对非梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物发挥其蛋白水解作用。在本质上，通过选择适当的靶向性结构域将包含酶促结构域的梭菌毒素轻链细胞内递送至任何期望的細胞。本说明书公开了ー类再靶向称为靶向囊泡胞吐调节蛋白(TargetedVesicularExocytosisModulatingProtein)(TVEMP)的非梭菌毒素受体的经修饰的梭菌毒素、包含TVEMP的組合物和用于治疗患有癌症的个体的方法。TVEMP是重组产生的蛋白质，其包含靶向性结构域以及梭菌毒素的转位结构域和酶促结构域。选择靶向的结合存在于目的靶癌细胞上的受体的能力。梭菌毒素转位结构域和酶促结构域用于将酶促结构域递送入靶细胞的5細胞质，在所述细胞质中其切割其同源SNARE底物。SNARE蛋白切割中断胞吐作用，其中細胞内囊泡中包含的物质通过囊泡膜与外細胞膜的融合从细胞排出的細胞分泌和排泄的过程。该中断阻止細胞的许多重要过程，包括但不限于跨膜蛋白(包括細胞表面受体和信号转导蛋白)的插入；细胞外基质蛋白至細胞外隙的运输；蛋白质(包括生长因子、血管生成因子、神经递质、激素和參与细胞通讯的任何其它分子)的分泌；和物质(包括废物、代谢产物和其它不想要的或有害分子)的排除。这样，胞吐中断严重地影响了細胞代谢，并且最终影响细胞存活力。因此减少或抑制細胞的胞吐的治疗性分子削弱了細胞存活的能力。基于该假定，本文中公开的TVEMP经设计靶向癌細胞，其中酶促结构域的随后转移通过SNARE蛋白切割中断胞吐，从而削弱癌細胞存活的能力。因此，本发明的方面提供了包含TVEMP的組合物，所述TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域。用于此类組合物的开发的TVEMP描述于例如Steward,L.E._人，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，第11/776，075号美国专利申请(2007年7月11日)；Dolly,J.0.等人，ActivatableClostridialToxins，第11/8,475号美国专利申请(2007年7月27日)；Foster,K.Α.等人，FusionProteins，第WO2006/059093号国际专利公布(2006年6月8日)；和Foster，K.Α.等人，Non-CytotoxicProteinConjugates，第WO2006/059105号国际专利公布(2008年6月8日)(将所述每ー个专利通过引用并入本文)。包含TVEMP的組合物可以是药物组合物。除TVEMP以外，此类药物組合物还可包括药用载体、药用组分或两者。本发明的其它方面提供了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含TVEMP的組合物的步骤，所述TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域，其中組合物的施用减轻与癌症相关的症状。预期可使用本文中公开的任何TVEMP，包括在例如Meward，同上Q007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。公开的方法提供了用于治疗癌症的安全、价廉、基于门诊患者的治疗。本发明的其它方面提供了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含TVEMP的組合物，所述TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域以及外源蛋白酶切割位点，其中組合物的施用减轻与癌症相关的症状。设想可使用本文中公开的任何TVEMP，包括在例如Meward，同上(2007)；Dolly,同上(2007)；Foster,同上，WO2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。本发明的其它方面提供了TVEMP在制造用于治疗有此需要的哺乳动物的癌症的药物中的用途，其中TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域并且其中给哺乳动物施用治疗有效量的药物减轻与癌症相关的症状。设想可使用本文中公开的任何TVEMP，包括例如例如Meward，同上(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。本发明的其它方面提供了TVEMP在治疗有此需要的哺乳动物的癌症中的应用，所述应用包括给哺乳动物施用治疗有效量的TVEMP的步骤，其中TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域并且其中TVEMP的施用减轻与癌症相关的症状。设想可使用本文中公开的任何TVEMP，包括例如Meward等人，(2007)；Dolly，同上Q007)；Foster等人，WO2006/059093(2006)；和Foster等人，WO2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。附图简述图1显示中枢和周围神经无的神经递质释放和梭菌毒素中毒的当前范例的示意图。图IA显示中枢和周围神经元的神经递质释放机制的示意图。释放过程可描述为包括两个步骤1)囊泡停靠(vesicledocking)，其中包含神经递质分子的囊泡的囊泡结合SNARE蛋白与位于质膜上的膜结合SNARE蛋白结合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜融合并且神经神经递质分子被外排。图IB显示中枢和周围神经元的破伤风和肉毒毒素的中毒机制的示意图。该中毒过程可被描述为包括4个步骤1)受体结合，其中梭菌毒素结合梭菌属受体系统并且起始中毒过程；2)复合物内化，其中在毒素结合后，包含毒素/受体系统复合物的囊泡被胞吞入細胞；；3)轻链转位(translocation)，其中多个事件被认为发生，包括例如囊泡的内PH的改变，包含梭菌毒素重链的HN结构域的通道孔的形成，梭菌毒素轻链与重链的分离以及活性轻链的释放和4)酶促靶修饰，其中梭菌毒素的激活轻链蛋白水解切割其靶SNARE底物，例如，SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白，从而阻止囊泡停靠和神经递质释放。图2显示天然存在的梭菌毒素的结构域组织。轻链形式描绘了包括酶促结构域、转位结构域和靶向性结构域的氨基至羧基线性组织。位于转位结构域与酶促结构域之间的双链环区域被描绘为双SS挂件(bracket)。该区域包含内源双链环蛋白酶切割位点，该切割位点当被天然存在的蛋白酶例如，内源梭菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然存在的蛋白酶蛋白水解切割时，将毒素的单链形式转变成双链形式。在单链形式上方，描绘了梭菌毒素结合结构域的HCC区域。该区域包括三叶草结构域，所述结构域在氨基至羧基的线性组织中包含α-折叠、β4/β5发夹转角、β-折叠、β8/β9发夹转角和Y-折叠。图3显示具有位于氨基末端的靶向性结构域的TVEMP。图3Α描绘了包括靶向性结构域、转位结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和酶促结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割时，将毒素的单链形式转变成双链形式。图3Β描绘了包括靶向性结构域、酶促结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和转位结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割时，毒素的单链形式被转变成双链形式。图4显示具有位于其它两个结构域之间的靶向性结构域的TVEMP。图4Α描绘了具有包括酶促结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、靶向性结构域和转位结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割吋，将毒素的单链形式转变成双链形式。图4Β描绘了具有包括转位结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、靶向性结构域和酶促结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。图4C描绘了具有包括酶促结构域、靶向性结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和转位结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切7割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。图4D描绘了具有包括转位结构域、靶向性结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和酶促结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。图5显示具有位于羧基末端的靶向性结构域的TVEMP。图5A描绘了具有包含酶促结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、转位结构域和靶向性结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。在用P蛋白酶蛋白水解切割后，毒素的单链形式被转变成双链形式。图5B描绘了具有包括转位结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、酶促结构域和靶向性结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。在用P蛋白酶进行蛋白水解切割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。详述癌症是指哺乳动物身体中細胞的不受控制的生长，这样其本质上为影响身体用于控制细胞生长的调控机制的疾病。为了正常细胞转化成癌細胞，必须改变调节細胞生长和分化的基因。遗传改变可在从完整染色体的获得或丢失至影响单个DNA核苷酸的突变的许多水平上发生。癌細胞基因型的巨大目录是一起指示恶性生长的細胞生理学的6个必要改变的表现1)生长信号的自足性ツ)对生长抑制性(抗生长)信号的不敏感性；幻程序化細胞死亡(細胞凋亡)的逃脱；4)无限的复制潜能タ)持续的血管生成；以及6)组织侵袭和转移。Hanahan和Weinberg，TheHallmarksofCancer,Cell100(1):57_7(K2000)。癌細胞显示生长信号的自足性的ー个方式是癌基因的表达。癌基因可以是以不适当的高水平表达的正常基因，或具有新的性质的改变的基因。在任一种情况下，这些基因的表达都通过多种方式促进由癌細胞显示的細胞生长的恶性表型。许多細胞可在細胞之间产生分泌性因子如激素，其促进有丝分裂，其作用取决于接受组织或細胞的信号转导。因此，当刺激受体細胞上的激素受体吋，信号从细胞的表面传导至細胞核以在細胞核水平上产生基因转录调控的某些改变。某些癌基因本身为信号转导系统的部分，或本身为细胞和组织的信号受体，从而控制对此类激素的敏感性。癌基因通常产生促分裂原，或在蛋白质合成中参与DNA的转录，这产生了负责产生所述产物以及細胞使用和与其相互作用的生化药剂的蛋白质和酶。通常为癌基因的静止对应物的原癌基因的突变可改变它们的表达和功能，从而增加所述产物蛋白质的量或活性。当这发生吋，原癌基因变成癌基因，并且该转变扰乱了細胞的細胞周期调控的正常平衡，从而使得不受控制的生长成为可能。癌症的概率不能通过从基因组除去原癌基因(即使这是可能的)而降低，因为它们对于生物体的生长、修复和动态平衡是至关重要的。只有当它们突变时，生长的信号才变得过度。因此，抑制癌細胞的細胞生长信号的治疗策略具有提供治疗癌症的强有力工具，所述癌症因癌基因表达而显示生长信号的自足性。此外，许多癌細胞表达生长因子受体和激活此类受体的配体(自分泌回路)。在正常组织中，一种类型的細胞表达生长因子受体并且另ー种类型产生配体(旁分泌回路)以试图維持动态平衡。癌細胞通过表达配体和受体获得生长的自足性。癌細胞显示对生长抑制性(抗生长)信号的不敏感性的ー种方式是对肿瘤抑制基因的表达的抑制。肿瘤抑制基因是抑制癌細胞的細胞分裂、存活或其它性质的基因。肿瘤抑制基因通常因促进癌症的遗传改变而失能。通常，许多基因的改变是将正常细胞转化成癌細胞所必需的。一般而言，肿瘤抑制基因是被细胞应激或DNA损伤激活的转录因子。通常DNA损伤将引起自由飘移的遗传物质以及其它征兆的存在，并且可触发导致肿瘤抑制基因激活的酶和途径。此类基因的功能是阻止細胞周期的进展以进行DNA修复，从而防止突变传递至子代細胞。因此，抑制癌細胞中的細胞分裂信号的治疗策略具有提供强有力的治疗癌症的工具的潜能，所述癌症因肿瘤抑制基因表达的抑制而显示对生长抑制性信号的不敏感。癌細胞逃避程序化細胞死亡(細胞凋亡)的ー种方式是对细胞存活信号(抗细胞凋亡信号)的持续暴露。诱导细胞存活或細胞死亡的信号由质膜中的传感器(即死亡受体)和由細胞内传感器提供。細胞内传感器监控細胞的健康和响应检测异常如DNA损伤、癌基因作用、存活因子不足或缺氧，它们激活死亡途径。因此，当它们具有DNA损伤、激活的癌基因或缺氧(在肿瘤的中心)，癌細胞应当遭受细胞凋亡。几种类型的癌細胞依赖通过自分泌回路递送的存活信号来抵抗由存在于这些細胞中的DNA损伤触发的細胞凋亡信号。这些自分泌回路由癌細胞通过表达生长因子配体和它们的同源受体来建立。因此，抑制由癌细胞产生的細胞存活信号的治疗策略具有提供强有力的治疗癌症的工具的潜力，所述癌症过度激活抗細胞凋亡信号。事实上，文献中存在激素和/或生长因子的撤除可产生癌細胞的細胞凋亡(因为存活与細胞凋亡信号之间的平衡被恢复)的证据。癌細胞的另ー个获得的能力是肿瘤細胞的无限复制潜能。癌細胞通过维持端粒的完整性和逃避因侵蚀端粒的连续倍增而引起的危机状态克服了増殖的限制。癌細胞过表达端粒酶，该端粒酶维持端粒的大小并且允许无限复制潜能。而另ー个重要步骤是将膜递送至质膜以完成有丝分裂过程的能力。当細胞在肿瘤内增殖时，它们也面临其它挑战，如有限的氧和营养物的供给，这可诱导細胞凋亡。因此为了能够维持生长和増殖，肿瘤需要促进现有血管的生长以及新血管的生长(在成熟组织中受到高度调控的过程)。癌細胞分泌促血管生成因子以激活内皮细胞中的受体。此外，隔离在細胞外基质中的促血管生成因子可通过由肿瘤細胞分泌的蛋白酶进行的基质降解获得释放。血管生成的抑制是经验证的治疗性靶，因为几种批准的药物靶向该途径(作为癌症和其它促血管生成疾病的治疗)。最后，肿瘤细胞获得侵袭邻近组织和转移至远距离位置的能力。为了实现该能力，肿瘤細胞首先可以能够通过改变粘着蛋白和整联蛋白的表达来改变它们的粘着能力。更重要地，为了能够迁移，癌細胞必须能够降解它们周围的細胞外基质。癌細胞以分泌性因子或膜锚定的蛋白酶的形式过表达基质降解蛋白酶并且下调蛋白酶抑制剂的表达。由于不受控制的細胞生长是所有癌症的根本原因，因此可减少或阻止不受控制的細胞生长的化合物和方法将是癌症的有效治疗。本说明书公开了可减少或阻止由癌細胞显示的不受控制的細胞生长的化合物和方法。新型再靶向内肽酶部分地包括结合结构域和酶促结构域。结合结构域将再靶向内肽酶导向正在表达所述结合结构域的同源受体的特定癌细胞类型。酶促结构域的内肽酶活性性通过切割适当的靶SNARE蛋白抑制胞吐，从而中断胞吐以及受体和膜至质膜的递送。阻止癌細胞的胞吐在治疗上是有用的，因为中断可以例如1)阻止由癌細胞产生的促进有丝分裂的分泌性生长因子的释放；或幻阻止受体至癌细胞的质膜的递送，这可干扰癌細胞接受癌症促进信号例如接受生长刺激信号或細胞存活信号的能力，后者在通过使平衡向癌細胞的細胞凋亡倾斜来消除癌細胞中是有用的；3)阻止膜至质膜的递送，从而终止只可在净获得膜以产生子代細胞的情况下才发生的有丝分裂的9过程；4)通过抑制肿瘤細胞或細胞外基质的促血管生成因子的释放减少血管生成タ)通过抑制蛋白酶的释放和通过干扰粘附蛋白和整联蛋白的转换来抑制侵袭和转移。因此，虽然当前市售的癌症治疗剂一次只靶向ー个途径，从而只部分有效，并且允许癌細胞获得对该治疗的抗性，通过抑制胞吐、受体递送和膜递送进行的基于TEVMP的疗法利用単一药物靶向几个途径，从而递送更强的对肿瘤細胞的冲击，从而变得更加有效。此外，当正常細胞不增殖并且不太依赖于存活信号吋，它们不受该疗法影响。本发明的方面部分地提供了TVEMP。如本文中所使用的，“TVEMP”意指包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域的任何分子。用于实施本发明的方面的示例性TVEMP公开于例如Steward,同上，(2007)；Dolly,同上(2007)；Foster,同上，WO2006/059093(2006)；Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中。梭菌毒素各自被翻译为约150kDa的单链多肽，所述多肽随后被天然存在的蛋白酶在ニ硫化物环内通过蛋白水解切割(图1)。该切割在两个形成ニ硫桥的半胱氨酸残基之间产生的不连续双链环区域内发生。该翻译后加工产生双链分子，所述分子包含通过两条链之间的单个ニ硫键和非共价相互作用保持在一起的约50kDa的轻链(LC)和约IOOkDa的重链(HC)。用于将单链分子转变成双链的天然存在的蛋白酶目前还不清楚。在某些血清型中，例如，BoNT/A(天然存在的蛋白酶)由細菌血清型内源产生并且切割在毒素被释放进环境之前在細胞内发生。然而，在其它血清型中，例如，BoNT/E，细菌菌株似乎不产生能够将毒素的单链形式转变成双链形式的内源蛋白酶。在这些情况下，毒素以单链毒素形式从细胞释放，其随后被环境中发现的天然存在的蛋白酶转变成双链形式。每ー个成熟的双链分子包含3个功能不同的结构域1)位于LC中的酶促结构域，其包括含有特异性靶向神经递质释放器的核心组分的锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区域；2)HC的氨基端半部分(HN)内包含的转位结构域，其促进LC从细胞内小囊泡至靶细胞的细胞质中的释放；和3)在HC的羧基端半部分(H。)中发现的结合结构域，其决定毒素对位于靶细胞表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性。D.B.Lacy和R.C.Stevens,SequenceHomologyandStructuralAnalysisoftheClostridialNeurotoxins,J.Mol.Biol.291:109ト1104(1999)。He结构域包含大小大致相同，被α-螺旋分隔，称为Hcn和Hcc亚域(subdomain)的两个不同的结构特征。表1给出了示例性梭菌毒素中发现的每ー个结构域和亚域的近似边界区域。权利要求1.一种治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的組合物的步骤，所述组合物包括包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域以及梭菌毒素酶促结构域和外源蛋白酶切割位点的TVEMP，其中所述组合物的施用减轻与癌症相关的症状。2.权利要求1所述的方法，其中所述TVEMP包含如下的线性氨基至羧基单链多肽順序1)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域、靶向性结构域，2)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域，3)靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域、4)靶向性结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域，5)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素酶促结构域和靶向性结构域，或6)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域和梭菌毒素酶促结构域。3.权利要求1所述的方法，其中所述靶向性结构域为胰高血糖素样激素肽靶向性结构域、胰泌素肽靶向性结构域、垂体腺苷酸环化酶激活肽靶向性结构域、生长激素释放激素肽靶向性结构域、血管活性肠肽靶向性结构域、抑胃肽、降钙素肽或内脏肠道肽。4.权利要求3所述的方法，其中所述胰高血糖素样激素肽靶向性结构域为胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽_2、肠高血糖素肽、肠高血糖素相关肽(GRPP)、胰高血糖素或胃泌酸调节素(OXY)。5.权利要求4所述的方法，其中所述胰高血糖素样激素肽靶向性结构域包括SEQIDNO82的氨基酸21-50、氨基酸53-81、氨基酸53-89、氨基酸98-1或氨基酸146-178。6.权利要求4所述的方法，其中所述癌症为胰岛素瘤或结肠癌。7.权利要求3所述的方法，其中所述胰泌素肽靶向性结构域为胰泌素肽。8.权利要求7所述的方法，其中所述胰泌素肽靶向性结构域包括SEQIDN0:83的氨基酸观づ4。9.权利要求7所述的方法，其中所述癌症为胰腺癌、胰腺腺癌、宫颈癌、子宮癌、乳腺癌、子宮内膜腺癌、垂体腺瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、前列腺癌、卵巣癌或小細胞肺癌。10.权利要求3所述的方法，其中所述垂体腺苷酸环化酶激活肽靶向性结构域为垂体腺苷酸环化酶激活肽。11.权利要求10所述的方法，其中所述垂体腺苷酸环化酶激活肽靶向性结构域包括SEQIDNO84的氨基酸132-158。12.权利要求10所述的方法，其中所述癌症为神经母細胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、胰腺腺癌、胰岛素瘤、宫颈癌、子宮癌、乳腺癌、子宮内膜癌、子宮内膜腺癌、垂体腺瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、前列腺癌、卵巣癌或小細胞肺癌。13.权利要求3所述的方法，其中所述生长激素释放激素肽靶向性结构域为生长激素释放激素肽。14.权利要求13所述的方法，其中所述生长激素释放激素肽靶向性结构域包括SEQIDNO85的氨基酸32-58或氨基酸32-75。15.权利要求13所述的方法，其中所述癌症为胰腺癌、宫颈癌、子宮癌、乳腺癌、子宮内膜腺癌、垂体腺瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、前列腺癌、卵巣癌或小細胞肺癌。16.权利要求3所述的方法，其中所述血管活性肠肽靶向性结构域为血管活性肠肽-1肽或血管活性肠肽-2肽。17.权利要求16所述的方法，其中所述血管活性肠肽靶向性结构域包括SEQIDNO86的氨基酸81-107或氨基酸125-151或SEQIDNO87的氨基酸81-107或氨基酸124-150。18.权利要求16所述的方法，其中所述癌症为肠类癌、胃泌素瘤、胃癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神经母細胞瘤、星形細胞瘤、脑膜瘤、髓母細胞瘤、垂体腺瘤、胰腺癌、胰腺腺癌、外分泌胰腺肿瘤、胰岛素瘤、结直肠癌、结肠癌、肝細胞癌、食管癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮内膜腺癌、卵巣癌、白血病、淋巴瘤或平滑肌瘤。19.权利要求3所述的方法，其中所述抑胃肽靶向性结构域为抑胃肽。20.权利要求19所述的方法，其中所述所述抑胃肽靶向性结构域包括SEQIDN0:88的氨基酸52-78或氨基酸52-93。21.权利要求19所述的方法，其中所述癌症为胰岛素瘤。22.权利要求3所述的方法，其中所述降钙素肽靶向性结构域为降钙素肽、胰淀素肽、降钙素相关肽α、降钙素相关肽β和胰岛淀粉样肽。23.权利要求22所述的方法，其中所述降钙素肽靶向性结构域包括SEQIDNO:89的氨基酸85-117、SEQIDNO:90的氨基酸7_62、SEQIDNO:91的氨基酸83_U8、SEQIDNO:92的氨基酸80-122或SEQIDNO93的氨基酸；34_70。24.权利要求22所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、卵巣癌、子宮癌、甲状腺髓样癌、胰岛素瘤、肺小細胞癌、子宮内膜癌、骨癌、白血病或胶质母細胞瘤。25.权利要求3所述的方法，其中所述内脏肠道肽靶向性结构域为胃泌素肽、胃泌素释放肽或胆囊收缩素肽。26.权利要求25所述的方法，其中所述内脏肠道肽靶向性结构域包括SEQIDNO94的氨基酸76-92或氨基酸59-92、SEQIDNO:95的氨基酸41-50或氨基酸M-50或SEQIDNO96的氨基酸20-58、SEQIDNO96的氨基酸47-58或SEQIDNO96的氨基酸51-58。27.权利要求25所述的方法，其中所述癌症为胰腺癌、胰腺腺癌、胃癌、胃泌素瘤、胃肠胰神经内分泌肿瘤、胃食管腺癌、脑膜瘤、胶质母細胞瘤、神经母細胞瘤、子宮内膜癌、子宮内膜腺癌、乳腺癌、结肠癌、支气管类癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肾细胞癌、肿瘤相关巨噬细胞或前列腺癌。28.权利要求1所述的方法，其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/Cl转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。29.权利要求1所述的方法，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/Cl酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。30.权利要求1所述的方法，其中所述外源蛋白酶切割位点为植物木瓜蛋白酶切割位点、昆虫木瓜蛋白酶切割位点、甲壳动物木瓜蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、人鼻病毒3C蛋白酶切割位点、人肠道病毒3C蛋白酶切割位点、畑草蚀纹病毒蛋白酶切割位点、畑草叶脉斑点病毒切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、羟胺切割位点或胱天蛋白酶3切割位好、ο全文摘要本说明书公开了TVEMP、包含此类TVEMP的组合物和使用此类TVEMP组合物治疗哺乳动物的癌症的方法。文档编号C07K14/33GK102574899SQ201080045272公开日2012年7月11日申请日期2010年8月16日优先权日2009年8月14日发明者B·P·S·杰克伊,D·G·斯特萨克思,E·费尔南德斯-萨拉斯,J·弗朗西斯,K·R·奥基,L·E·斯图尔德,P·E·加里,S·甘沙尼,T·J·亨特,Y·莫利纳申请人:阿勒根公司