专利名称：溶酶体靶向肽及其应用的制作方法
溶酶体靶向肽及其应用相关申请的引用本专利申请要求于2008年5月7日提交的美国临时专利申请号61/051，336和 2009年1月12日提交的美国临时专利申请号61/144，106的权益，将其各自的内容以其整 体作为参考并入本文。
背景技术：
通常，在细胞溶质中合成了哺乳动物的溶酶体酶并且溶酶体酶穿过ER，在此它们 被N-连接的高甘露糖型碳水化合物糖基化。在高尔基体中，通过添加将溶酶体蛋白靶向溶 酶体的甘露糖-6-磷酸(M6P)修饰了这些蛋白上的高甘露糖碳水化合物。通过与两个M6P 受体中任一个的相互作用将M6P-修饰的蛋白输送到溶酶体中。最好的修饰形式是将两个 M6P添加到高甘露糖碳水化合物上。超过四十种溶酶体贮积病(LSD)是直接或间接地由缺少溶酶体中的一种或多种 溶酶体酶所造成的。正在积极进行LSD的酶替代疗法。疗法通常要求以M6P依赖的方式将 LSD蛋白吸收并运输到各种细胞类型的溶酶体中。一种可能的方法包括纯化LSD蛋白并对 其进行修饰以加入具有M6P的碳水化合物部分。由于与细胞表面上M6P受体的相互作用， 因此与未修饰的LSD蛋白相比，这种修饰材料可以更有效地被细胞吸收。本申请的发明人先前已开发了基于肽的靶向技术，该技术使得能够更有效地将 治疗性酶运输到溶酶体中。由于用肽标记替代M6P作为靶向溶酶体的部分，因此这种专 有技术称为不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向(Glycosylation Independent Lysosomal Targeting) (GILT)。在美国中请公开号 2003-0082176、2004-0006008、2003_0072761、 2005-0281805,2005-0244400 以及国际公开 WO 03/032913、WO 03/032727、W002/087510、 WO 03/102583.W0 2005/078077中说明了 GILT技术的详细内容，将其全部披露内容作为参 考并入本文。
发明内容
本发明提供了基于GILT技术的用于有效溶酶体靶向的进一步改善的组合物和方 法。尤其是，本发明提供了使用抗弗林蛋白酶(furin-resistant)的溶酶体靶向肽用于将 溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。本发明还提供了使用对胰岛素受体具有降低或减小 的结合亲和力的溶酶体靶向肽用于将溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。本发明包含以 下意外发现根据本发明的抗弗林蛋白酶的溶酶体靶向肽对胰岛素受体具有降低的结合亲 和力。在一些实施方式中，本发明提供了抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白。在一些实施 方式中，本发明提供了抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白，其具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO 1)至少70%相同的氨基酸序列以及消除了至少一个弗林蛋白酶切割(裂解)位点的突变。在一些实施方式中，本发明提供了 IGF-II突变蛋白，其包含与成熟人IGF-II(SEQID NO 1)相比至少70%相同的氨基酸序列以及与野生型人IGF-II相比降低或减小了对胰 岛素受体的结合亲和力的突变。在一些实施方式中，相对于天然存在的人IGF-II对IGF-I受体的亲和力，抗弗林 蛋白酶的IGF-II突变蛋白对IGF-I受体具有减小的结合亲和力。在一些实施方式中，本发明提供了靶向的治疗性融合蛋白，其包含溶酶体酶；和具 有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO 1)至少70%相同的氨基酸序列的IGF-II突变蛋白，其中 所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的 非阳离子依赖型(阳离子非依赖型，cation-independent)甘露糖_6_磷酸受体结合。在一些实施方式中，本发明提供了靶向的治疗性融合蛋白，其包含溶酶体酶；和 IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO=D至少70%相 同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II突 变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；其中所述IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露 糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。在一些实施方式中，本发明提供了靶向的治疗性融合蛋白，其包含溶酶体酶；和 IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO 1)至少70%相 同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II突 变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；其中所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的 切割并且以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结
I=I O在一些实施方式中，适合于本发明的IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO 1 的氨基酸30-40的区域内的突变。在一些实施方式中，适合于本发明的IGF-II突变蛋白包 含在对应于SEQ ID NO :1的氨基酸34-40的区域内的突变使得所述突变消除了至少一个弗 林蛋白酶切割位点。在一些实施方式中，适合的突变为氨基酸取代、缺失和/或插入。在一 些实施方式中，所述突变为在对应于SEQ ID NO 1的Arg37或Arg40的位置处的氨基酸取 代。在一些实施方式中，所述氨基酸取代为Lys或Ala取代。在一些实施方式中，适合的突变为对应于下列位置的氨基酸残基的缺失或替代， 所述位置选自由 SEQ ID NO 1 的 31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、 32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40、以及它们的组合组成的组。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO 1的位置2-7的氨基酸的缺失或替代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白 进一步包含对应于SEQ ID NO 1的位置1-7的氨基酸的缺失或替代。在一些实施方式中， 根据本发明的IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO=I的位置62-67的氨基酸的 缺失或替代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQID NO :1的Tyr27、Leu43或kr26的位置处的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据本发明的 IGF-II突变蛋白至少包含选自由Tyr27Leu、Leu43VaUer26Phe以及它们的组合组成的组 中的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白包含对应于SEQ ID NO 1的位置48-55的氨基酸。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白包含选 自由对应于SEQ ID NO 1的位置8、48、49、50、M和55的氨基酸组成的组中的至少三种氨 基酸。在一些实施方式中，本发明的IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID N0:1的位置M和55的位置处的氨基酸，每个所述氨基酸在pH 7.4下不带电或带负电。在一些实施方 式中，相对于天然存在的人IGF-II对IGF-I受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对IGF-I 受体具有减小的结合亲和力。在一些实施方式中，适合于本发明的溶酶体酶为人酸性α -葡萄糖苷酶(GAA)、或 其功能性变体。在一些实施方式中，适合于本发明的溶酶体酶包含人GAA的氨基酸70-952。在一些实施方式中，本发明的靶向的治疗性融合蛋白进一步包含在溶酶体酶与抗 弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白之间的间隔区。在一些实施方式中，所述间隔区包含氨基酸 序列 Gly-Ala-Pro0本发明还提供了编码如以上各个实施方式中所描述的IGF-II突变蛋白或靶向的 治疗性融合蛋白的核酸。本发明进一步提供了包含本发明的核酸的各种细胞。本发明提供了适合于治疗溶酶体贮积病的药物组合物，该药物组合物包含治疗有 效量的本发明的靶向的治疗性融合蛋白。本发明进一步提供了治疗溶酶体贮积病的方法， 该方法包括向需要治疗的受试者给予根据本发明的靶向的治疗性融合蛋白。在一些实施方 式中，溶酶体贮积病为蓬珀病(全身性糖原病，Pompe Disease)。在一些实施方式中，溶酶体 贮积病为法布里病(Fabry Disease)。在一些实施方式中，溶酶体贮积病为高歇病(Gaucher Disease)。在另一个方面，本发明提供了一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，该方法包 括以下步骤在细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞具有本发明的核酸，具 体地，如本文中各个实施方式所述的；和在允许靶向的治疗性融合蛋白表达的条件下进行 所述培养。在又一个方面，本发明提供了一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，该方法包 括以下步骤在细胞培养基中培养弗林蛋白酶缺陷型细胞(例如，弗林蛋白酶缺陷型哺乳 动物细胞)，其中弗林蛋白酶缺陷型细胞具有编码包含溶酶体酶和IGF-II突变蛋白的融合 蛋白的核酸，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO=D至少70%相同的 氨基酸序列，其中IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖 型甘露糖-6-磷酸受体结合；并且其中所述培养是在允许靶向的治疗性融合蛋白表达的条 件下进行的。在随后的详细说明中，本发明的其它特征、目的和优势将是显而易见的。然而，应 当理解，在说明本发明实施方式的同时，详细描述仅通过示例的方式给出，而不进行限制。 根据详细说明，本发明范围内的各种变化和改变对本领域的技术人员来说会是显而易见 的。
附图仅是出于说明的目的，而不是为了限制。图1示出了 ZC-701的N末端的图。方框中的两个氨基酸残基是切割事件的位点。 第一个是信号肽切割位点，第二个是弗林蛋白酶切割位点。图2示出了用肽N-糖苷酶F (N-糖酰胺酶F，肽_N_聚糖酶F，PNGaseF)处理后的 ZC-701的示例性SDS-PAGE分析。右侧的泳道已另外用弗林蛋白酶处理。图3左侧修饰了弗林蛋白酶切割位点的示例性ZC-701突变体的示意图。中间细胞培养3-7天后，用肽N-糖苷酶处理的突变体的示例性SDS-PAGE分析。右侧用弗林蛋 白酶处理的肽N-糖苷酶处理过的突变体的示例性SDS-PAGE分析。图4示出了示例性的竞争性IGF-II受体结合结果。图5示出了另外的示例性的竞争性IGF-II受体结合结果。图6示出了示例性胰岛素受体竞争测定结果。图7示出了示例性IGF-I受体竞争测定结果。图8示出了某种胰岛素受体结合测定的示例性结果。图9示出了某种胰岛素受体结合测定的示例性结果。图10示出了从瞬时转染中部分纯化的GILT-标记的GAA的示例性分析。用构件 (构建体，构建物，construct) 1479、1487或ZC-701转染HEK293细胞。收获后，用疏水作 用层析(HIC)部分纯化培养上清液。在进行电泳前，用肽N-糖苷酶处理所有样品。左侧部 分部分纯化蛋白的SDS-PAGE。将纯化的ZC-701B12显示为对照。右侧部分部分纯化蛋 白的免疫印迹分析。使用了所指明的第一抗体。底侧部分另外用外源弗林蛋白酶处理。构 件1487所编码的蛋白在序列上与构件1461 (R37A)所编码的相同。构件1479所编码的蛋 白与构件1459 (R37K)所编码的相同。图11示出了示例性抗弗林蛋白酶的GILT-标记的GAA吸收至大鼠L6成肌细胞中 的示例性吸收结果。蛋白1479、1487、ZC-701和纯化的ZC-701的分别为4. 5ηΜ、4. 4ηΜ, 5. OnM和2. 6ηΜ。构件1487所编码的蛋白在序列上与图3中构件1461所编码的(R37A)相 同。构件1479所编码的蛋白与图3中构件1459所编码的(R37K)相同。定义转佳如本文所使用的，术语“转佳”表示受试者状况的预防、减轻或缓和或者受试 者状况的改善。转佳包括，但不要求疾病病况的完全恢复或完全预防。在一些实施方式中， 转佳包括相关疾病组织的溶酶体内部所累积的材料的减少。抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白如本文所使用的，术语“抗弗林蛋白酶的 IGF-II突变蛋白”是指基于IGF-II的肽，该基于IGF-II的肽包含这样的改变的氨基酸序 列，该改变的氨基酸序列消除了至少一个天然弗林蛋白酶切割位点或改变了接近于或邻近 于天然弗林蛋白酶切割位点的序列的使得与野生型人IGF-II肽相比，防止、抑制、降低或 减慢了弗林蛋白酶的切割。如本文所使用的，抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白还称为对弗 林蛋白酶耐受的IGF-II突变蛋白。弗林蛋白酶切割位点如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶切割位点”(还称为“弗 林蛋白酶切割位点”或“弗林蛋白酶切割序列”)是指用作弗林蛋白酶或类弗林蛋白酶的酶 促蛋白酶切割的识别序列的肽或蛋白质的氨基酸序列。通常，弗林蛋白酶切割位点具有共 有序列Arg-X-X-Arg(SEQ IDNO :2)，X为任何氨基酸。所述切割位点位于所述序列中羧基末 端的精氨酸(Arg)残基之后。在一些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点可以具有共有序列 Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO :3)，X为任何氨基酸。所述切割位点位于所述序 列中羧基末端的精氨酸(Arg)残基之后。弗林蛋白酶如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶”是指可以识别并切割如本文所定 义的弗林蛋白酶切割位点的任何蛋白酶，包括弗林蛋白酶或类弗林蛋白酶。弗林蛋白酶还 称为成对碱性氨基酸切割酶(PACE)。弗林蛋白酶属于类枯草杆菌蛋白酶前蛋白转化酶家族。编码弗林蛋白酶的基因被称为FUR(FES上游区)。 弗林蛋白酶缺陷型细胞如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶缺陷型细胞”是指弗 林蛋白酶活性被抑制、降低或消除的任何细胞。弗林蛋白酶缺陷型细胞包括不产生弗林蛋 白酶或产生降低量的弗林蛋白酶或缺陷型弗林蛋白酶的哺乳动物和非哺乳动物细胞。
不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向如本文所使用的，术语“不依赖于糖基化作用 的溶酶体靶向”(还称作“GILT”)是指不依赖于甘露糖-6-磷酸的溶酶体靶向。人酸性α-葡萄糖苷酶如本文所使用的，术语“人酸性α-葡萄糖苷酶”(还称 为“GAA” )是指能够降低哺乳动物溶酶体中糖原水平或者能够挽救一种或多种蓬珀病症状 或使其转佳的人GAA的前体野生型或功能性变体。改善、提高或降低如本文所使用的，术语“改善”、“提高”或“降低”或语法上等价 的表达表示相对于基线测量(如，在开始本文所述的治疗前在相同个体中的测量)或相对 于未使用本文所述治疗的对照个体(或多个对照个体)中的测量的值。“对照个体”是被与 所治疗个体相同形式的溶酶体贮积病(例如，蓬珀病)困扰的个体，其与所治疗的个体年龄 大致相同(以确保治疗个体和对照个体中的疾病阶段是可比较的)。个体、受试者、患者如本文所使用的，术语“受试者”、“个体，，或“患者，，是指人或 非人哺乳动物受试者。所治疗的个体(还称为“患者”或“受试者”)是患有溶酶体贮积病 (例如，蓬珀病(即婴儿、少年或成年发病的蓬珀病))或具有发展溶酶体贮积病(例如，蓬 珀病)的可能的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年的人)。溶酶体贮积病如本文所使用的，“溶酶体贮积病”是指由缺乏在溶酶体中将大分 子分解成肽、氨基酸、单糖、核酸和脂肪酸所需要的至少一种酶(例如，酸性水解酶)所引起 的一组遗传疾病。因此，患有溶酶体贮积病的个体在溶酶体中具有积累的材料。表1中列 出了示例性的溶酶体贮积病。溶酶体酶如本文所使用的，术语“溶酶体酶”是指能够减少哺乳动物溶酶体中积 累的材料或者能够挽救一种或多种溶酶体贮积病症状或使其转佳的任何酶。适合于本发明 的溶酶体酶包括野生型或修饰的溶酶体酶并且能够使用重组和合成方法产生或者可以从 天然来源纯化。表1中列出了示例性的溶酶体酶。间隔区如本文所使用的，术语“间隔区”(还称为“接头”)是指融合蛋白中两 个蛋白部分之间的肽序列。间隔区通常设计为柔性的或设计为插入至两个蛋白部分之间 的如α-螺旋的结构中。间隔区可以相对较短，如序列Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO :4)或 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO 5)，或者能够更长，如，例如，长度为10-25个氨基酸。治疗有效量如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的 合理获益/风险比对所治疗的受试者起治疗效果的靶向的治疗性融合蛋白的量。治疗效果 可以是客观的(即，通过一些测试或标志物测量)或者可以是主观的(即，受试者给出效果 说明或感受效果)。具体地，“治疗有效量”是指对治疗、转佳或预防所需疾病或病况有效， 或表现出可检测的治疗或预防效果的治疗性融合蛋白或组合物的量，如通过转佳与所述疾 病有关的症状、预防或延缓所述疾病的发病和/或还减轻了所述疾病症状的严重程度或频 率。通常以可以包含多个单位剂量的剂量方案给予治疗有效量。对于任何特定的治疗性融 合白质，可以例如根据给药途径、与其它药剂的组合来改变治疗有效量(和/或有效剂量方案内的适当单位剂量)。同样，对于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可 以取决于各种因素，包括正在治疗的病症和该病症的严重程度；所使用的具体药剂的活 性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食；所使用的具体融 合蛋白的给药时间、给药途径和/或分泌或代谢速率；治疗持续时间；以及医学领域中众所 周知的类似因素。治疗如本文所使用的，术语“治疗(treatment) ” (还为“治疗(treat) ”或“正治 疗(treating)”)是指部分或完全减轻、转佳、缓解、抑制、延缓特定疾病、病症和/或病况的 一种或多种症状或特征的发生、减轻它们的严重程度和/或降低它们的发病率的治疗性融 合蛋白的任何给药。这种治疗可以是对未表现出相关疾病、病症和/或病况迹象的受试者， 和/或仅表现出所述疾病、病症和/或病况的早期迹象的受试者。可替换地或另外，这种治 疗可以是对表现出相关疾病、病症和/或病况的一种或多种已确立迹象的受试者。例如，治 疗可以是指改善了心脏状态(例如，提高舒张末期和/或收缩末期容量，或者减轻、转佳或 预防通常在蓬珀病中所发现的进行性心肌病)或肺功能(例如，相对于基线量提高了哭喊 肺活量、和/或使哭喊期间的氧减饱和正常)；改善了神经发育和/或运动技能(例如，提高 AIMS得分)；降低患有所述疾病个体的组织中的糖原水平；或这些效果的任何组合。在一些 实施方式中，治疗包括糖原清除的改善，特别是在与蓬珀病有关的心肌病的减轻或预防中。如本申请中所使用的，术语“约，，和“大约”等同使用。在本申请中使用的有或没 有用约/大约修饰的任何数字均表示覆盖了相关领域的普通技术人员所理解的任何正常 波动。
具体实施例方式本发明提供了基于不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向(GILT)技术的用于靶向溶 酶体酶的改善的方法和组合物。尤其是，本发明提供了抗弗林蛋白酶和/或对胰岛素受体 具有降低或减少的结合亲和力的IGF-II突变蛋白并且提供了包含本发明的IGF-II突变蛋 白的靶向的治疗性融合蛋白。本发明还提供了制备和使用其的方法。将在随后的部分中详细地描述本发明的各个方面。以下部分的使用不意味着对本 发明的限制。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则使 用“或”表示“和/或”。溶酶体酶适合于本发明的溶酶体酶包括能够降低哺乳动物溶酶体中所积累的材料或者能 够挽救或转佳一种或多种溶酶体贮积病症状的任何酶。适合的溶酶体酶包括野生型或修饰 的溶酶体酶并且能够使用重组或合成方法产生或者能够从天然来源纯化。表1中列出了示 例性的溶酶体酶。表1.溶酶体贮积病和相关的酶缺陷
权利要求
1.一种靶向的治疗性融合蛋白，包含溶酶体酶；以及IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO :1)至少70% 相同的氨基酸序列，其中，所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依赖于甘露 糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。
2.一种靶向的治疗性融合蛋白，包含溶酶体酶；以及IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO :1)至少70% 相同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II 突变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；其中，所述IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型 甘露糖-6-磷酸受体结合。
3.—种靶向的治疗性融合蛋白，包含溶酶体酶；以及IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO :1)至少70% 相同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II 突变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；其中，所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方 式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变 蛋白包含在对应于SEQ ID NO 1的氨基酸30-40的区域内的突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变 蛋白包含在对应于SEQ ID NO :1的氨基酸34-40的区域内的突变，使得所述突变消除了至 少一个弗林蛋白酶切割位点。
6.根据权利要求4或5所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述突变为氨基酸取代、 缺失和/或插入。
7.根据权利要求6所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述突变为对应于SEQID NO :1的Arg37或Arg40的位置处的氨基酸取代。
8.根据权利要求7所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述氨基酸取代为Lys或Ala 取代。
9.根据权利要求6所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述突变为对应于下列位置 的氨基酸残基的缺失或替代，所述位置选自由SEQID NO :1的31-40、32-40、33-40、34-40、 30-39、31-39、32-39、34-37、32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40、以及它们的 组合组成的组。
10.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO 1的位置2-7的氨基酸的缺失或替代。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO 1的位置1-7的氨基酸的缺失或替代。
12.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO 1的位置62-67的氨基酸的缺失或替代。
13.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO 1的Tyr27、Leu43或kr26的位置处的氨基酸取代。
14.根据权利要求13所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白至少 包含选自由Tyr27Leu、Leu43Val、Serf6Wie、以及它们的组合组成的组中的氨基酸取代。
15.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 变蛋白包含对应于SEQ ID NO 1的位置48-55的氨基酸。
16.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 变蛋白包含选自由对应于SEQ ID NO 1的位置8、48、49、50、M和55的氨基酸组成的组中 的至少三种氨基酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突 变蛋白包含在对应于SEQ ID NO 1的位置M和55的位置处的氨基酸，每个所述氨基酸在 PH 7. 4下不带电或带负电。
18.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，相对于天然存在 的人IGF-II对IGF-I受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对IGF-I受体具有减小的结合 亲和力。
19.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述溶酶体酶为 人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、或其功能性变体。
20.根据权利要求18所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述溶酶体酶包含人GAA的 氨基酸70-952。
21.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述靶向的治疗 性融合蛋白进一步包含在所述溶酶体酶与所述IGF-II突变蛋白之间的间隔区。
22.根据权利要求21所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述间隔区包含氨基酸序 列 Gly-Ala-Pro。
23.—种编码根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白的核酸。
24.一种包含根据权利要求23所述的核酸的细胞。
25.一种适合于治疗溶酶体贮积病的药物组合物，包含根据前述权利要求中任一项所 述的靶向的治疗性融合蛋白。
26.一种治疗溶酶体贮积病的方法，包括向需要治疗的受试者给予根据前述权利要求 中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病为蓬珀病。
28.根据权利要求沈所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病为法布里病。
29.根据权利要求沈所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病为高歇病。
30.一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，包括以下步骤在细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞具有根据权利要求23所述的核酸；以及在允许所述靶向的治疗性融合蛋白表达的条件下进行所述培养。
31.一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，包括以下步骤在细胞培养基中培养弗林蛋白酶缺陷型细胞，其中所述弗林蛋白酶缺陷型细胞具有编码包含溶酶体酶和IGF-II突变蛋白的融合蛋白的 核酸，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II (SEQ ID NO 1)至少70%相同的氨基酸 序列，其中，所述IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖 型甘露糖-6-磷酸受体结合；以及其中，所述培养是在允许所述靶向的治疗性融合蛋白表达的条件下进行的。
全文摘要
本发明提供了基于GILT技术的用于有效溶酶体靶向的进一步改善的组合物和方法。尤其是，本发明提供了使用抗弗林蛋白酶的溶酶体靶向肽用于将溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。本发明还提供了使用对胰岛素受体具有降低或减小的结合亲和力的溶酶体靶向肽用于将溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。
文档编号C07K19/00GK102066422SQ200980123156
公开日2011年5月18日 申请日期2009年5月7日 优先权日2008年5月7日
发明者乔纳森·H·勒博茨, 约翰·玛嘎 申请人:齐斯特治疗公司