专利名称：经修饰的因子ix多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的因子IX多肽，诸如具有一个或多个引入的糖基化位点的因 子IX多肽。经修饰的因子IX多肽可以展现出升高的体外或体内稳定性诸如较长的血浆半 衰期。本发明还涉及生成经修饰的因子IX多肽的方法，和使用经修饰的因子IX多肽例如 来治疗罹患血友病B的患者的方法。
背景技术：
血友病B影响着34，500名男性中的一名，并且是由编码因子IX(FIX)的基因的 多种遗传缺陷引起的，所述遗传缺陷导致血液中低的或检测不到的FIX蛋白(Kurachi等， Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6 991-997,1992 ；Lillicrap, Haemophilia 4:350—357， 1998)。不足水平的FIX导致有缺陷的凝固和源自不受控制的出血的症状。通过静脉内输注 血浆衍生的或重组的FIX蛋白以停止已经启动的出血或阻止出血发生(预防)来有效地治 疗血友病 B (Dargaud 等，Expert Opin. Biol. Ther. 7 651-663 ；Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524，2005)。有效的预防要求维持约1 %正常水平的最低谷水平的 FIX (Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 :1517_1524，2005)。由于约 18 至 24 小时 的天然FIX(血浆衍生的或重组的)半衰期，FIX水平在推注后3至4天内下降至正常水 平的小于1%，这使平均每三天重复注射成为必要以实现有效的预防(Giangrande，Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524, 2005)。此类频繁的静脉内注射对于患者而言是成问题 的，而且是实现有效预防的一项障碍(Petrini，Haemophilia 13 Suppl 2 16-22，2007)，尤 其在儿童中。具有较长半衰期的FIX蛋白会实现较小频率的施用，并且如此是有显著医学 益处的。发明概述本申请提供了 FIX多肽(也称为经修饰的FIX多肽、FIX突变蛋白、或FIX变体)， 其包含已经通过弓I入一个或多个糖基化位点来修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，所 述一个或多个糖基化位点可以是N-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，所述多肽具有 凝固活性。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以包含至少一处取代，诸如但不限于 R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以包含R338A和V86A取代两者。本申请还提供了包含已经通过引入一个或多个糖基化位点进行过修饰的氨基酸 序列的FIX多肽。所述FIX多肽可以进一步包含附接于一个或多个引入的糖基化位点的碳 水化合物链。在一些实施方案中，所述碳水化合物链可以是N-连接的碳水化合物链。在一 些实施方案中，所述碳水化合物链可以具有哺乳动物碳水化合物链结构。在一些实施方案 中，所述碳水化合物链可以具有人碳水化合物链结构。在一些实施方案中，相对于缺乏引 入的糖基化位点的多肽，在一个或多个引入的糖基化位点附着碳水化合物链可以将多肽的
7血清半衰期增加例如至少30%。在一些实施方案中，相对于缺乏引入的糖基化位点的分泌 性多肽的量，在一个或多个引入的糖基化位点附着碳水化合物链未将分泌性多肽的量降低 例如超过50%。在一些实施方案中，相对于缺乏引入的糖基化位点处的碳水化合物链的多 肽与FVIII、FXI、或FX的相互作用，在一个或多个引入的糖基化位点附着碳水化合物链未 将多肽与因子VIII (FVIII)、因子XI (FIX)、或因子X(FX)中至少一种的相互作用抑制超过 50%。在一些实施方案中，经修饰的多肽可以具有例如每mg多肽至少100个单位的比活。可以经由一个或多个氨基酸取代来引入一个或多个糖基化位点。取代可以在表面 暴露的残基处和/或限于不引入已知与血友病B有关的突变的取代。例示性的实施方案包 括包含一个或多个取代的FIX多肽，所述取代诸如但不限于(a)G4T ；E33N ；E36T ；E36N ；R37N ；F75N ；F77T ；E83T ；D85N ；V86A ；K91T ；A103T ； V107T ；K122N ；K122T ；S138N ；A146N ；T148N ；F150T ；P151N ；T159N ；A161T ；A161N ；T169N ； Q170N ；T172N ；D177N ；D177E ；F178T ；K201N ；K201T ；K214T ；V223N ；G226N ；Y226T ；K228N ； K228T ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ；E294N ；R338A ；R338N ；K341N ；F353N ；H354V ；H354I ； E355T ；V370N ；T371V ；T371I ；E372T ；E374N ；M391N ；K392V ；G393T ；E410N ；K413N ；L414I ；(b) YlN 禾口 S3T ；S3N 禾口 K5T ；G4N 禾口 L6T ；K5N 和 E7T ；L6N 禾口 E8T ；E7N 禾口 F9T ；F9N 禾口 QllT ；VlON禾口 G12T ；QllN禾口 N13T ；G12N禾口 L14T ；N13(N13T)禾口 E15T ；L14N禾口 R16T ；E15N禾口 E17T ；M19N 禾口 E21T ；E20N 禾口 K22T ；S24N 禾口 E26T ；F25N 禾口 E27T ；E26N 禾口 A28T ；E27N 禾口 R29T ； A28N 和 E30T ；R29N 和 V31T ；E30N 和 F32T ；V31N 和 E33T ；F32N 和 N34T ；T35N 和 R37T ；T38N 禾口 E40T ；T39N 禾口 F41T ；E40N 禾口 W42T ；F41N 禾口 K43T ；W42N 禾口 Q44T ；K43N 禾口 Y45T ； Q44N 禾口 V46T ；Y45N 和 D47T ；V46N 和 G48T ；E52N 和 N54T ；S53N 和 P55T ；G59N 和 S61T ；K63N 和 D65T ； I66N 和 S68T ；S68N 和 E70T ；G76N 和 E78T ；E78N 和 K80T ；E83N 和 D85T ；L84N 和 V86T ； I90N 和 N92T ；K100N 和 S102T ；S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；K106N 和 V108T ； R116N 和 A118T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 禾口 S123T ；A127N 和 P129T ；V135N 和 V137T ；S136N 和 S138T ；V137N 和 Q139T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；S141N 和 L143T ；E147N 和 V149T ； T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ；D154N 和 V156T ；Y155N 和 N157T ；V156N 和 S158T ；S158N 和 E160T ；T159N 和 A161T ；E160N 和 E162T ； E162N 和 1164T ；T163N 和 L165T ； 1164N 和 D166T ；L165N 和 N167T ；D166N 和 1168T ； 1168N 和 Q170T ；T169N 和 S171T ；S171N 和 Q173T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ； G184N 和 D186T ；E185N 和 A187T ；D186N 和 K188T ；A187N 和 P189T ；P189N 和 Q191T ；G200N 和 V202T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ；E224N 和 G226T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ； V227N 和 I229T ；H236N 和 I238T ； I238N 和 E240T ；E240N 和 E242T ；T241N 和 H243T ；H243N 和 E245T ；K247N 和 N249T ；V250N 和 R252T ；I251N 和 I253T ； I253N 和 P255T ；A261N 和 I263T ； A262N 和 N264T ；D276N 和 P278T ；V280N 和 N282T ；F302N 和 S304T ；S304N 和 Y306T ；R312N 和 F314T ；V313N 禾Π Η315Τ ；F314N 禾Π Κ316Τ ；Η315Ν 禾Π G317T ；Κ316Ν 禾Π R318T ；G317N 禾Π S319T ； S319N 和 L321T ；Α320Ν 和 V322T ；R327N 和 Ρ329Τ ；Ρ329Ν 和 V331T ；D332N 和 Α334Τ ；L337N 和 S339T ；S339N 和 Κ341Τ ；Τ340Ν 和 F342T ；Τ343Ν 和 Υ345Τ ；G352N 和 Η354Τ ；F353N 和 Ε355Τ ； Η354Ν 和 G356T ；Ε355Ν 和 G357T ；G356N 和 R358T ；G357N 和 D359T ；Ε372Ν 和 Ε374Τ ；W385N 禾口 Ε387Τ ；G386N 和 Ε388Τ ；Α390Ν 和 Κ392Τ ；(c)D85N、K122T、和 I251T ；D85N、K122T、和 E242N ；E125N、P126A、和 A127T ；P126N、V128T、和 P129A ；T148N、F150T、和 P151A ；F150N、P151A、和 D152T ；P151N、V153T、和 A161N ； P151N、V153T、和 T172N ；V153N、Y155T、和 E294N ；T172N、G226N、和 K228T ；F353N、H354V、 和 E355T ；F353N、H354I、和 E355T ；V370N、T371V、和 E372T ；V370N、T371I、和 E372T ；M391N、 K392V、和 G393T ；D85N、P151N、V153T、和 K228N ；D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、 P151N、V153T、和 K228N ；K122T、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 I251T ； T148N、F150T、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、T172N、和 R338A ；P151N、V153T、D177E、和 F178T ；P151N、V153T、G226N、和 K228T ；T172N、G226N、K228T、和 R338A ；D85N、K122T、P151N、 V153T、和 E242N ；D85N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；K122T、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；S138N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；T148N、F150T、G226N、K228T、和 R338A ；P151N、 V153T、T172N、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、D177E、F178T、和 R338A ；P151N、V153T、G226N、 K228T、和 R338A ；和 P151N、V153T、T172N、G226N、K228T、和 R338A ；和其任意组合。可以将一个或多个糖基化位点引入FIX的催化域或激活肽中。例示性的实施方案 包括包含一个或多个取代的FIX多肽，所述取代诸如但不限于R37N ；D85N ；K122T ；S138N ； A146N；A161N ；Q170N ；T172N ；D177N ；F 178T；K201N ；K228N ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ； E294N ；E374N ；和E410N。其它实施方案可以包括包含一个或多个取代的下列FIX多肽，所 述取代诸如:G59N 和 S61T ；K63N 和 D65T ；G76N 和 E78T ；S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ； D104N 和 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ； D154N 和 V156T ；V156N 和 S158T ；S158N 和 E160T ；E160N 和 E162T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ； I164N 和 D166T ；D166N 和 I168T ； I168N 和 Q170T ；S171N 和 Q173T ；T172N 和 S174T ； Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ；E224N 和 G226T ；T225N 禾口 V227T ；G226N 和 K228T ；T241N 和 H243T ； I251N 和 I253T ； I253N 和 P255T ；A262N 和 N264T ； V280N 和 N282T ；T343N 和 Y345T ；和 E372N 和 E374T ；F150N、P151A、和 D152T。在一些实施 方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如例如R338A和V86A。在一些 实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取代两者。可以通过将0-连接的糖基化位点转变为N-连接的糖基化位点来引入一个或多个 糖基化位点。例示性的实施方案包括取代，诸如但不限于T169N ；T172N ；T148N和F150T ；和 T159N和A161T。在一些实施方案中，所述取代可以是T172N ；T148N和F150T ；和T159N和 A161T0在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如但不限 于R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取 代两者。可以通过在氨基酸残基160-164之间插入1_12个氨基酸残基来引入一个或多 个糖基化位点。可以在氨基酸残基160-161之间、氨基酸残基161-162之间、氨基酸残基 162-163之间、或氨基酸残基163-164之间引入糖基化位点。在一些实施方案中，可以在氨 基酸残基160-161之间、氨基酸残基161-162之间、氨基酸残基162-163之间、或氨基酸残 基163-164之间引入SEQ ID NO :2。在其它实施方案中，可以通过将1_12个氨基酸残基添 加至FIX多肽的C端来引入糖基化位点。在一些实施方案中，可以将SEQ ID N0:4、5、6、或 7引入FIX多肽的C端。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代D177E和 F178T。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代P151N和V153T。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代T172N。在一些实施方案中，所述多肽可 以进一步包含氨基酸取代P151N、V153T、和T172N。在一些实施方案中，所述多肽可以进一 步包含氨基酸取代T148N和F150T。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取 代G226N和K2^T。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代， 诸如R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A 取代两者。在例示性的实施方案中，提供了包含一个或多个取代的经修饰的FIX多肽，所述 取代诸如:D85N ；K122T ；S138N ；T172N ；K201N ；K228N ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ；E294N ； G59N 禾口 S61T ；G76N 禾口 E78T ；S102N 禾口 D104T ；A103N 禾口 N105T ；D104N 禾口 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ； V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；S158N 和 E160T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；K201N 和 D203T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ； I253N 和 P255T ；A262N 和 N264T ；V280N 和 N282T ；E372N 和 E374T ；F150N、P151A、和 D152T ； A161 和 E162 之间的 SEQ ID NO :2 插入；和 G2^N、K228T、和 A161 和 E162 之间的 SEQ ID N0:2插入。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如例 如R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取 代两者。本申请还提供了包含R338A取代和V86A取代的FIX多肽。在一些实施方案中，所 述多肽可以具有每mg多肽至少700个单位的比活。本申请还提供了药物制剂，其包含经修饰的FIX多肽和药学可接受载体。本申请还提供了用于治疗血友病B的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有 效量的本文中所描述的药物制剂。本申请还提供了编码经修饰的多肽的DNA序列，以及用所述DNA序列转染的真核 宿主细胞。本申请还提供了用于生成经修饰的FIX多肽的方法，包括⑴通过引入一个或多 个糖基化位点来修饰所述多肽的氨基酸序列；(ii)以容许在所述一个或多个糖基化位点 糖基化的方式表达所述多肽；并(iii)纯化所述多肽。附图简述
图1描绘了来自8种物种的激活肽内的FIX序列的多序列比对。图2描绘了对来自用FIX的糖基化位点突变蛋白转染的HKBll细胞的培养基的 Western印迹分析。使用抗FIX-HRP抗体来检测FIX蛋白。图3描绘了 HKBll细胞中FIX糖基化位点突变蛋白的表达和活性的表。通过ELISA 来测定表达，并通过aPTT测定法来测定活性。比活计算为每mg FIX蛋白的国际单位。将 数值转变为相同转染实验中运行的FIX-R338A的百分比。(无)迁移率没有变化，(+)迁 移率降低，其中+数目指明了程度，(_)迁移率升高。图4描绘了 HKBll细胞中FIX糖基化位点突变蛋白的表达水平、凝固活性、和比 活。数值表示为FIX-R338A突变蛋白的百分比。图3中描绘了构建体。图5描绘了对来自用FIX的G2^N、K228T糖基化位点突变蛋白转染的HKBll细胞 的培养基的Western印迹分析。使用抗FIX-HRP抗体来检测FIX蛋白。
发明详述本申请提供了包含一个或多个0-或N-连接的糖基化位点的FIX多肽。可以使用 治疗性蛋白质的糖基化升高来实现1)降低的免疫原性；2)较小频率的蛋白质施用；3)升 高的蛋白质稳定性，诸如增加的血清半衰期；和4)不利副作用诸如炎症的降低。本申请提供了具有一个或多个别的糖基化位点的人FIX变体。经修饰的FIX多 肽还可以具有延长的血浆半衰期，其在血友病B患者中会提供例如针对出血的保护时间延 长。经修饰的FIX多肽会以比目前可用的野生型FIX蛋白疗法可能的注射更少的FXI注射 使血友病B患者能够实现针对出血的保护。本申请提供了许多例示性FIX变体，其中在催化域和激活肽两者中创建功能性糖 基化位点。此外，本申请表明这些变体可以在哺乳动物细胞中表达，具有指明糖基化升高 的表观分子量增加，而且在凝固测定法中维持50% -100%的活性。最后，这些修饰位点可 以与增强FIX比活的改变(包括但不限于R338A取代和/或V86A取代)组合(Chang等， J. Biol. Chem. 273 12089-12094，1998 和 Chang 等，J. Biol. Chem. 277 :25393_25399，2002)。 与R338A和V86A取代之一或两者的组合补偿源自糖基化位点添加的任何活性降低，使得经 修饰的多肽的比活可以类似于或高于野生型FIX的。一旦表达，野生型FIX是一条约55，000道尔顿的单链糖蛋白。可以认为它在结构 上具有四种域富含Gla或Y-羧基谷氨酸的域；EGF样区；激活肽；和含有活性位点的催 化域(Thomson, Blood 67:565-572,1986)。FIX在肝中以461个氨基酸的单链多肽合成， 并且在通过高尔基和内质网过程中经历广泛的翻译后修饰(Nemerson等，CRC Crit. Rev. Biochem. 9 :45_85，1980 ；Stenflo 等，Annu. Rev. Biochem. 46 157-172，1977)。除去信号 序列和前肽两者，导致415个氨基酸(SEQ ID NO 1)的成熟蛋白(Choo等，Nature 299 178-180,1982 ；Kurachi 等，Proc Natl Acad Sci USA 79 :6461_6464，1982)。有效的 γ-羧 基化对于FIX的凝固活性是至关重要的，并且在人中，在N端Gla域内生成12个Gla残 基，虽然对Gla36和Gla40的Y-羧基化是功能不需要的(DiScipio等，Biochemistryl8 899-904，1979 ；Gillis等，Protein Sci. 6 :185_196，1997)。另外，FIX含有两个N-连接的糖 基化位点(N157.N167)、六个0-连接的糖基化位点(S53、S61、T159、T169、T172、T179)、和各 用于Ser磷酸化(S158)、酪氨酸硫酸化(Y155)和β -羟基化(D64)的一个位点(McMullen 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 115 :8_14,1983)。激活的因子VII (FVII)通过与由于对血管壁的损伤而暴露的组织因子(TF)形成 复合物来启动正常的止血过程。随后，复合物激活FIX;活性形式称为FIXa。通过由因子 XIa(FXIa)或组织因子(TF)/因子VIIa复合物在两个位点处进行的蛋白水解切割来除去 FIX的激活肽以生成催化活性分子，即因子IXa(FIXa)。FIXa和因子VlIIa(FVIIIa)将FX 转化成因子Xa(FXa)，其继而将凝血酶原转化成凝血酶。然后，凝血酶将血纤蛋白原转化成 血纤蛋白，导致血纤蛋白凝块的形成。因为野生型FIX具有许多翻译后修饰(已经提示了其中一些在体内药动学概况 (profile)中起作用)，可以在不影响这些其它修饰的位置处引入异位糖基化位点。一旦生 成，FIX应当保持酶促活性，并与FVIII、FXI、和FX相互作用以有效治疗血友病B。引入的 糖基化位点不应干扰这些相互作用和功能。本申请部分提供了对FIX的修饰，其可能在最 小的功能干扰的情况中导致糖基化位点数目增加，并且如此具有提高FIX的生物利用度的
11效用。最后，这些修饰位点可以与增强FIX比活的改变(包括但不限于R338A突变和/或 V86A突变)联合。增强FIX比活的改变可以补偿凝固活性的潜在损失，而且还通过在较低 的蛋白质水平赋予功效来潜在地延长经修饰分子的功效。经修饰的FIX多肽本申请提供了包含一个或多个引入的糖基化位点的FIX多肽，即经修饰的FIX多 肽。如本文中所使用的，“因子IX”指人血浆FIX糖蛋白，其是固有凝固途径的成员，而且对 于血液凝固是至关重要的。要理解的是，此定义包括天然以及重组形式的人血浆FIX糖蛋 白。除非另有规定或指明，如本文中所使用的，FIX指其在凝固中的正常作用中的任何功能 性人FIX蛋白分子，包括任何其片段、类似物、变体、和衍生物。术语“片段”、“衍生物”、“类 似物”、“突变蛋白质”、和“变体”在提及本申请的多肽时指保留基本上相同生物学功能或活 性的多肽片段、衍生物、类似物、突变蛋白质、和变体。FIX多肽的非限制性例子包括FIX、FIfe、和具有FIX活性的截短型式的FIX。任何 维持至少某种程度的FIX活性的上述FIX多肽的生物学活性片段、删除变体、取代变体、或 添加变体也可以充当FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多肽可以包含与SEQ ID N0:1至 少约70、80、90、或95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽是生物 学活性的。可以通过例如本文中所描述的凝固测定法来测定生物学活性。经修饰的FIX多肽还可以含有保守的氨基酸取代。保守取代在本领域中公认为用 一种氨基酸替换另一种具有相似特性的氨基酸，并且包括例如丙氨酸变化为丝氨酸；精氨 酸变化为赖氨酸；天冬酰胺变化为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变化为谷氨酸；半胱氨酸 变化为丝氨酸；谷氨酰胺变化为天冬酰胺；谷氨酸变化为天冬氨酸；甘氨酸变化为脯氨酸； 组氨酸变化为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变化为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变化为缬氨 酸或异亮氨酸；赖氨酸变化为精氨酸；甲硫氨酸变化为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变化 为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变化为苏氨酸；苏氨酸变化为丝氨酸；色氨酸变化为 酪氨酸；酪氨酸变化为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变化为异亮氨酸或亮氨酸。在一些实 施方案中，在引入一个或多个糖基化位点外，SEQID NO 1的FIX多肽还包含1_30、1_20、或 1-10处保守的氨基酸取代。特定氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸、和三字母缩写如下A，丙氨酸 (Ala) ；C，半胱氨酸(Cys) ；D，天冬氨酸(Asp) ；E，谷氨酸(Glu) ；F，苯丙氨酸(Phe) ；G，甘氨 酸(Gly) ；H，组氨酸(His) ；I，异亮氨酸(Ile) ；K，赖氨酸(Lys) ；L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨 酸(Met) ；N，天冬酰胺(Asn) ；P，脯氨酸(Pro) ；Q，谷氨酰胺(Gln) ；R，精氨酸(Arg) ；S，丝氨 酸(Ser) ；T，苏氨酸(Thr) ；V，缬氨酸(Val) ；W，色氨酸(Trp) ；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸 (Nle)。多肽的糖基化通常是N-连接的或0-连接的。N-连接的指将碳水化合物模块附接 于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列Asn-X-Ser和Asn-X-Thr (其中X是除脯氨酸外的任何氨 基酸)是用于将碳水化合物模块酶促附接于Asn侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽 序列之任一的存在创建潜在的N-连接的糖基化位点。可用于本发明的例示性N-连接的糖 基化位点也可以如下表示=X1-Asn-X2-X3-X4 ；其中&任选地是Asp、Val、Glu、Gly、或Ile ；X2 是除Pro外的任何氨基酸；X3是Ser或Thr ；而&任选地是Val、Glu、Gly、Gin、或lie。在 一些实施方案中，&任选地是Asp ；)(2是^^成是！!^ ;而)(4是Gin。在一些实施方案中，X1是Asp ；X2是Ile ；X3是Thr ；而&是Gin。通过改变氨基酸序列使得引入一种或多种上 文所描述的三肽序列来实现N-连接的糖基化位点向FIX多肽的添加。0-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附接于羟基氨基 酸，最通常至丝氨酸或苏氨酸，虽然附接于5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也是有可能的。可以 通过改变氨基酸序列使得引入一个或多个Ser或Thr残基来实现0-连接的糖基化位点向 FIX多肽的添加。可以例如通过删除一个或多个氨基酸残基、用另一种氨基酸替换一个或多个内源 FIX氨基酸残基、或者添加一个或多个氨基酸残基来引入糖基化位点。氨基酸残基的添加可 以在两个现有的氨基酸残基之间或者在天然FIX分子的N-或C-端末端。所使用的氨基酸取代的术语如下。第一个字母代表在人FIX的位置上天然存在的 氨基酸残基。后面的数字代表成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO 1)中的位置。第二个字 母代表取代(替换/取代)天然氨基酸的不同氨基酸。举例而言，R338A表示SEQ ID NO 1的第338位Arg残基已经用Ala残基替换。关于包含人FIX多肽的额外的5’氨基酸序列 (46 个氨基酸)的 SEQ ID NO 26, SEQID NO 1 的第 338 位对应于 SEQ ID NO 26 的第 384 位。本文中所使用的FIX残基数目系统指成熟人FIX蛋白的，其中残基1代表除去信 号序列和前肽两者后的成熟FIX多肽的第一个氨基酸。天然的或野生型FIX是全长成熟人 FIX分子，如SEQ ID NO 1中所显示的。在一些实施方案中，在FIX中在不会消除蛋白质功能或其在细胞中表达的位置处 工程化改造糖基化位点。为了设计包含一个或多个引入的糖基化位点的FIX多肽，可以应 用数项标准。在一些实施方案中，引入的糖基化位点是表面暴露的。可以基于溶剂可接近表 面积来测定表面暴露，如Autin等(J. Thromb. Haemost. 3 =2044-56,2005)中所测定的。在 一些实施方案中，引入的糖基化位点没有引入已知与血友病B有关的突变。已知的突变可 以参见环球网于 kcl. ac. uk/ip/petergreen/haemBdatabase. html 禾口表 1。表 1
残基号突变残基号突变残基号突变
1权利要求
1.一种因子IX多肽，其包含已经通过引入一个或多个氨基酸取代或插入来修饰的氨 基酸序列。
2.依照权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列已经通过引入一个或多个糖基化位点 而修饰。
3.依照权利要求2的多肽，其中所述一个或多个糖基化位点选自N-连接的糖基化位 点和0-连接的糖基化位点。
4.依照权利要求2和3的多肽，其进一步包含附接于所述一个或多个引入的糖基化位 点的碳水化合物链。
5.依照权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自G4T； E33N ；E36T ；E36N ；R37N ；F75N ；F77T ；E83T ；D85N ；V86A ；K91T ；A103T ；V107T ；K122N ；K122T ； S138N ；A146N ；T148N ；F150T ；P151N ；T159N ；A161T ；A161N ；T169N ；Q170N ；T172N ；D177N ； D177E ；F178T ；K201N ；K201T ；K214T ；V223N ；G226N ；Y226T ；K228N ；K228T ；E239N ；E242N ； I251T ；A262T ；E294N ；R338A ；R338N ；K341N ；F353N ；H354V ；H354I ；E355T ；V370N ；T371V ； T371I ；E372T ；E374N ；M391N ；K392V ；G393T ；E410N ；K413N ；L414I ；YlN 和 S3T ；S3N 和 K5T ； G4N 和 L6T ；K5N 和 E7T ；L6N 和 E8T ；E7N 和 F9T ；F9N 和 QllT ；VlON 和 G12T ；QllN 和 N13T ； G12N 和 L14T ；N13 (N13T)和 E15T ；L14N 和 R16T ；E15N 和 E17T ；M19N 和 E21T ；E20N 和 K22T ； S24N 和 E26T ；F25N 和 E27T ；E26N和 A28T ；E27N 和 R29T ；A28N 和 E30T ；R29N 和 V31T ；E30N 和 F32T ；V31N 和 E33T ；F32N 和 N34T ；T35N 和 R37T ；T38N 和 E40T ；T39N 和 F41T ；E40N 和 W42T ； F41N 和 K43T ；W42N 和 Q44T ；K43N 和 Y45T ；Q44N 和 V46T ；Y45N 和 D47T ；V46N 和 G48T ；E52N 和 N54T ；S53N 和 P55T ；G59N 和 S61T ；K63N 和 D65T ； I66N 和 S68T ；S68N 和 E70T ；G76N 和 E78T ； E78N 和 K80T ；E83N 和 D85T ；L84N 和 V86T ；I90N 和 N92T ；K100N 和 S102T ；S102N 和 D104T ； A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；K106N 和 V108T ；R116N 和 A118T ；E119N 和 Q121T ；Q121N和 S123T ；A127N 和 P129T ；V135N 和 V137T ；S136N 和 S138T ；V137N 和 Q139T ；Q139N 和 S141T ； T140N 和 K142T ； S141N 和 L143T ；E147N 和 V149T ；T148N 和 F150T ； V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ；D154N 和 V156T ；Y155N 和 N157T ；V156N 和 S158T ； S158N 和 E160T ；T159N 和 A161T ；E160N 和 E162T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ； I164N 和 D166T ；L165N 和 N167T ；D166N 和 I168T ； I168N 和 Q170T ；T169N 和 S171T ；S171N 和 Q173T ； T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ；G184N 和 D186T ；E185N 和 A187T ；D186N 和 K188T ；A187N 和 P189T ；P189N 和 Q191T ；G200N 和 V202T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ； E224N 和 G226T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ；V227N 和 I229T ；H236N 和 I238T ； I238N 和 E240T ；E240N 和 E242T ；T241N 和 H243T ；H243N 和 E245T ；K247N 和 N249T ；V250N 和 R252T ； I251N 和 I253T ；I253N 和 P255T ；A261N 和 I263T ；A262N 和 N264T ；D276N 和 P278T ；V280N 和 N282T ；F302N 和 S304T ； S304N 和 Y306T ；R312N 和 F314T ；V313N 和 H315T ；F314N 和 K316T ； H315N 和 G317T ；K316N 和 R318T ；G317N 和 S319T ；S319N 和 L321T ；A320N 和 V322T ；R327N 和 P329T ；P329N 和 V331T ；D332N 和 A334T ；L337N 和 S339T ；S339N 和 K341T ；T340N 和 F342T ； T343N 和 Y345T ；G352N 和 H354T ；F353N 和 E355T ；H354N 和 G356T ；E355N 和 G357T ；G356N 和 R358T ；G357N 和 D359T ；E372N 和 E374T ；W385N 和 E387T ；G386N 和 E388T ；A390N 和 K392T ； D85N、K122T、和 I251T ；D85N、K122T、和 E242N ；E125N、P126A、和 A127T ；P126N、V128T、和 P129A ；T148N、F150T、和 P151A ；F150N、P151A、和 D152T ；P151N、V153T、和 A161N ；P151N、V153T、和 T172N ；V153N、Y155T、和 E294N ；T172N、G226N、和 K228T ；F353N、H354V、和 E355T ； F353N、H354I、和 E355T ；V370N、T371V、和 E372T ；V370N、T371I、和 E372T ；M391N、K392V、和 G393T ；D85N、P151N、V153T、和 K228N ；D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 K228N ；K122T、P151N、V153T、和E242N ；K122T、P151N、V153T、和I251T ；T148N、F150T、G226N、 和 K228T ；P151N、V153T、T172N、和 R338A ；P151N、V153T、D177E、和 F178T ；P151N、V153T、 G226N、和 K228T ；T172N、G226N、K228T、和 R338A ；D85N、K122T、P151N、V153T、和 E242N ； D85N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；K122T、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；S138N、P151N、 V153T、G226N、和 K228T ；T148N、F150T、G226N、K228T、和 R338A ；P151N、V153T、T172N、G226N、 和 K228T ；P151N、V153T、D177E、F178T、和 R338A ；P151N、V153T、G226N、K228T、和 R338A ；和 P151N、V153T、T172N、G226N, K228T、和 R338A ；和其任意组合。
6.依照权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自R37N; D85N ；K122T ；S138N ；A146N ；A161N ；Q170N ；T172N ；D177N ；F178T ；K201N ；K228N ；E239N ； E242N ；I251T ；A262T ；E294N ；E374N ；E410N ；G59N 禾口 S61T ；K63N 禾口 D65T ；G76N 禾口 E78T ； S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ； D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ；D154N 和 V156T ；V156N 和 S158T ；S158N 和 E160T ；E160N 和 E162T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ； I164N 和 D166T ；D166N 和 I168T ； I168N 和 Q170T ； S171N 和 Q173T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ；E224N 和 G226T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ；T241N 和 H243T ； I251N 和 I253T ； I253N 和 P255T ；A262N 和 N264T ；V280N 和 N282T ；T343N 和 Y345T ；E372N 和 E374T ；D85N、 K122T、和 E242N ；D85N、K122T、和 I251T ；F150N、P151A、和 D152T ；T172N、G226N、和 K228T ； D85N、P151N、V153T、和 K228N ；D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 K228N ； K122T、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 I251T ；P151 (P151N, P151T,或 P151A)、V153T、G226N、和 K228T ；D85N、K122T、P151N、V153T、和 E242N ；D85N、P151N、V153T、 G226N、和 K228T ；S138N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、T172N、G226N、和 K228T。
7.依照权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自D85N; K122T ；S138N ；T172N ；K201N ；K228N ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ；E294N ；G59N 禾口 S61T ； G76N 和 E78T ；S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ； P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；S158N 和 E160T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；K201N 和 D203T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ； I253N 和 P255T ； A262N 和 N264T ；V280N 和 N282T ；E372N 和 E374T ；和 D85N、K122T、和 E242N ；D85N、K122T、 和 I251T ；F150N、P151A、和 D152T ；T172N、G226N、和 K228T ；D85N、P151N、V153T、和 K228N ； D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 K228N ；K122T、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 I251T ；P151 ((P151N, P151T，或 P151A))、V153T、G226N、和 K228T ；D85N、K122T、P151N、V153T、和 E242N ；D85N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；S138N、 P151N、V153T、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、T172N、G226N、和 K228T。
8.一种因子IX多肽，其包含氨基酸序列ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvd⑶qcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegkncelx85x86tcnikngrceqfcknsax104nkvvcsctegyrlaenx121kscepavpfpcgrvsvx138qtsk Ltraex148Vx150X151X152X153Dyvnsx159Ez1X161Z2Ez3Tz4Ildnix169Qsx172Qx174Fnx177X178TrvvggedakpgQF PffQVVLNGKVDAFCGGS I VNEKffIVTAAHCVETX226VX228I T WAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclx338stKFTIYNNMFCAGX353X354X355GGRDSCQ ⑶ SGGPHX37qX371X372 VEGTsFLTGnsWGEECAXs31X392X393KYGIYTKV SRYVNWIKEKTX413X414T (SEQ ID NO :3)； 其中I选自D和Ε; 其中X86选自Α、Ε、P、S、和V ； 其中)(1Q4选自D、NjPT; 其中X121选自N、QjPT; 其中A38选自N、S、*T; 其中X148和)(15。选自(i)X148是T而父15(1是？；(ii) 48是N而X15(1是T;和(iii) 48是N而X150是S ； 其中X151选自A、P、和T ；其中X 151 和)(153选自 (i)X151是P而父说是乂； (Ii)X15I ^ NM X153 ^ T (iii)X151 是 N而1说是3; 其中z1. z2, z3、和&独立地选自(i)0至12个氨基酸残基和(ii)SEQID NO 2 ； 其中选自D、N、*T; 其中X159和)(161选自 (土))^9是丁而X161 是A;(ii) 是N而X161是T;和(iii))(棚是N而 X161 是S; 其中X169选自T和N; 其中X172选自T和N; 其中X174选自S和T ； 其中X177和)(178选自 (iU177是D而父”8是？； (土土))(177是￡而父哪是！1 ；和 (土^))(177是已或D而父”8是3 ； 其中)(226和选自(iU2a;是6而)(鄉是K; (ii) a;是N而 是T ；和(iii) a;是N而 是S ； 其中X338选自R禾口 A;其中X 353、 X354、禾口 1 自 (i)X 353 ^ F，X354 ^ H，X355 是Ε; ( )Χ 353 ^ N，X354 ^ V，乂355 是Τ;(i ii) X3ra 是 N，X354 是 LX355 是 Τ;和(iv)X353 是 N，X354 是 H、V、或 I，X355 是 S ； 其中X37t^X371、和X372选自(i)X370 ^ V, X371是τ、χ372是Ε;GiU370 是 N，X371 是 V，X372 是 T ； (iiDX37 是 N，X371 ^ I, X372 ^ T (iv) X370 是 N，X371 是 Τ、V、或 I，X372 是 S ； 其中^31J392、和A93选自(i)X391 ^ M, X392 ^ K, X393 ^ G ；(ii)X391^ N, X392 ^ K, X393 ^ T ；(iii)XjN，X3i32是 V，X393 是 T ；和(iv)X391 是 N，X392 是 V 或 K，X393 是 S ； 其中)(413和)(414选自(iU413是K而)(414是L;(ii) 13是N而 14是L;和(iii) 13是N而 14是I；和其中与具有SEQ ID NO :1的FIX多肽相比，所述FIX多肽包含至少一个引入的糖基化 位点。
9.依照权利要求6或7的多肽，其进一步包含选自R338A和V86A的氨基酸取代。
10.依照权利要求1-9中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列已经如下修饰过，即在人 因子IX的氨基酸残基160-164间引入1-10个氨基酸残基，导致引入一个或多个糖基化位点ο
11.依照权利要求10的多肽，其中所述氨基酸残基插入氨基酸残基160-161之间、氨基 酸残基161-162之间、氨基酸残基162-163之间、或氨基酸残基163-164之间。
12.依照权利要求11的多肽，其中包含氨基酸序列SEQID NO :2的多肽在氨基酸残基 160-161之间、氨基酸残基161-162之间、氨基酸残基162-163之间、或氨基酸残基163-164 之间引入。
13.依照权利要求11或12的多肽，其进一步包含选自如下的氨基酸取代V86A； R338A ；V86A 和 R338A ；T148N 和 F150T ；D177E 和 F178T ；P151N 和 V153T ；P151N、V153T、和 T172N ；G226N 和 K228T。
14.依照权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列已经如下修饰过，即在因 子IX多肽的C端引入1-10个氨基酸残基，导致引入一个或多个糖基化位点。
15.依照权利要求14的多肽，其中在因子IX多肽的C端引入包含选自SEQIDNO :4、 SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6、和SEQ ID NO 7的氨基酸序列的多肽。
16.一种因子IX多肽，其包含R338A取代和V86A取代。
17.依照权利要求1至15中任一项的多肽，其中相对于缺乏所述引入的糖基化位点的 多肽，在一个或多个所述引入的糖基化位点附接碳水化合物链将所述多肽的血清半衰期增 加至少30%。
18.依照权利要求1至17中任一项的多肽，其中所述多肽具有每mg多肽至少100个单 位的比活。
19.一种药物制剂，其包含权利要求1-18中任一项的因子IX多肽和药学可接受载体。
20.一种治疗血友病B的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的权利要求 19的药物制剂。
21.编码权利要求1-18中任一项的多肽的DNA序列。
22.—种真核宿主细胞，其以容许所述宿主细胞表达因子IX多肽的方式用依照权利要 求20的DNA序列转染。
23.一种用于生成因子IX多肽的方法，包括(i)通过引入一个或多个糖基化位点来修 饰所述多肽的氨基酸序列；(ii)以容许在所述一个或多个糖基化位点糖基化的方式表达 所述多肽；并(iii)纯化所述多肽。
全文摘要
本发明涉及经修饰的因子IX多肽，诸如具有一个或多个引入的糖基化位点的因子IX多肽。经修饰的因子IX多肽可以展现出升高的体外或体内稳定性诸如较长的血浆半衰期。本发明还涉及生成经修饰的因子IX多肽的方法，和使用经修饰的因子IX多肽例如来治疗罹患血友病B的患者的方法。
文档编号C07K14/745GK102083856SQ200980122784
公开日2011年6月1日 申请日期2009年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者乌尔里克·豪普茨, 尤维·格里赞, 科尼利亚·柯克纳, 约翰·E·墨菲, 艾伦·布鲁克斯, 蒋晓乔, 钱德拉·帕特尔, 马里安·塞托 申请人:拜耳先灵医药股份公司, 拜耳医药保健有限公司