因子ix的定点修饰的制作方法

专利名称：因子ix的定点修饰的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的因子IX(factor IX)多肽，诸如具有一个或多个引入的半胱 氨酸位点的因子IX多肽。可以将经修饰的因子IX多肽与生物相容性聚合物偶联。本发明 还涉及生成经修饰的因子IX多肽的方法，和使用经修饰的因子IX多肽例如来治疗罹患血 友病(hemophilia)B的患者的方法。
背景技术：
血友病B影响着34，500名男性中的一名，并且是由编码凝固因子IX(FIX)的基 因的多种遗传缺陷引起的，所述遗传缺陷导致血液中低的或检测不到的FIX蛋白(Kurachi 等，Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6 :991-997, 1992 ；Lillicrap, Haemophilia 4 350-357,1998)。不足水平的FIX导致有缺陷的凝固和源自不受控制的出血的症状。通过 静脉内输注血浆衍生的或重组的FIX蛋白以停止已经启动的出血或阻止出血发生(预防) ^tW ^n ^7^. B (Dargaud φ, Expert Opin. Biol. Ther. 7 :651-663 ；Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 :1517-1524，2005)。有效的预防要求维持约 正常水平 的最低谷水平的 FIX (Giangrande，Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524，2005)。由 于约18至M小时的天然FIX(血浆衍生的或重组的)半衰期，FIX水平在推注后3至4 天内下降至正常水平的小于1%，这使平均每三天重复注射成为必要以实现有效的预防 (Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524，2005)。此类频繁的静脉内注射 对于患者而言是成问题的，而且是实现有效预防的一项障碍(Petrini，Haemophilia 13 Suppl 2:16-22,2007)，尤其在儿童中。具有较长半衰期的FIX蛋白会实现较小频率的施 用，并且如此是有显著医学益处的。发明概述本申请的一方面提供了 FIX多肽(也指经修饰的FIX多肽或FIX变体)，其包含 已经通过引入一个或多个聚合物偶联位点(例如游离的半胱氨酸残基)来修饰过的氨基酸 序列。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含至少一处选自R338A和V86A的突变和至 少一选自下组的半胱氨酸取代T148C、V153C、T163C、L165C、N167C、T169C、T172C、F175C、 K201C、K247C、K413C、L414C、和T415C。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含至少一 处选自R338A和V86A的突变和至少一处选自下组的半胱氨酸取代T148C、V153C、T163C、 L165C、T172C、F175C、K247C、L414C、和1"415(。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含 T169C、K201C、K247C、或 L414C 取代或与 R338A、V86A、或 R338A 和 V86A 两者组合的 T169C、 K201C、K247C、或L414C取代。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基 160-164之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含 在氨基酸残基160-164之间引入的至少2、3、4、或5个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案 中，经修饰的FIX多肽包含残基A161与E162之间插入的单个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含与R338A、V86A、或R338A和V86A两者组合的在残基A161与 E162之间插入的单个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸 残基160-161之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多 肽包含在氨基酸残基161-162之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中， 经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基162-163之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一 些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基163-164之间引入的至少一个半胱氨 酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含本文中所描述的突变的组合。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽具有凝固活性。在一些实施方案中，所述多 肽包含至少一处选自R338A和V86A的突变。在一些实施方案中，所述多肽包含R338A和 V86A突变两者。本申请的另一方面提供了经修饰的多肽，其具有经由取代的或引入的半胱氨酸残 基而与生物相容性聚合物偶联的至少一个取代的或引入的半胱氨酸。在一些实施方案中， 所述生物相容性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，所述聚乙二醇具有范围为3，000 道尔顿至150，000道尔顿的名义平均分子量。在一些实施方案中，所述聚乙二醇具有范围 为5，000道尔顿至85，000道尔顿的名义(nominal)平均分子量。在一些实施方案中，具有至少一个取代的或引入的半胱氨酸的经修饰的多肽是功 能上确定的(defined)。在一些实施方案中，提供了经修饰的FIX多肽，其中相对于缺乏所 述至少一个引入的或取代的半胱氨酸的分泌性多肽的量，所述至少一个引入的或取代的半 胱氨酸没有将分泌性多肽的量降低超过70%。在一些实施方案中，提供了经修饰的FIX多肽，其中相对于缺乏所述至少一个引 入的或取代的半胱氨酸的多肽与FVIII、FXI、或FX的相互作用，所述至少一个引入的或取 代的半胱氨酸没有将多肽与因子VIII (FVIII)、因子XI (FIX)、或因子X(FX)中至少一种的 相互作用降低超过50%。在一些实施方案中，提供了经修饰的FIX多肽，其中相对于未偶联 的多肽与FVIII、FXI、或FX的相互作用，与聚合物的偶联(经由至少一个引入的或取代的 半胱氨酸)没有将多肽与FVIII、FXI、或FX中至少一种的相互作用降低超过50%。在一些 实施方案中，提供了经修饰的FIX多肽，其中相对于未偶联的多肽，与聚合物的偶联将多肽 的血清半衰期增加至少30%。在一些实施方案中，提供了经修饰的FIX多肽，其中所述多肽 具有每mg多肽至少100个单位的比活。本申请还提供了包含R338A和V86A突变的FIX多肽。在一些实施方案中，所述多 肽具有每mg多肽至少700个单位的比活。本申请还提供了药物制剂(pr印aration)，其包含经修饰的FIX多肽和药学可接 受载体，其中所述制剂是无热原的(pyrogen free)。本申请还提供了用于治疗血友病B的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有 效量的本文中所描述的药物制剂。本申请还提供了编码经修饰的多肽的DNA序列，以及用所述DNA序列转染的真核 宿主细胞。附图简述

图1描绘了对上清液中的FIX的Western印迹分析，所述上清液来自用野生型FIX 或FIX突变蛋白转染的HKBll细胞。使用抗因子IX-HRP抗体来检测FIX蛋白。
图2描绘了来自用野生型FIX或多种FIX突变蛋白转染的HKBll细胞的上清液中 的FIX表达水平、活性、和比活。野生型表达和活性的百分比基于每次个别实验中的野生型 FIX的表达和活性计算，并代表3或4次独立转染的均值。误差棒代表标准偏差。野生型蛋 白质的表达水平在各次实验间自0. 5变化至2 μ g/mL,而野生型FIX的比活随实验在80和 150IU/mg之间变化。图3以表格形式描绘了自图2描绘的结果。*Cat =催化域，AP =激活肽。图4描绘了来自8种物种的激活肽内的FIX序列的多序列比对。使用 VectorNTI (Informax)中的多比对算法来比对来自8种物种的成熟FIX的氨基酸序列。仅 显示了激活肽的区域。短划线标示插入缺口以使比对最大化。图5描绘了对通过方法I (Q-kpharose )纯化的L414C-PEG的凝胶分析。将流过 液(FT)和洗脱液(EL)收集，并通过Centricon 来浓缩至更小的体积。凝胶电泳后，用考 马斯蓝(图5a)接着用碘(图5b)对同一凝胶染色，接着进行银染色(图5c)，每次间有脱 色步骤。发明详述一种用于延长循环蛋白质的半衰期的方法是与聚合物的化学偶联，其保护蛋白质 免于降解和 / 或清除(Molineux,Cancer Treat. Rev. 28 Suppl A :13-16,2002 ；Duncan 等， Clin. Pharmacokinet. 27 :290-306,1994 ；Werle 等，Amino Acids30 :351-367, 2006)。最常 使用的聚合物是聚乙二醇(PEG)，而且已经成功使用与PEG的偶联来延长许多蛋白质(包括 干扰素、GCSFJP FVIII)的半衰期。PEG化(即将聚乙二醇(PEG)共价附着至分子)是一种已经证明延长蛋白质的体 内寿命的方法。PEG可以处于线性或分支形式以生成具有不同特征的不同分子。在延长 肽或蛋白质的半衰期外，已经使用PEG化来简化抗体开发成治疗剂，保护蛋白质免于蛋白 酶消化，并降低肾滤液中除去的蛋白质量(Harris等，Clin. Pharmacokinet. 40 :539-551, 2001)。另外，PEG化还可以提高蛋白质的总体稳定性和溶解度。最后，PEG化蛋白质的持续 的血浆浓度可以如下降低不利副作用的程度，即降低药物的谷至峰水平，如此消除需要在 早期时间点引入超生理学水平的蛋白质。可以通过两种通用方法来实现蛋白质的PEG化。在第一种方法中，将PEG随机连 接至表面暴露残基，特别是赖氨酸残基的伯胺(primary amines) 0已经尝试了通过用大 的聚合物诸如PEG靶向伯胺(N端和赖氨酸)来随机修饰FIX(参见例如美国公开文本号 2005/172459)。随机PEG化的缺点是所得的分子没有限定的结构，而且可以显著降低蛋白 质的活性。在称作位点特异性PEG化的第二种方法中，通过引入游离的半胱氨酸残基(即不 牵涉二硫键的半胱氨酸)来修饰蛋白质，可以使用充分描述的马来酰亚胺化学(例如，如 对 GM-CSF(Doherty 等，Bioconjug. Chem. 16 :1291-1298,2005), FVIII (美国公开文本号 2006/0115876)和 EPO (Long 等，Exp. Hematol. 34 :697-704,2006)等所描述的)将 PEG 附着 至所述游离的半胱氨酸残基。位点特异性PEG化导致限定结构的分子，而且通过注意选择 偶联位点来为使对蛋白质活性的负效应最小化提供机会。为了使位点特异性聚合物偶联获 得成功，蛋白质必须没有天然存在的游离半胱氨酸残基，从而引入蛋白质中的新的半胱氨 酸是仅有的可用于连接聚合物的游离半胱氨酸。PCT公开文本W02007/135182描述了为了与聚合物偶联而生成FIX的半胱氨酸取代的通用方法，但是不能证明这些位点的哪些可以 真实用于此目的。基于氨基酸序列和可用的晶体结构，FIX没有表现出具有任何游离的半胱氨酸残 基，使得创建新的游离半胱氨酸的突变会创建供聚合物偶联用的单一限定位点。已经描述 了引入游离的半胱氨酸可由于游离巯基的反应性而对蛋白质表达具有不利影响。新半胱氨 酸残基的引入应当在蛋白质上的表面暴露位置中，而且不应破坏蛋白质的功能或减弱蛋白 质表达。出于这些原因，鉴定适合于引入游离半胱氨酸的位点不是显而易见或微不足道的。一旦表达，天然的FIX是一条约55，000道尔顿的单链糖蛋白。它具有四种结构域 富含Gla或Y-羧基谷氨酸的域；EGF样区；激活肽；和含有活性位点的催化域(Thomson， Blood 67 :565-572,1986)。FIX在肝中以461个氨基酸的单链多肽合成，并且在通过高尔基 和内质网过程中经历广泛的翻译后修饰(Nemerson等，CRC Crit. Rev. Biochem. 9 =45-85, 1980 ；Stenflo 等，Annu. Rev. Biochem. 46 157-172，1977)。除去信号序列和前肽两者，导 致SEQ ID NO 1中描述的415个氨基酸的成熟蛋白(Choo等，Nature 299 178-180，1982 ； Kurachi 等，Proc Natl Acad Sci USA 79:6461-6464,1982)。有效的 Y -羧基化对于 FIX 的凝固活性是至关重要的，并且在人中，在N端Gla域内生成12个Gla残基，虽然对Gla36 和 Gla40 的 Y-羧基化是功能不需要的(DiScipio 等，Biochemistryl8 =899-904,1979 ； Gillis等，Protein Sci. 6 185-196，1997)。另外，天然的FIX含有两个N-连接的糖基化 位点(N157、N167)、六个0-连接的糖基化位点(S53、S61、T159、T169、T172、T179)、和各用 于Ser磷酸化(S158)、酪氨酸硫酸化(Y155)、和β -羟基化(D64)的一个位点(McMullen 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 115 :8-14,1983)。激活的因子VII (FVII)通过与由于对血管壁的损伤而暴露的组织因子(TF)形成 复合物来启动正常的止血过程。随后，复合物激活FIX ；活性形式称为因子Ife(FIXa)。通过 由FXIa或组织因子(TF) /FVIIa复合物在两个位点处进行的蛋白水解切割来除去FIX的激 活肽以生成催化活性分子，即Fife。FIXa和因子VIIIa(FVIIIa)将FX转化成因子)(a(FXa)， 其继而将凝血酶原转化成凝血酶。最终，凝血酶将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，导致血纤蛋 白凝块的形成。因为野生型FIX具有许多翻译后修饰(已经提示了其中一些在体内药动学图谱 (profile)中起作用)，可以在不影响这些其它修饰的位置处引入半胱氨酸残基。一旦生 成，FIX应当保持酶促活性，并与FVIII、FXI、和FX相互作用以有效治疗血友病B。引入的 半胱氨酸残基或偶联的聚合物不应干扰这些相互作用和功能。本申请提供了许多例示性的FIX变体，其中引入半胱氨酸残基以提供供聚合物偶 联用的位点。此外，本申请证明这些变体可以在哺乳动物细胞中表达，而且在凝固测定法中 证明活性。最后，这些修饰位点可以与增强FIX比活的改变(包括但不限于R338A突变和 / 或 V86A 突变)联合(Chang 等，J. Biol. Chem. 273 12089-12094，1998 ；Chang 等，J. Biol. Chem. 277 :25393-25399,2002)。与R338A和V86A突变之一或两者的组合补偿源自添加聚 合物偶联位点的任何活性降低，使得经修饰的多肽的比活与野生型FIX的比活类似或比野 生型FIX的比活高。本申请还部分提供了具有最小的功能干扰的经聚合物偶联的FIX多肽，如此其具 有提高FIX的生物利用度的效用。这些经聚合物偶联的多肽可以与增强FIX比活的改变
7(包括但不限于R338A突变和/或V86A突变)联合。增强FIX比活的改变可以补偿由于序 列修饰或聚合物偶联造成的凝固活性的潜在损失，而且还通过在较低的蛋白质水平赋予功 效来潜在地延长经修饰分子的功效。经修饰的FIX多肽本申请提供了包含一个或多个供聚合物偶联用的位点的FIX多肽，即经修饰的 FIX多肽。如本文中所使用的，“因子IX”指人血浆FIX糖蛋白，其是固有凝固途径的成员， 而且对于血液凝固是至关重要的。要理解的是，此定义包括天然以及重组形式的人血浆FIX 糖蛋白。除非另有规定或指明，如本文中所使用的，FIX指在其在凝固中的正常作用中的任 何功能性人FIX蛋白分子，包括任何其片段、类似物和衍生物。术语“片段”、“衍生物”、“类 似物”、和“变体”在提及本申请的多肽时指保留基本上相同生物学功能或活性的多肽片段、 衍生物、类似物、和变体。FIX多肽的非限制性例子包括FIX、FIfe、和具有FIX活性的截短型式的FIX。任何 维持至少某种程度的FIX活性的上述FIX多肽的生物学活性片段、缺失变体、取代变体、或 添加变体也可以充当FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多肽可以包含与SEQ ID N0:1至 少约70、80、90、或95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽是生物 学活性的。可以通过例如本文中所描述的凝固测定法来测定生物学活性。经修饰的FIX多肽还可以含有保守的氨基酸取代。保守取代在本领域中公认为用 一种氨基酸替换另一种具有相似特性的氨基酸，并且包括例如丙氨酸变化为丝氨酸；精氨 酸变化为赖氨酸；天冬酰胺变化为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变化为谷氨酸；半胱氨酸 变化为丝氨酸；谷氨酰胺变化为天冬酰胺；谷氨酸变化为天冬氨酸；甘氨酸变化为脯氨酸； 组氨酸变化为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变化为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变化为缬氨 酸或异亮氨酸；赖氨酸变化为精氨酸；甲硫氨酸变化为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变化 为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变化为苏氨酸；苏氨酸变化为丝氨酸；色氨酸变化为 酪氨酸；酪氨酸变化为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变化为异亮氨酸或亮氨酸。在一些实 施方案中，在引入一个或多个聚合物偶联位点外，SEQ ID NO :1的FIX多肽还包含1-30、 1-20、或1-10处保守的氨基酸取代。特定氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸、和三字母缩写如下A，丙氨酸 (Ala) ；C，半胱氨酸(Cys) ；D，天冬氨酸(Asp) ；E，谷氨酸(Glu) ；F，苯丙氨酸(Phe) ；G，甘氨 酸(Gly) ；H，组氨酸(His) ；I，异亮氨酸(Ile) ；K，赖氨酸(Lys) ；L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨 酸(Met) ；N，天冬酰胺(Asn) ；P，脯氨酸(Pro) ；Q，谷氨酰胺(Gln) ；R，精氨酸(Arg) ；S，丝氨 酸(Ser) ；T，苏氨酸(Thr) ；V，缬氨酸(Val) ；W，色氨酸(Trp) ；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸 (Nle)。本申请的一方面提供了经修饰的FIX多肽，其中聚合物偶联位点是经由非内源半 胱氨酸残基弓丨入的。可以用半胱氨酸残基替换一个或多个内源FIX氨基酸残基或者通过将 一个或多个半胱氨酸添加至FIX多肽。半胱氨酸残基的添加可以在人FIX的两个现有氨基 酸残基之间，诸如在氨基酸残基160和161之间、在161和162之间、在162和163之间、或 在163和164之间。所使用的氨基酸取代的术语如下。第一个字母代表在人FIX的位置上天然存在的 氨基酸残基。后面的数字代表成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO 1)中的位置。第二个字母代表取代(替换/取代)天然氨基酸的不同氨基酸。举例而言，R338A表示SEQ ID NO 1的第338位精氨酸残基已经用丙氨酸残基替换。在本文件中所使用的FIX残基数目系统指成熟人FIX蛋白的，其中残基1代表除 去信号序列和前肽两者后的成熟FIX多肽的第一个氨基酸。天然的或野生型FIX是全长成 熟人FIX分子，如SEQ ID N0:1中所显示的。在一些实施方案中，在FIX中在不会消除蛋白质功能或其在细胞中表达的位置处 工程化改造偶联位点。为了设计具有一个或多个聚合物偶联位点的FIX多肽，可以应用数 种标准。在一些实施方案中，偶联位点是表面暴露的。可以基于溶剂可接近表面来测定表 面暴露，如Autin等(J. Thromb. Haemost. 3 =2044-2056, 2005)中所测定的。在一些实施方 案中，偶联位点的引入没有引入已知与血友病B有关的突变。已知的突变可以参见环球网 于 kcl. ac. uk/ip/petergreen/haemBdatabase. html 禾口表 I0比较具有一个或多个引入的聚合物偶联位点的经修饰的FIX多肽与对照多肽的 特性可以为想要的。进行比较的特性包括例如溶解度、活性、血浆半衰期、聚合物偶联、和结 合特性。在一些实施方案中，可以将经修饰的FIX多肽与生物相容性聚合物偶联。选择最 适合于比较的对照多肽是在本领域技术人员的范围内的。在一些实施方案中，对照多肽与 经修饰的多肽是相同的，只是一个或多个引入的聚合物偶联位点。在一些实施方案中，对照 多肽与经修饰的多肽是相同的，只是对照多肽没有与聚合物偶联。例示性多肽包括野生型 FIX多肽和包含一处或多处激活突变诸如R338A和/或V86A的FIX多肽。本申请的一方面提供了经修饰的FIX多肽，其具有超过对照多肽的升高的体外或 体内稳定性。延长的血清半衰期和体内稳定性对于降低实现治疗效率所要求的剂量给药频 率可以为想要的。因而，在某些实施方案中，相对于对照多肽，经修饰的FIX多肽具有升高 约 20、30、40、60、80、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、或 1000% 的血清半衰 期。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少 10、或至少20天或更多的血清半衰期。在一些实施方案中，将表明血清半衰期延长的FIX 多肽进行PEG化。如本文中所使用的，术语“半衰期”在对患者施用多肽药物的上下文中定义为患者 中药物的血浆浓度降低一半所需要的时间。用于药动学分析和测定半衰期和体内稳定性 的方法会是本领域技术人员熟悉的。详情可以参见Kenneth等，Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Ph已rmacists禾口Peters·，Pharmacokinetc analysis A Practical Approach (1996)。也可以参考"Pharmacokinetics，"M Gibaldi 禾口 D Perron, Marcel Delcker出版，第2次修订版(198 ，其描述了药动学参数诸如t_ α和t-β半衰期 和曲线下面积(AUC)。经修饰的FIX多肽的活性可以描述为绝对值，诸如按单位计，或者为对照多肽活 性的百分比。在一些实施方案中，相对于对照蛋白质，经修饰的FIX多肽可以具有没有降低 超过约10、20、30、40、50、60、70、或80%的比活。例如，相对于对照FIX多肽，经修饰的FIX 多肽可以具有没有降低超过约80%的比活，若与对照的比活相比，经修饰的多肽维持至少 约20%的比活。因子IX比活可以定义为在凝固级联中发挥功能，经由与激活的血小板上 的FVIIIa的相互作用来诱导Ffe形成、或支持血液凝块的形成的能力。可以通过诸如如 记载于例如McCarthy等(Thromb Haemost. 87 (5) =824-830,2002)的凝块分析和本领域技术人员已知的其它技术等技术在体外评估活性。也可以使用数种动物系之一来体内评估 活性，所述数种动物系已经有意地用血友病B的遗传突变育种，使得自此类品系生成的动 物是FIX缺陷的。此类品系可获自多种来源，诸如(不限于)实验室和研究处(Division of Laboratories and Research),纽约公共健康部(New York Department of Public Health)，奥尔巴尼(Albany)，N. Y.和病理学系(Department of Pathology)，北卡罗来纳大 学(University ofNorth Carolina)，查布尔希尔(Chapel Hill), N. C。例如，这些来源的 这两者提供了患有犬血友病B的犬。或者，FIX缺陷的小鼠也是可用的(Sabatino等，Blood 104 :2767-2774,2005)。为了测试FIX活性，将测试多肽注射入患病的动物中，产生小的切 口，并比健康对照比较出血时间。人野生型FIX具有每mg 200个单位左右的比活。一个单位的因子IX已经定义为 1毫升正常的(合并的)(pooled)人血浆中存在的FIX量(对应于100%的FIX水平)。在 一些实施方案中，经修饰的FIX多肽具有每mg FIX多肽至少100个单位的比活。在一些实 施方案中，经修饰的FIX多肽具有每mg FIX多肽至少约120、140、160、180、200、220、240、 260个单位或更多的比活。在一些实施方案中，使用APTT或激活的部分促凝血酶原激酶时 间测定法(由例如Proctor等，Am. J. Clin. Pathol. 36 :212,1961所描述的和参见实施例) 来测量FIX的比活。在细胞诸如肝或肾细胞中表达时，FIX多肽可以由细胞机器(cellularmachinery) 合成，经历翻译后修饰，然后由细胞分泌入胞外环境中。因此，自细胞分泌的FIX多肽量依 赖于蛋白质翻译和胞外分泌这两个过程。在一些实施方案中，可以以相对于对照蛋白质的 分泌量没有降低超过约10、20、30、40、50、60、70、或80 %的量分泌经修饰的FIX多肽。例如， 可以以相对于对照FIX多肽没有降低超过约80%的量分泌经修饰的FIX多肽，若与对照相 比，以至少约20%的量分泌经修饰的多肽。可以例如使用任何本领域已知的方法来测定胞 外培养基中的蛋白质水平，从而测量分泌的FIX多肽量。用于蛋白质量化的传统方法包括 2-D凝胶电泳、质谱术、和抗体结合。用于测定生物学样品中的蛋白质水平的例示性方法包 括基于抗体的技术，诸如免疫印迹(Western印迹)、免疫组织学测定法、酶联免疫吸附测定 法(ELISA)、或放射性免疫测定法(RIA)。在一些实施方案中，相对于对照蛋白质与FVIII、FXI、或FX中至少一种的相互作 用，经修饰的FIX多肽以没有降低超过约40、50、60、70、或80%的水平与FVIII、FXI、或FX 中至少一种相互作用。例如，相对于对照FIX多肽，经修饰的FIX多肽以没有降低超过约 80%的水平与FVIII、FXI、或FX中至少一种相互作用，若比对照相比，经修饰的多肽以至少 约20%的水平与FVIII、FXI、或FX中至少一种相互作用。可以通过本领域技术人员已知的 任何方法(包括例如记载于Chang等，(J. Biol. Chem. 273 12089-12094，1998)中的方法) 来测定FIX对凝固级联的其它成员的结合。本申请部分提供了包含一个或多个偶联位点的FIX多肽。在一些实施方案中，偶 联位点是没有半胱氨酸残基的。在一些实施方案中，FIX多肽包含(i)至少一处选自下组 的半胱氨酸取代T148C、V153C、T163C、L165C、N167C、T169C、T172C、F175C、K201C、K247C、 K413C、和T415C和(ii)R338A突变和/或V86A突变。在一些实施方案中，FIX多肽包含 ⑴至少一处选自下组的半胱氨酸取代T148C、V153C、T163C、L165C、T172C、F175C、K247C、 和 T415C 和(ii)R338A 突变和 / 或 V86A 突变(and (ii) the R338Amutation, the V86Amutation, or both)。在一些实施方案中，FIX多肽包含(i)T148C和(ii) R338A突变和/ 或V86A突变。在一些实施方案中，FIX多肽包含(i)V153C和(ii) R338A突变和/或V86A 突变。在一些实施方案中，FIX多肽包含(i)T163C(ii)R338A突变和/或V86A突变。在一 些实施方案中，FIX多肽包含(i)L165C和(ii)R338A突变和/或V86A突变。在一些实施 方案中，FIX多肽包含(i)T172C和(ii)R338A突变和/或V86A突变。在一些实施方案中， FIX多肽包含(i)F175C和(ii)R338A突变和/或V86A突变。在一些实施方案中，FIX多肽 包含(i)KM7C和(ii)R338A突变和/或V86A突变。在一些实施方案中，FIX多肽包含⑴ T415C禾口 (ii)R338A突变和/或V86A突变。在一些实施方案中，FIX多肽是对引入的半胱氨酸残基进行PEG化的。在一些实 施方案中，相对于对应的非PEG化的FIX多肽，PEG化将FIX多肽的血清半衰期延长至少约 20、30、40、60、80、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、或 1000% 在一些实施方案中，提供了包含T169C、K201C、K247C、或L414C取代的FIX多肽。 在一些实施方案中，这些多肽进一步包含R338A突变和/或V86A突变。在一些实施方案中， 这些多肽是对引入的半胱氨酸残基进行PEG化的，而且相对于对应的非PEG化的FIX多肽， PEG化将FIX多肽的血清半衰期延长至少约20、30、40、60、80、100、150、200、300、400、500、 600、700、800、900、或 1000% FIX的激活肽(AP)是一种对于位点特异性偶联聚合物有吸引力的域，因为显示了 可以除去这种域而不降低蛋白质的催化活性，而且因为AP在将FIX激活成FMa后被除去 (Begbie 等，Thromb. Haemost. 94 1138-1147，2005)。因此，对 AP 域的修饰(诸如通过聚合 物偶联)不太可能干扰FMa的催化活性。因为没有AP的晶体结构，不可能确定此域内残 基的溶剂可接近性。然而，AP含有6个糖基化位点的实情指明此域的大部分是溶剂暴露的， 使它成为对于位点特异性聚合物修饰(包括位点特异性PEG化)有吸引力的区域。虽然报 告了可以删除AP而不降低催化活性，此域含有大多数在天然FIX (包括两个N-连接的糖基 化位点(Asnl57、Asn167)、酪氨酸硫酸化位点(Tyrl55)、丝氨酸磷酸化(krl58)、以及四个 用于0-连接的糖基化的位点(Thrl59、Thrl69、Thrl72、Thrl79))上发生的翻译后修饰。已知翻译后修饰对于蛋白质的功能是重要的，而且具体地，可以在测定体内药动 学中起重要的作用。在FIX的情况中，有证据提示AP内的特定翻译后修饰是蛋白质的体内 回收(注射后即时存在于血液中的蛋白质百分数)的重要决定因素，所述蛋白质的体内回 收可以影响血友病B患者中的治疗功效(White等，Thromb. Haemost. 78 =261-265,1997)。 因此，维持FIX的AP内的天然存在的翻译后修饰是想要的。本申请部分提供了包含在FIX的激活肽中，特别地在氨基酸残基160至164之间 引入的一个或多个聚合物偶联位点(例如游离的半胱氨酸残基)的FIX多肽。来自8种物 种的FIX序列的多序列比对表明小鼠、大鼠、和豚鼠序列在激活肽中都具有其它物种(人、 猕猴(rhesus)、犬(dog)、兔、猪)中没有找到的额外的氨基酸(7-10个残基)(图4)。这 些额外的序列位于E160和E162之间。这提示至少10个氨基酸残基的插入在FIX结构中 在此位点处是耐受的。在一些实施方案中，可以在人FIX的氨基酸残基160至164之间插 入多至30、25、20、18、16、14、或12个氨基酸残基。在一些实施方案中，插入多至10个氨基 酸。在一些实施方案中，插入多至9个氨基酸。根据用于在来自8种物种的FIX间实施多序列比对的标准，找到大鼠、小鼠、和豚鼠中的额外氨基酸的表观位点(apparent site)可以有所变化，使得位点可以在人FIX的 E160和A161之间、A161和E162之间、E162和T163之间、或T163和1164之间。在一些实 施方案中，将一个或多个氨基酸(例如一个或多个半胱氨酸残基)插入E160和A161之间， 并将一个或多个氨基酸插入A161和E162之间。在一些实施方案中，将一个或多个氨基酸 (例如一个或多个半胱氨酸残基)插入E160和A161之间，并将一个或多个氨基酸插入E162 和T163之间。在一些实施方案中，将一个或多个氨基酸(包括至少一个半胱氨酸残基)插 入A161和E162之间，并将一个或多个氨基酸(包括至少一个半胱氨酸残基)插入E162和 T163之间。在一些上文所描述的实施方案中，将一个或多个氨基酸(包括至少一个半胱氨 酸残基)插入T163和1164之间。在一些实施方案中，将多至30、25、20、18、16、14、或12个 总氨基酸残基(包括至少一个半胱氨酸残基)插入人FIX的氨基酸残基161至164之间。 在一些实施方案中，将多至10个总氨基酸(包括至少一个半胱氨酸残基)插入人FIX的氨 基酸残基160至164之间。在一些实施方案中，将多至9个总氨基酸(包括至少一个半胱 氨酸残基)插入人FIX的氨基酸残基160至164之间。在一些实施方案中，引入1-5个半 胱氨酸残基。在一些实施方案中，可以将多至10个氨基酸插入E160和A161之间、A161和E162 之间、E162和T163之间、或T163和1164之间，插入序列含有1_5个半胱氨酸残基，剩余的 残基由Ala、kr、Gly、Asp、和Ile的混合物组成。在一些实施方案中，可以设计插入的序列 以避免预测的人T细胞表位，以便降低在对患者施用经修饰的蛋白质时人免疫系统识别插 入序列的机会。在一些实施方案中，将单个半胱氨酸残基插入A161和E162之间。在一些实施方 案中，所述多肽进一步包含R338A和/或V86A。本申请的一方面提供了经修饰的FIX多肽，所述经修饰的FIX多肽包含至少一个 或多个引入的聚合物偶联位点，其包括至少一个半胱氨酸残基和一处或多处提高FIX活性 的突变。激活性FIX突变的例子包括R338A和V86A突变。在一些实施方案中，经修饰的 FIX多肽包含R338A突变。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含V86A突变。在一些 实施方案中，经修饰的FIX多肽包含R338A和V86A突变两者。本申请的别的方面提供了具有升高的比活的FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多 肽包含R338A和V86A突变。在一些实施方案中，所述多肽具有每mg多肽至少约200、300、 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1400、1600、1800、或 2000 个单位的比活。可
以通过例如使用APTT测定法来测定比活。这些多肽可用作治疗剂，例如，在罹患血友病B 的患者中。这些多肽可以包含本文中所描述的别的突变或修饰，诸如聚合物偶联位点，包括 至少一个半胱氨酸残基。经修饰的FIX多Jft的生成可以插入或取代氨基酸残基以引入聚合物偶联位点。例如，可以通过改变FIX的 氨基酸序列来引入半胱氨酸残基。氨基酸序列变化可以通过多种技术来实现。例如，可以 通过位点特异性诱变来实现对编码氨基酸序列的核酸序列的修饰。用于位点特异性诱变的 技术是本领域中公知的，并且记载于例如hller等(DNA 3 =479-488,1984)或Horton等， (Gene 77 :61_68，1989，第61页-第68页)。如此，使用FIX的核苷酸和氨基酸序列，可以 引入挑选的改变。同样地，使用特异性引物使用聚合酶链式反应来制备DNA构建体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。也可以通过建立的标准方法(例如Beaucage等(Gene Amplif. Anal. 3 :1-26, 1983)描述的亚磷酰胺方法)合成制备编码FIX多肽的核酸构建体。依照亚磷酰胺方法，将 寡核苷酸在例如自动DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接，并在合适的载体中克隆。也可以 通过使用特异性引物进行的聚合酶链式反应来制备编码人FIX多肽的DNA序列，例如，如记 载于美国专利号4，683，202 ；或&iiki等(Science 239 :487-491，1988)的。此外，核酸构 建体可以是混合的合成的和基因组的、混合的合成的和cDNA、或混合的基因组的和cDNA起 源的，其通过依照标准的技术连接与整个核酸构建体的各部分对应的合成的、基因组的、或 cDNA起源(在适当时)的片段来制备。可以使用重组DNA方法来将编码FIX多肽的DNA序列插入重组载体中。载体的选 择通常会取决于要导入载体的宿主细胞。载体可以是自主复制型载体或整合型载体。自主 复制型载体以染色体外实体存在，而且其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。整合型载体 是整合入宿主细胞基因组中并与已经将其整合的染色体一起复制的载体。载体可以是表达载体，其中编码经修饰的FIX的DNA序列与转录、翻译、或加工DNA 所需要的别的区段，诸如启动子、终止子、和多聚腺苷酸化位点可操作连接。一般而言，表达 载体可以源自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两者的元件。术语“可操作连接”指明排列 区段以使它们为了其预期目的而一致地发挥功能，例如，转录在启动子中启动，并在整个编 码多肽的DNA序列中继续进行。用于表达FIX多肽的表达载体可以包含能够指导克隆基因或cDNA转录的启动子。 启动子可以是在挑选的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，而且可以源自编码对于 宿主细胞而言同源的或异源的蛋白质的基因。适合于指导编码FIX多肽的DNA在哺乳动物细胞中转录的启动子的例子是例如， SV40 启动子(Subramani 等，Mol. Cell Biol. 1 :854-864,1981)、MT-I (金属硫蛋白基因) 启动子(Palmiter 等，Science 222 :809-814,1983)、CMV 启动子(Boshart 等，Cell 41 521-530，1985)、或腺病毒 2 主要晚期启动子(Kaufman 等，Mol. Cell Biol, 2 :1304-1319, 1982)。若必要的话，也可以将编码FIX多肽的DNA序列可操作连接至合适的终止子，诸如 人生长激素终止子(Palmiter 等，Science 222 :809-814,1983)或 TPIl (Alber 等，J. MoI. Appl. Gen. 1 :419-434,1982)或 ADH3 (McKnight 等，EMBO J. 4 :2093-2099,1985)终止子。 表达载体还可以含有位于插入位点下游的多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸化信号包括来自 SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信号、来自腺病毒5ΕΛ区的多聚腺苷酸化信号、人生长激 素基因终止子(DeNoto等，Nucl. Acids Res. 9 :3719_3730，1981)、或来自人FIX基因的多聚 腺苷酸化信号。表达载体还可以包含增强子序列，诸如SV40增强子。为了将本发明的FIX多肽引导入宿主细胞的分泌途径中，可以使用天然的FIX分 泌信号。或者，可以在重组载体中提供分泌信号序列(又称为前导序列、前原序列(prepro sequence)、或前序列)。可以以正确的读码框将分泌信号序列连接至编码FIX类似物的DNA 序列。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5’。例示性信号序列包括例如，MPIF-I 信号序列和司腺钙蛋白(starmiocalcin)信号序列。
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用于连接编码FIX多肽的DNA序列、启动子、和任选地终止子和/或分泌信号序 列和用于将它们插入含有对于复制必要的信息的合适载体中的方法是本领域技术人员公 知白勺(参见例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。转染哺乳动物细胞并表达导入细胞中的DNA序列的方法记载于例如Kaufman等 (J. Mol. Biol. 159 :601-621,1982) ；Southern 等(J. Mol. Appl. Genet. 1 :327-341,1982)； Loyter 等，(Proc. Natl .Acad. ki. USA 79 :422-426,1982) ；Wigler 等，(Cell 14:725-731， 1978) ；Corsaro 等，(Somatic Cell Genetics 7 :603-616,1981), Graham 等，(Virology 52 :456-467,1973)；及 Neumann 等，(EMBO J. 1 :841-845,1982) 可以通过例如脂转染、 DEAE-右旋糖苷介导的转染、微注射、原生质体融合、磷酸钙沉淀、逆转录病毒投递、电穿孔、 声穿孔(sonoporation)、激光照射、磁转染(magnetofection)、天然转化、和生物射弹转化 来将克隆的DNA序列导入培养的哺乳动物细胞中(参见例如Mehier-Humbert等，Adv. Drug Deliv. Rev. 57 :733_753，2005)。为了鉴定并选择表达外源DNA的细胞，一般与感兴趣的基 因或cDNA —起将赋予可选择表型(选择标志)的基因导入细胞中。选择标志包括例如，赋 予对药物诸如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、和甲氨蝶呤的抗性的基因。选择标志可以是可扩 增选择标志，其容许扩增标志物和外源DNA(在连接所述序列时)。例示性的可扩增选择标 志包括二氢叶酸还原酶(DHFI )和腺苷脱氨酶。选择合适的选择标志是在本领域技术人员 的范围内的(参见例如美国专利号5，238，820)。用DNA转染细胞后，将它们在合适的培养基中培养以表达感兴趣的基因。如本文 中所使用的，术语“合适的培养基”指含有细胞生长和活性FIX多肽表达所需要的营养物和 其它成分的培养基。培养基一般包含例如碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖类、维生素、盐类、磷脂、蛋白 质、和生长因子，并且在维生素K依赖性蛋白质诸如FIX的情况中，还可以提供维生素K。然 后应用药物选择以选择以稳定的方式表达选择标志的细胞的生长。对于已经用可扩增选择 标志转染过的细胞，可以提高药物浓度以选择克隆序列的拷贝数目升高，由此提高表达水 平。然后对稳定转染细胞的克隆筛选FIX多肽的表达。用于本发明的哺乳动物细胞系的例子是C0S-1 (ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)、 HKBll 细胞(Cho 等，J. Biomed. Sci, 9 :631-638,2002)、和 HEK-293 (ATCC CRL 1573 ；Graham 等，J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977)细胞系。另外，可以在本发明内使用许多其它细胞系， 包括大鼠H印I (大鼠肝癌；ATCC CRL1600)、大鼠H印II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、 TCMK-I(ATCC CCL 139)、H印-G2(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1),CH0-K1(ATCC CCL61)、禾口 CHO-DUKX 细胞(Urlaub 禾口 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216-4220, 1980)。可以从细胞培养基回收FIX多肽，然后可以通过本领域中已知的多种方法来纯化 所述FIX多肽，所述方法包括但不限于层析(例如离子交换、亲和力、疏水性、层析聚焦、和 大小排阻)、电泳方法(例如制备等电聚焦(pr印arativeisoelectric focusing, IEF)、差 别溶解度(例如硫酸铵沉淀))、提取(参见例如ftOtein Purification, Janson禾口 Lars Ryden编，VCH Publishers, New York，1989)，或其各种组合。在一个例示性的实施方案中， 可以通过在抗FIX抗体柱上的亲和层析来纯化多肽。可以通过常规的化学纯化手段，诸如高效液相层析来实现别的纯化。其它纯化方法是本领域中已知的，而且可以适用于经修饰 的 FIX多肽的纯化(参见例如 Scopes，R. ,Protein Purification, Springer-Verlag,N. Y.， 1982)。一般而言，“纯化的”应当指已经进行过分级以除去各种其它成分，而且基本上保 留其表达的生物学活性的蛋白质或肽组成。在使用术语“基本上纯化的”的情况中，此名称 应当指如下的组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要成分，诸如构成组合物中约50%、 约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约99%、或更多的蛋白质。多种用于量化多肽纯化程度的方法是本领域技术人员已知的。这些包括例如测定 活性级分的比活，或通过SDS/PAGE分析来评估级分内的多肽量。用于评估级分纯度的例示 性方法是计算级分的比活，与初始提取物的比活比较活性，并且如此计算在本文中通过“倍 值纯化数目”评估的纯度。当然，用于表示活性量的实际单位会取决于特定的测定技术。聚合物偶联经修饰的FIX多肽可以包含一个或多个可用于附着聚合物模块的聚合物偶联位 点。在一些实施方案中，可以将FIX多肽与生物相容性聚合物偶联。生物相容性聚合物可 以选择为提供想要的药动学改善。例如，可以选择聚合物的身份(identity)、大小、和结构 以便改善具有FIX活性的多肽的循环半衰期或降低多肽的抗原性而没有不可接受的活性 降低。可用于本发明的聚合物的例子包括但不限于聚(亚烷基二醇)(polyblkylene glycols))诸如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇等的共聚物、聚(乙 MMit^jtW-) (poly(oxyethylated polyol)) () (poly (olef inic alcohol))
(乙烯基吡硌烷酮)(polyvinylpyrrolidone))、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)(poly(hydroX yalkylmethacrylamide))、聚(甲基丙；！；希酸轻烧基酉旨)(poly (hydroxyalkylmethacrylate) )、聚(Il) (poly (saccharides)) ^M ( α _ Ρ 基酸)(poly (alpha一hydroxy acid))、聚(乙 ΙΙ) (polyvinyl alcohol))(polyphosphazene)、胃口 恶P坐if木(polyoxazoline) >
聚(N- M lit ( l# ) (poly(N-acryloylmorpholine)) > ^ Bi(polysialic acid)、
羟乙基淀粉(HES) (hydroxyethyl starch (HES))、聚环氧乙烧(polyethylene oxide)、 ^ -MW'M^'M (alkyl-polyethylene oxides) ,MMW'M Δ'M (bispolyethylene oxides)、聚环氧烧烃的共聚物或嵌段共聚物(co-polymers or block co-polymers of polyalkyeneoxides)、聚(乙二酉享-共-丙二酉享)(poly(ethylene glycol-co-propylene glycol))、聚(N-2-(羟丙基)甲基丙烯酰胺)(p0ly(N-2-(hydr0Xypr0ply) methyacrylamide))、禾口右旋 Ρ (dextran)。聚合物不限于特定的结构，并且可以是线性的(例如烷氧基PEG或双功能性PEG)、 或非线性的诸如分支的、成叉的、多臂的(例如附着至多元醇核心的PEG)、和树枝状的。此 外，聚合物的内部结构可以以许多不同样式组织，并且可以选自下组均聚物、交替共聚物、 随机共聚物、嵌段共聚物、交替三聚体、随机三聚体、和嵌段三聚体。可以用合适的活化基团活化PEG和其它水溶性聚合物(即聚合物试剂)，所述活化 基团适合于偶联至FIX多肽上想要的位点。如此，聚合物试剂会拥有用于与FIX多肽反应 的反应基团。用于偶联这些聚合物与活性模块的代表性聚合物试剂和方法是本领域中已知 的，而且进一步记载于 Zalipsky 等，("Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols)for Modification ofPolypeptides"in Polyethylene Glycol Chemistry :Biotechnical and BiomedicalApplicat ions, J.M.Harris, Plenus Press, New York (1992))禾口 Zalipsky (Adv. Drug ReV. 16 :157-182,1995)。聚合物的重量平均分子量可以是约100道尔顿至约150，000道尔顿。然而，例示 性的范围包括范围为大于约5，000道尔顿至约100，000道尔顿、范围为约6，000道尔顿至 约90，000道尔顿、范围为约10，000道尔顿至约85，000道尔顿、范围为大于约10，000道尔 顿至约85，000道尔顿、范围为约20，000道尔顿至约85，000道尔顿、范围为约53，000道尔 顿至约85，000道尔顿、范围为约25，000道尔顿至约120，000道尔顿、范围为约29，000道 尔顿至约120，000道尔顿、范围为约35，000道尔顿至约120，000道尔顿、范围为约40，000 道尔顿至约120，000道尔顿的重量平均分子量。生物相容性聚合物的例示性重量平均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约 300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约 800道尔顿、约900道尔顿、约1，000道尔顿、约1，500道尔顿、约2，000道尔顿、约2，200道 尔顿、约2，500道尔顿、约3，000道尔顿、约4，000道尔顿、约4，400道尔顿、约4，500道尔 顿、约5，000道尔顿、约5，500道尔顿、约6，000道尔顿、约7，000道尔顿、约7，500道尔顿、 约8，000道尔顿、约9，000道尔顿、约10，000道尔顿、约11，000道尔顿、约12，000道尔顿、 约13，000道尔顿、约14，000道尔顿、约15，000道尔顿、约20，000道尔顿、约22，500道尔 顿、约25，000道尔顿、约30，000道尔顿、约35，000道尔顿、约40，000道尔顿、约45，000道 尔顿、约50，000道尔顿、约55，000道尔顿、约60，000道尔顿、约65，000道尔顿、约70，000 道尔顿、和约75，000道尔顿。也可以使用分支型式的生物相容性聚合物(例如由两个 20，000道尔顿聚合物组成的分支的40，000道尔顿聚合物)，其具有任何上述的总分子量。在一些实施方案中，聚合物是PEG。PEG是一种公知的、水溶性聚合物，其是商业上 可获得的或者可以通过依照本领域中公知的方法(Sandler和Karo，Polymer Synthesis, Academic Press,New York，第3卷，第138页-第161页)进行的乙二醇开环聚合来制备。 术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或PEF末端处的修饰，而且可以 以下式表示X-0 (CH2CH2O)lriCH2CH2OH,其中η是20至2300，而X是H或末端修饰，例如，C1^ 烃基(烷基)。PEG可以含有别的化学基团，其对于结合反应是必需的，其源自分子的化学 合成、或者其起间隔物作用，用于分子的各部分的最佳距离。另外，此类PEG可以由一个或 多个连接在一起的PEG侧链组成。具有超过一个PEG链的PEG称作多臂的或分支的PEG。 可以例如通过将聚环氧乙烷添加至多种多元醇(包括甘油、季戊四醇、和山梨糖醇)来制备 分支的PEG。例如，四臂的分支PEG可以从季戊四醇和环氧乙烷制备。分支的PEG的例子记 载于例如欧洲公布的申请号473084A和美国专利号5，932，462。一种形式的PEG包括经由 赖氨酸的伯氨基基团连接的两个PEG侧链(PEG2) (Monfardini等，Bioconjugate Chem. 6 62-69，1995)。在一个实施方案中，聚合物可以是末端加帽的聚合物，即具有至少一个用相对惰 性的基团诸如低级CV6烷氧基基团(虽然也可以使用羟基基团)加帽的末端的聚合物。在 聚合物是PEG时，例如，可以使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，其是线性形式的PEG，其中 该聚合物的一端具有甲氧基(一OCH3)基团，而另一端是可任选地进行化学修饰的羟基或其 它功能基团。
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也可以使用多臂的或分支的PEG分子(诸如那些记载于美国专利号5，932，462 的)作为PEG聚合物。另外，PEG可以包含成叉的PEG(参见例如PCT公开文本号WO 1999/45964，其披露了能够用于本发明的一个或多个实施方案的多种成叉的PEG结构)。连 接Z功能基团与分支碳原子的原子链充当拴系(tethering)基团，并且可以包括例如，烃基 链(烷基链)、醚链、酯链、酰胺链、和其组合。PEG聚合物还可以包含悬吊的PEG分子，其具有沿着PEG的长度而不是在PEG链末 端共价附着的反应基团诸如羧基。可以直接地或者经由间隔物模块诸如亚烃基(烷基)基 团将悬吊的反应性基团附着至PEG。为了实现聚合物分子与多肽的共价附着，必须以活化形式提供聚合物分 子的羟基末端基团，所述活化形式即为具有反应性功能基团(其例子包括伯氨基 团、酰胼(hydrazide) (HZ)、硫醇、琥珀酸酯(succinate) (SUC)、琥珀酰亚氨基琥 珀酸酯(succinimidyl succinate) (SS)、琥珀酰亚氨基琥珀酰胺(succinimidyl succinamide) (SSA)、琥珀酰亚氨基丙酸酯(succinimidylpropionate) (SPA)、琥珀酰 亚氨基丁酸酯(succinimidyl butanoate) (SBA)、琥珀酰亚氨基羧甲酯(succinimidyl carboxymethylate)(SCM)、苯并三唾碳酸酉旨(benzotriazole carbonate)(BTC)、 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) (NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(aldehyde, nitrophenylcarbonate) (NPC)、和三氟乙基磺酸酯(tresylate，TRES)) 合适地活化的聚 合物分子是商业上可获得的，例如，N0F,日本；Nektar Therapeutics, Inc.，Huntsville, Ala. ；PoIyMASC Pharmaceuticals pic,UK ；或 SunBioCorporation, Anyang City,韩国。或 者，可以通过本领域中已知的常规方法(参见例如WO 90/13540)来活化聚合物分子。适合 于用于本发明的活化的线性或分支聚合物分子的具体例子是商业上可获得的，例如，N0F, 日本；NektarTherapeutics, Inc.，Huntsville, Ala。活化的PEG聚合物的具体例子包括 下列线性 PEG NHS-PEG, SPA-PEG、SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG、NOR-PEG、BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CD I-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, I0D0-PEG、和 MAL-PEG，和分支的 PEG，诸如 PEG2-NHS、PEG2-MAL、和那些 披露于例如美国专利号5，932，462和美国专利号5，643，575的，通过提及而将这两者收入 本文。在一个实施方案中，聚合物具有巯基反应性模块，其能与FIX多肽上的游离半胱 氨酸起反应以形成共价连接。此类巯基反应性模块包括硫醇、三氟甲磺酸酯(triflate)、三 氟乙基磺酸酯、氮杂环丙烷(aziridine)、环氧乙烷、S-吡啶基、或马来酰亚胺模块。此外， 通过提及而收入本文的下列公开文本披露了有用的聚合物分子和/或PEG化化学美国专 利号 6，113，906 ；7，199，223 ；5，824，778 ；5，476，653 ；4，902，502 ；5，281，698 ；5，122，614 ； 5，219，564 ；5，736，625 ；5，473，034 ；5，516，673 ；5，629，384 ；5，382，657 ；WO 97/32607 ； WO 92/16555 ；WO 94/04193 ；WO 94/14758 ；WO 94/17039 ；WO 94/18247 ；WO 94/28024 ； WO 95/00162 ；WO 95/11924 ；W095/13090 ；WO 95/33490 ；WO 96/00080 ；WO 97/18832 ； WO 98/41562 ；WO 98/48837 ；WO 99/32134 ；WO 99/32139 ；WO 99/32140 ；WO 96/40791 ； WO 98/32466 ；WO 95/06058 ；WO 97/03106 ；WO 96/21469 ；WO 95/13312 ；WO 98/05363 ；WO 96/41813 ；WO 96/07670 ；EP809996 ；EP921131 ；EP605963 ；EP510356 ；EP400472；EP183503 ； EP154316 ；EP229108 ；EP402378 ；和 EP439508。
对于半胱氨酸残基的PEG化，可以在PEG化前用还原剂诸如二硫苏糖醇(DDT)处 理多肽。随后，可以通过任何常规的方法诸如通过脱盐来除去还原剂。PEG与半胱氨酸残 基的偶联通常在合适的缓冲液中在PH 6-9于4°C变化至25°C的温度发生多至约16小时 的时期。用于与半胱氨酸残基偶联的活化的PEG聚合物的例子包括例如下列线性的和分 支的 PEG 乙烯砜-PEG(Vinylsulfone-PEG) (PEG-VS)诸如乙烯砜-mPEG(mPEG-VS)；邻批 啶基-二硫化物-PEG(orthopyridyl-disulfide-PEG) (PEG-OPSS)诸如邻吡啶基-二硫 化物-mPEG (MPEG-0PSS)；和马来酰亚胺-PEG (maleimide-PEG) (PEG-MAL)诸如马来酰亚 胺-mPEG (mPEG-MAL)和分支的马来酰亚胺 _mPEG2 (mPEG2_MAL)。在一个实施方案中，可以在细胞培养基中培养的细胞中表达具有一个或多个引入 的聚合物偶联位点的FIX多肽，所述细胞培养基含有通过形成二硫键来为多肽的半胱氨酸 残基“加帽”的半胱氨酸。为了将聚合物偶联物添加至FIX多肽，可以通过释放帽的适度还 原来除去半胱氨酸帽，然后添加半胱氨酸特异性聚合物试剂。本申请还提供了一种用于制备经聚合物偶联的FIX多肽的方法，包括将聚合物偶 联位点，即半胱氨酸残基引入编码FIX多肽的核苷酸序列中；表达突变的核苷酸序列以生 成包含引入的聚合物偶联位点的多肽；纯化所述多肽；使多肽与已经活化以在还原的半胱 氨酸残基处与多肽起反应的生物相容性聚合物起反应，从而形成偶联物；并纯化所述偶联 物。在另一个实施方案中，本申请提供了一种用于定点PEG化FIX多肽突变蛋白的方法，包 括(a)表达包含引入的聚合物偶联位点，即FIX多肽的暴露表面上引入的半胱氨酸残基的 FIX多肽，其中所述半胱氨酸是加帽的；(b)在适度还原引入的半胱氨酸并释放帽的条件下 使FIX多肽与还原剂接触；(c)自FIX多肽除去帽和还原剂；并(d)除去还原剂后至少约5、 15、或30分钟，在使得生成PEG化的FIX多肽的条件下用包含巯基偶联模块的PEG处理FIX 多肽。PEG的巯基偶联模块选自下组硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮杂环丙烷、 环氧乙烷、S-吡啶基、或马来酰亚胺模块。下文描述了一种生成PEG化的FIX多肽的例示性方法。用还原剂诸如0. 7mM三 (2-羧乙基)膦(TCEP)或0.07mM 二硫苏糖醇(DTT)于4°C适度还原约1 μ M包含引入的非 天然半胱氨酸残基的纯化的FIX多肽达30分钟以释放“帽”。通过大小排阻层析(SEC)方 法(诸如使样品运行流过旋转柱以容许二硫化物再形成，期间让引入的半胱氨酸为游离且 还原的)与“帽”一起除去还原剂。除去还原剂后至少30分钟，用至少10倍摩尔过量的大 小范围为5至85kD的PEG-马来酰亚胺于4°C处理FIX多肽至少1小时。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来评估FIX的聚合物偶联物。例如，可 以通过在还原性6% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶上的电泳来分析经聚合物偶联的 FIX。电泳后，可以用考马斯蓝染色凝胶以鉴定所有蛋白质或者进行标准的Western印迹方 案，以便与未偶联的FIX多肽相比鉴定条带分子量的变化。可以使用对PEG特异性的碘化 钡染色以确认具有分子量变化的条带包含PEG化的蛋白质。聚合物偶联前和后，也可以通 过基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)质谱术来分析FIX多肽，以便测定聚合物偶联的程 度和效率。药物组合物本申请部分提供了组合物，其包含具有一个或多个引入的聚合物偶联位点的FIX 多肽，如本文中所描述的。在一些实施方案中，提供了包含与生物相容性聚合物偶联的FIX多肽的组合物。所述组合物适合于体内施用，而且是无热原的。组合物还可以包含药学可 接受载体。短语“药学或药理学可接受的”指在对动物或人施用时不产生不利的、变态反应 的、或其它不适当的反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括 任何和所有溶剂、分散介质、涂层物质、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。对药 学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中公知的。也可以将补充的活性成分掺入组合物 中。本发明的组合物包括典型的药物制剂。依照本发明的这些组合物的施用可以经由 任何常见的路径，只要靶组织经由所述路径是可接近到的。可以通过任何常规的方法(例 如通过静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、皮下、肺内、□服、舌下、鼻、肛 门、阴道、或经皮投递、或者通过特定位置处的手术植入)来将药物组合物导入受试者中。 治疗可以由单剂或一段时间里的多剂组成。活性化合物可以作为水中没有碱基或药理学可接受盐的溶液适当地与表面活性 剂诸如羟丙基纤维素混合地制备用于施用。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、和其混合 物中、及在油中制备。在贮存和使用的通常条件下，这些制剂可以含有防腐剂以阻止微生物 生长。适合用于可注射使用的药学形式包括无菌水溶液或分散体和供即时制备无菌可 注射溶液或分散体用的无菌粉剂。所述形式应当是无菌的，而且应当是流体的，其程度使得 存在容易的可注射性。它在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物诸如细 菌和真菌的污染作用提供防护。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇 (例如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)、蔗糖、L-组氨酸、Polysortate 80、或其合适的混 合物、和植物油。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的 粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟 苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等)可以实现阻止微生物的作用。可 注射组合物可以包含等张剂(例如糖类或氯化钠)。可以通过在组合物中使用延迟吸收的 药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的吸收延长。可以如下制备无菌可注射溶液，即根据需要在具有上文所列举的多种其它成分的 合适溶剂中掺入需要量的活性化合物(例如FIX多肽)，接着过滤灭菌。一般而言，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介中来制备分散体，所述无菌 媒介含有基础分散介质及来自那些上文所列举的成分的其它所需成分。在供制备无菌可注 射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法包括例如自其先前无菌过滤的溶液产生活性成分 和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥。配制后，可以以与剂量配制剂相容的方式和以诸如治疗有效的量来施用溶液。“治 疗有效量”在本文中用于指在血流中或在靶组织中提供想要水平的多肽所需要的多肽量。 精确量会取决于多种因素，例如特定的Fix多肽、治疗性组合物的成分和物理特征、预期的 患者群体、投递模式、个体患者考虑等，而且本领域技术人员可以基于本文中所提供的信息 来容易地确定。可以以多种剂量形式诸如可注射溶液等来容易地施用配制剂。对于水溶液中的胃 肠外施用，例如若必要的话，应当适当地使溶液缓冲，并首先用足够的盐水或葡萄糖给予液 体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。
FIX的剂量通常按单位表示。每kg体重的一个单位的FIX可以将血浆水平提高 0.01个U/ml，即1%。其它方面健康的患者具有每ml血浆一个单位的FIX，即100%。血友 病B的轻度病例以6-60 %之间的FIX血浆浓度限定，中度病例以1-5 %之间的FIX血浆浓度 限定，而重度病例(其占血友病B病例的约一半)具有小于的FIX。预防性处理或小出 血(minor hemorrhaging)的处理通常需要将FIX水平提高至15-30%之间。中度出血的处 理通常需要将水平提高至30-50%之间，而大创伤(major trauma)的处理可以需要将水平 自50升高至100%。可以如下测定提高患者的血液水平所需要的总计单位数目1.0个单 位/kg χ体重(kg)x想要的百分比升高(％正常的)。可以通过初始推注接着连续输注来 实施胃肠外施用以维持药物产品的治疗性循环水平。在一些实施方案中，可以施用15-150 个单位/kg FIX多肽。本领域普通技术人员会容易优化有效剂量和施用方案，如通过优良 医学实践和个体患者的临床状况所确定的。剂量给药的频率会取决于药剂的药动学参数和施用路径。本领域技术人员 可以根据施用路径和想要的剂量来确定最佳的药物配制剂(参见例如Remington’ s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.，Easton, Pa. , % 20 2000, Miii^.S. 而将其收入本文)。此类配制剂可以影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放率、和体 内清除率。根据施用路径，可以依照体重、体表面积、或器官大小来计算合适的剂量。本领 域普通技术人员无需过度实验，特别地根据本文中所公开的剂量信息和测定法以及在动物 或人临床试验中观察到的药动学数据常规地进行确定合适的治疗剂量所必需的计算的进 一步精化。例示性的剂量给药日程表包括但不限于一天五次、一天四次、一天三次、每天两 次、每天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次、和其任意组合的施用。合适的剂量可以经由使用已建立的用于测定血液凝固水平的测定法连同相关的 剂量响应数据来确定。主治医生可以考虑修饰药物作用的因素，例如药物的比活、损伤的严 重性、和患者的响应性、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重性、施用的时 间、和其它临床因素来确定最终的剂量方案。组合物还可以包括用于预防或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合用于本发明 的抗微生物剂的非限制性例子包括苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethoniumchloride)、苯甲 醇、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、三氯叔丁醇、酚、苯基乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞 (thimersol)、和其组合。抗氧化剂也可以存在于组合物中。可以使用抗氧化剂来阻止氧化，由此防止制 剂变质。适合用于本发明的抗氧化剂包括例如抗坏血酸棕榈酸盐、丁羟茴醚(butylated hydroxyanisole) > 丁 轻甲苯(butylated hydroxytoluene) > 次 舞酸、单 ψι 代甘油 (monothioglycerol)、没食子酸丙酉旨(propyl gal late)、亚硫酸氧钠(sodium bisulfite) > 甲醛合次硫酸氢钠(sodium formaldehyde sulfoxylate)、焦亚硫酸钠、和其组合。表面活性剂可以作为赋形剂存在。例示性的表面活性剂包括=Polysorbates 诸如Tween -20 (聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)和Tween -80 (聚氧乙烯脱 水山梨醇单油酸酯)和Pluronic诸如F68和F88(两者都可购自BASF，Mount Olive, N. J.)；脱水山梨糖醇酯(sorbitan esters)；脂质诸如磷脂诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholines)、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸和脂肪酯；类固醇诸如胆固醇；和螯合剂 诸如EDTA、锌和其它此类合适的阳离子。
酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可以使用的酸的非限制性例子包括氢氯 酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、延胡索酸、 和其组合。适合的碱的例子包括但不限于氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、 乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、延胡索酸钾、和其组合。组合物中任何个别赋形剂的量可以随赋形剂的活性和组合物的特定需要而所有 变化。通常，可以经由常规实验，即通过制备含有不同量的赋形剂(范围为低的至高的) 的组合物、检查稳定性和其它参数、然后测定保留最佳性能而没有显著不利效果的范围来 确定任何个别赋形剂的最佳量。一般而言，赋形剂可以以约至约99% (按重量计)、约 5%至约98% (按重量计)、约15至约95% (按重量计)的赋形剂的量存在于组合物中，其 中浓度小于30% (按重量计)。这些上述药用赋形剂以及其它赋形剂记载于“Remington; TheScience&Practice of Pharmacy,，，第 19版,Williams&Williams, (1995) ；"Physician's Desk Reference, ” 第 52 版，Medical Economics, Montvale, N. J. (1998)；及 Kibbe, Α. H. , Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 3 版，American Pharmaceutical Association, Washington, D.C. ,2000。例示性用途可以使用本文中所描述的组合物来治疗与FIX的功能性缺陷或FIX缺乏诸如FIX 的体内半衰期缩短、FIX的结合特性改变、FIX的遗传缺陷、和FIX的血浆浓度降低有关的任 何出血病症。FIX的遗传缺陷包括例如，编码FIX的核苷酸序列中碱基的缺失、添加、和/或 取代。在一个实施方案中，出血病症可以是血友病B。此类出血病症的症状包括例如，严重 鼻出血、口粘膜出血、关节血肿(hemarthrosis)、血肿、持续性血尿、胃肠出血、腹膜后出血、 舌/咽后出血(tongue/retropharyngeal bleeding)、颅内出血、和创伤相关的出血。本发明的组合物可以用于预防性应用。在一些实施方案中，可以对易感疾病状态 或损伤或在其它情况中有疾病状态或损伤风险的受试者施用经修饰的FIX多肽以增强受 试者自身的凝固能力。此类量可以定义为“预防有效剂量”。为了预防而施用经修饰的FIX 多肽包括血友病B患者要经历手术，并在手术前1至4小时之间施用多肽的情况。另外，多 肽适合于用作针对不受控制的出血，任选地在不患血友病的患者中的预防剂。如此，例如， 可以在手术前对在不受控制的出血上有风险的患者施用多肽。本文中所描述的多肽、材料、组合物、和方法意图为本发明的代表性例子，并且要 理解本发明的范围不受例子的范围限制。本领域技术人员会认可，可以用对所公开的多肽、 材料、组合物和方法的变型来实施本发明，并且认为此类变型在本发明的范围内。呈现上述例子来例示本文中所描述的发明，但是不应以任何方式解释为限制本发 明的范围。
实施例为了本发明可以得到更好的理解，列出了下列实施例。这些实施例仅是出于例示 目的，并且不要以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中所提及 的所有出版物。实施例1 计算机分析(in silico analysis)进行计算机分析以评估为了位点特异性聚合物偶联而有可能会成功用于半胱氨酸取代的位点的FIX残基。该分析聚焦于赖氨酸、苯丙氨酸、和亮氨酸残基，因为这些带电 荷的残基更通常是溶剂暴露的，而且因为在FVIII的情况中，这些残基是在变化为半胱氨 酸时最成功用于聚合物偶联的位点(参见例如美国公开文本号2006/0115876)。使用来自 FIX晶体结构的数据(Hopfner等，Structure 7 =989-996,1999)来测定FIX内的赖氨酸、 苯丙氨酸、和亮氨酸残基的溶剂暴露。其它有可能溶剂暴露的残基也认为是可能用于半胱 氨酸取代的位点。使用计算机算法i^oldX来预测每种残基突变为半胱氨酸对个别残基和 总体FIX蛋白质结构两者的自由能的影响。FoldX是一种凭经验的力场，其基于蛋白质工 程实验的结构-活性数据开发(Guerois 等，J. Mol. Biol. 320 =369-387,2002 ；Schymkowitz 等，Nucleic Acids Res. 33 :W382_388，2005 ；Schymkowitz 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 :10147-10152,2005)。具有 Lys, Phe、或 Leu 单突变为 Cys 的 FIXa 具有范围为 23. 3 至27. Ikcal/摩尔的稳定性能量，其中平均值为24. 9kcal/摩尔。与具有能量范围-2. 82 至-0. 39kcal/摩尔(其中平均值为-0. 30kcal/摩尔)的野生型结构的相比，由突变残基 对蛋白质稳定性贡献的能量范围是-0. 76至1. 63kcal/摩尔，其中平均值为0. 56kcal/摩 尔。认为突变成半胱氨酸后导致自由能降低或自由能很小变化的残基是更有利的。认为那 些导致自由能升高的半胱氨酸突变(较小的负值)是较不有利的。为了在凝固级联中发挥功能，FIX蛋白应当与FVIIIa相互作用。因此，不牵涉与 FVIIIa相互作用的FIX残基是用半胱氨酸替换的良好候选物，因为此位点处单独的突变 或聚合物的偶联可能不干扰与FVIIIa的相互作用。已经使用FMa结构(IRFN)、FVIIIa 的同源性模型、和蛋白质-蛋白质停靠工具来对FVIIIa-FMa复合物建立模型(Autin等， J. Thromb. Haemost. 3 =2044-2056,2005)。10种代表性模型中，基于与由实验数据提示的 所有主要接触一致，认为两种复合物(T4和仍)是最好的模型。T5模型是此分析中使用的 复合物。认为基于此模型预测离与FVIIIa的界面远于8A的FIX残基是有利的。FIX中导 致患者中的血友病B的天然存在取代突变(但不是导致终止密码子或移码的突变)提示 这些特定的残基对于FIX的功能是重要的。使用血友病B突变数据库(于kcl. ac. uk/ip/ petergreen/haemBdatabase. html可获得)来鉴定此类突变，并排除诸如突变为半胱氨酸 的候选物的残基，如表1中所指明的。表权利要求
1.因子IX多肽，其包含至少一处选自R338A和V86A的突变和至少一处选自下组的半 胱氨酸取代:T148C、V153C、T163C、L165C、N167C、T169C、T172C、F175C、K201C、KM7C、K413C、 L414C、和 1"415(。
2.权利要求1的因子IX多肽，其包含突变R338A和V86A。
3.权利要求1或2的因子IX多肽，其中所述至少一个取代的半胱氨酸是与生物相容性 聚合物偶联的(conjugate)。
4.权利要求3的因子IX多肽，其中所述生物相容性聚合物选自下组聚(亚烷基二 醇)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰 胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚唾液酸、羟乙 基淀粉(HEQ、聚环氧乙烷、烷基-聚环氧乙烷、双聚环氧乙烷、和右旋糖苷(dextran)。
5.权利要求4的因子IX多肽，其中所述聚(亚烷基二醇)是聚乙二醇。
6.权利要求4的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇是线性的或分支的。
7.权利要求5或6的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇具有范围为3，000道尔顿至 150，000道尔顿的名义平均分子量。
8.权利要求5或6的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇具有范围为5，000道尔顿至 85，000道尔顿的名义平均分子量。
9.权利要求3至8中任一项的因子IX多肽，其中相对于未偶联的多肽，与所述聚合物 的偶联将所述多肽的血清半衰期增加至少30%。
10.权利要求1至9中任一项的因子IX多肽，其中所述多肽具有每mg多肽至少100个 单位的比活。
11.因子1父多肽，其包含1169(、1(201(、1(247(、或1^414(取代。
12.权利要求11的因子IX多肽，其进一步包含至少一处选自R338A和V86A的突变。
13.权利要求11或12的因子IX多肽，其包含突变R338A和V86A。
14.权利要求11至13中任一项的因子IX多肽，其中选自第169位、第201位、第247 位、和第414位的半胱氨酸残基是与生物相容性聚合物偶联的。
15.权利要求14的因子IX多肽，其中所述生物相容性聚合物选自下组聚(亚烷基二 醇)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰 胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚唾液酸、羟乙 基淀粉(HEQ、聚环氧乙烷、烷基-聚环氧乙烷、双聚环氧乙烷、和右旋糖苷。
16.权利要求15的因子IX多肽，其中所述聚(亚烷基二醇)是聚乙二醇。
17.权利要求15的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇是线性的或分支的。
18.权利要求16或17的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇具有范围为3，000道尔顿至 150，000道尔顿的名义平均分子量。
19.权利要求16或17的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇具有范围为5，000道尔顿至 85，000道尔顿的名义平均分子量。
20.权利要求14至19中任一项的因子IX多肽，其中相对于未偶联的多肽，与所述聚合 物的偶联将所述多肽的血清半衰期增加至少30%。
21.权利要求11至19中任一项的因子IX多肽，其中所述多肽具有每mg多肽至少100 个单位的比活。
22.因子IX多肽，其包含氨基酸残基160-164之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。
23.权利要求22的因子IX多肽，其包含在氨基酸残基160-161之间、氨基酸残基 161-162之间、氨基酸残基162-163之间、和氨基酸残基163-164之间引入的1_5个半胱氨酸氨基酸。
24.权利要求22或23的因子IX多肽，其进一步包括至少一处选自R338A和V86A的突变。
25.权利要求M的因子IX多肽，其包含突变R338A和V86A。
26.权利要求22至25中任一项的因子IX多肽，其中所述至少一个取代的半胱氨酸是 与生物相容性聚合物偶联的。
27.权利要求沈的因子IX多肽，其中所述生物相容性聚合物选自下组聚(亚烷基二 醇)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰 胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸入聚(乙烯醇)、聚唾液酸、羟乙 基淀粉(HEQ、聚环氧乙烷、烷基-聚环氧乙烷、双聚环氧乙烷、和右旋糖苷。
28.权利要求27的因子IX多肽，其中所述聚(亚烷基二醇)是聚乙二醇。
29.权利要求观的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇是线性的或分支的。
30.权利要求观或四的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇具有范围为3，000道尔顿至 150，000道尔顿的名义平均分子量。
31.权利要求观或四的因子IX多肽，其中所述聚乙二醇具有范围为5，000道尔顿至 85，000道尔顿的名义平均分子量。
32.权利要求沈至31中任一项的因子IX多肽，其中相对于未偶联的多肽，与所述聚合 物的偶联将所述多肽的血清半衰期增加至少30%。
33.权利要求22至32中任一项的因子IX多肽，其中所述多肽具有每mg多肽至少100 个单位的比活。
34.一种药物制剂，其包含权利要求1-33中任一项的因子IX多肽和药学可接受赋形剂。
35.一种治疗血友病B的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的权利要求 34的药物制剂。
36.权利要求35的方法，其中静脉内、皮内、肌肉内、或皮下施用所述药物制剂。
37.编码权利要求1-33中任一项的多肽的DNA序列。
38.一种真核宿主细胞，其以容许所述宿主细胞表达因子IX多肽的方式用依照权利要 求37的DNA序列转染。
全文摘要
本发明涉及经修饰的因子IX多肽，诸如具有一个或多个引入的半胱氨酸位点的因子IX多肽。可以将经修饰的因子IX多肽与生物相容性聚合物偶联。本发明还涉及生成经修饰的因子IX多肽的方法，和使用经修饰的因子IX多肽例如来治疗罹患血友病B的患者的方法。
文档编号A61K38/48GK102065887SQ200980122785
公开日2011年5月18日 申请日期2009年4月15日 优先权日2008年4月16日
发明者戴维·基夫利科, 约翰·E·墨菲, 艾伦·R·布鲁克斯, 蒋晓乔, 钱德拉·帕特尔, 马里安·塞托 申请人:拜耳医药保健有限公司