用于高效基因组编辑的rna分子的设计、合成及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及基因工程及核酸检测领域。具体地说，本发明涉及可用病毒、微生物、 动植物等生物核酸序列的基因组编辑方法及用途。
【背景技术】：
[0002] 基因定点修饰一直是研究基因功能的重要手段之一，它也被用于人类遗传性疾病 的治疗中，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于同源重组的基因打 靶技术效率极低，应用受到限制。
[0003] 锌指核酸酶（ZFN的）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENS)的出现让科学家 们可以高效地进行基因定点修饰，被应用于斑马鱼、小鼠、大鼠、猪等动物模型中，实验证明 它们可以高效准确地对基因进行定点修饰。但是这两种技术所需的核酸序列，合成方法麻 烦，成本昂贵，无法进行大规模基因筛选。
[0004] 2013年初，在原核生物中，CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshort palindromicrepealsandCRISPRassociated)最新进展为基因定点修饰提供了一种制作 简单、成本低廉、作用高效的方法。该系统在细菌和古细菌中用于降解入侵的病毒和质粒， 防止本体收到外来遗传物质的损害。CRISPR/Cas系统一共分为三种类型，Cas9属于研究相 对清楚的II型系统，研究证实在原核生物中，Cas9需要同两种小RNA(crRNA、tracrRNA)结 合对外源核酸进行识别，直接剪切以达到保护自身的目的。科学家们为了能够便于操作、简 化实验体系，将crRNA和tracrRNA融合成一条相对较长的gRNA，实验证明，在哺乳动物细胞 内，Cas9由gRNA引导，可以对靶DNA进行剪切。
[0005] 现有技术存在的问题：现有的Cas9/gRNA对靶基因的切割效率较低，一般在5%~ 30%之间，应用会受到一定的限制。因此，开发新的gRNA，就成为本领域迫切需要解决的一 个技术问题。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的正是为了解决上述问题，希望通过对gRNA的结构进行一些改进，提 高Cas9/gRNA系统对靶向基因的切割效率。
[0007] 本发明所称的"靶序列"是指gRNA5'端的20~24碱基的序列，这段序列与目的 DNA序列相同，gRNA需这段序列与目的DNA结合，cas9/gRNA复合体对目的DNA进行剪切。
[0008] 本发明所称的"RNA二级结构"是指通过使用核酸二级结构预测软件 RNAfold(Mathews等人（2004)，网址http: //rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold. cgi)预测得到的RNA二级结构。
[0009] 本发明所称的"基因组编辑"是指对生物的基因组DNA进行删除、插入或者替换， 从而达到对目的序列修改的目的。
[0010] 本发明采用的技术方案如下：
[0011] 本发明中设计针对HHB基因序列设计合成gRNA，采用的实验方法是国际上比较常 用的突光素酶单链重组退火实验（luciferasesingle-strandannealingrecombination assay，SSA)，和用来检测内源基因非同源重组检测效率的方法-SURVEYOR实验。实验原理 如附图1、2所示。
[0012]gRNA是一个含有96碱基的RNA，如果用随机合成的方法进行筛选，将会有496种可 能，筛选工作量过于庞大，无法进行。所以本发明中着眼于gRNA的第一个发卡结果进行筛 选，利用质粒不相容这一性质进行筛选。具体步骤如图1所示。该方法首先建立筛选体系， 然后从第一个发卡结构中按顺序选取4个碱基合成NNNN的随机序列建立gRNA库，将cas9 表达质粒和gRNA表达质粒与报告质粒一起共转化进大肠杆菌，在其中挑选阳性克隆扩增， 最后与报告质粒再次共转化进行验证。我们设计的上述新方法使得筛选实验的实验量大大 减小，从而使得从大量可能的组合中挑选出有效的新型gRNA变得可行。
[0013] 使用上述方法，我们从上千种gRNA中挑选出了 10种最优选的增强cas9/gRNA效 果的gRNA，并且根据实验结果合理概括出效果较好的gRNA结构。同时我们对现有的gRNA 的结构进行修改测试。
【附图说明】
[0014] 图1筛选实验流程示意图。我们将cas9和gRNA构建到同一个载体上，再通过共转 化的方法，将其和报告基因的载体共转化到同一个大肠杆菌内，有效果的gRNA会和cas9形 成复合体将含有报告基因载体上的靶序列剪切，此时会发生荧光素酶单链重组退火反应， 报告基因会表达。我们经过挑选报告基因表达的克隆来选取有效果的gRNA。为了进行大规 模筛选，我们将gRNA库构建到载体上进行筛选，从中挑取阳性克隆，提取gRNA质粒，再进行 下游重新验证。
[0015]图 2 突光素酶单链重组退火实验（luciferasesingle-strandannealing recombinationassay，SSA)原理图：首先，把突光素酶基因进行改造。在突光素酶基因中间 加入终止密码子和靶基因序列；随后通过分子生物学手段再紧接上另外一段荧光素酶基因 序列，图中浅灰色区域的序列（约800bp)相同。当gRNA有效果时，Cas9/gRNA复合体会在 靶序列位置把双链DNA剪切形成一个双链的DNA断裂，由于两个浅灰色区域序列（即图1中 "终止密码子"左侧的一段基因和"靶序列"右侧的一段基因）相同，此时会发生同源重组， 就形成了一个有活性的荧光素酶报告基因，实验中可以测量荧光素酶的表达来检测TALEN 的效果的强弱。
[0016] 图3SURVEY0R原理图：首先用PCR的方法把目的基因片段从基因组上扩增出来。 其中包括发生缺失和没有产生变化的序列。然后把扩增出来的片段在体外进行重新退火， 此时发生缺失的片段和没有产生变化的序列会退火形成有部分不配对的双链结构。接下来 用SURVEYOR酶进行酶切实验，这种酶可以识别不配对的区域进行酶切。我们可以通过跑胶 检测图中a、b、c的含量来检测发生缺失的效率，从而得出TALEN的作用效果。
[0017] 图4gRNA修改1序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由 G变为U，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA略有下降。
[0018] 图5gRNA修改2序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由 G的配对序列由U突变为C，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA 基本不变。
[0019] 图6gRNA修改3序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由 G的配对序列由U突变为A，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。
[0020] 图7gRNA修改4序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由 G突变为A，它的配对序列由U突变为A，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活 性。
[0021] 图8gRNA修改5序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由 G突变为U，它的配对序列由U突变为G，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活 性。
[0022] 图9gRNA修改6序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第3、4、5个碱 基由UUU突变为GCG，它们的配对序列由AAA突变为CGC，SSA结果和SURVEYOR结果显示， cas9没有剪切活性。
[0023] 图IOgRNA修改7序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第3个碱基 U配对序列由A突变为C，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。
[0024] 图IlgRNA修改8序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第3、4、5个 碱基由UUU变为UU，它们的配对序列AAA变为AA，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没 有剪切活性。
[0025] 图12gRNA修改9序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第7、8、9个 碱基由GAG变为ACU，他们的互补序列变为⑶C，将泡补齐，SSA结果和SURVEYOR结果显示， cas9没有剪切活性。
[0026] 图13gRNA修改10序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第8个碱基 由A变为AAG，第21、22、23个碱基由AAG变为A，将泡方向改变，SSA结果和SURVEYOR结果 显示，cas9没有剪切活性。
[0027] 图14gRNA修改11序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第21个碱基 A去掉，减少泡3'端的大小，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA 有下降。
[0028] 图15gRNA修改12序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第21、22个 碱基AA去掉，减少泡3'端的大小，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始 gRNA有下降。
[0029] 图16gRNA修改13序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第8个碱基 A去掉，减少泡5'端的大小，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA 下降很明显。
[0030] 图17gRNA修改14序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第8个碱基 由A突变为G，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA有所升高。
[0031] 图18gRNAl序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0032] 图19gRNA2序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0033] 图20gRNA3序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0034] 图21gRNA4序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0035] 图22gRNA5序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0036] 图23gRNA6序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0037] 图24gRNA7序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0038] 图25gRNA8序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0039] 图26gRNA9序列及SSA和SURVEYOR实验结果
[0040] 图27gRNA10序列及SSA和SURVEYOR实验结果
【具体实施方式】
[0041] 以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本 发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。实施例中使用的 gRNA碱基序列、被上述gRNA识别的目标DNA中的片段的序列、以及cas9的氨基酸序列如 附录所示。附录中列出了 3组gRNA碱基序列和能被上述gRNA识别的DNA序列，实验中使 用的gRNA碱基序列和对应的被gRNA识别的DNA序列是同一组的，但是并不限于某一个特 定的组。在实际应用的时候，一般是知道目标DNA序列后，选取目标DNA序列中的一段作为 gRNA的识别位点，然