一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因转录调控研究领域，具体涉及一种利用基因组编辑技术实现原位 激活基因的表达方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 基因的表达调控受到多个层次的调控，包括转录水平和转录后水平，对于编码基 因还包括翻译水平和翻译后水平的调控等等。
[0003] 不同的基因在表达的时候也受到不同形式的调控。在研究基因功能时常通过功能 缺失实验（loss of function)和功能获得实验（gain of function)两种方式来实现对基 因功能的研究。其中功能缺失实验常用的方式有RNA干扰技术（RNAi Interference，RNAi) 等技术实现对靶标基因表达的下调，而功能获得实验常用的方式利用表达载体表达基因的 cDNA序列实现基因广物的过表达。
[0004] 表达载体是一种可以在原核生物和真核生物细胞中外源表达蛋白或者RNA的一 种环形双链DNA分子，被广泛应用于研究蛋白、RNA等生物大分子在细胞生命活动中的作 用。按照应用的宿主不同可分成原核表达载体和真核表达载体。常见的原核表达载体有 pET系列、pQE系统、pGEX系列、pMAL系列等多种。而真核表达载体则根据适用的物种不同 分酵母表达载体，植物表达载体和真核哺乳动物载体等多种。
[0005] 在目前的研究中，研究者通常将基因的cDNA序列克隆到表达载体中进行过表达， 实现功能过表达。此种方式已用于外源过表达蛋白编码基因基因和外源表达microRNA 等。虽然此种方式已发展成熟，但实际操作过程中经常会遇到很多问题，如不能反内源的 应基因表达环境，表达产物不能实现正常定位等等。特别是近年来有关长非编RNA (long noncodingRNA，IncRNA)的研究让人们进一步意识到这种表达方式存在的不足。
[0006] 长非编码RNA (long noncoding RNAs，IncRNAs)是一类存在于细胞中，长度大于 200nt且不编码蛋白质产物或者编码不具有功能的蛋白质产物的RNA分子。已有的研究已 发现了多种类型的IncRNAs，且IncRNAs可通过参与染色质重塑，染色质高级结构维持等多 种方式参与基因表达调控，同时还可参与细胞核内亚核结构的形成等等。
[0007] 人们发现用传统的表达载体进行IncRNAs的过表达时，过表达的RNA往往不能实 现正确的亚细胞定位。这有可能是由于过表达cDNA序列时，过表达的RNA无需经过类似于 内源基因的RNA加工（RNA processing)过程，如剪接（splicing);同时表达成熟的IncRNA 也与外源表达的蛋白质不同，其分子上可能不具有特殊的细胞内不同位置的定位信号等 等。因此，一种类似内源表达的方式实现对靶基因的过表达对于研究IncRNA的功能具有十 分重要的作用。
[0008] CCAT1-L是一条在结肠癌中高表达的长非编码RNA。原位杂交实验结果显示 CCAT1-L分布在细胞核中，呈点状分布（如图FiglA)，并聚集在其转录位点附近(如图 FiglB)。功能获得实验对于研究CCAT1-L的生物学功能具有十分重要的作用。然而，利用传 统的载体过表达IncRNAs的实验结果显示，利用外源载体过表达的CCAT1-L分布在整个细 胞中，即在细胞核和细胞浆中都有分布（如图FiglC)。这说明传统方式过表达的CCAT1-L 无法模拟内源RNA的定位情况，即无法正确发挥该RNA的生物学功能。利用此种方式过表达 CCAT1-L可能导致获得不正确甚至错误的实验结果。因此，一种可以模拟细胞内源CCAT1-L 过表达的实验方法对于研究其功能具有重要的意义。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用基因组编辑技术实现原位 激活基因的表达系统及其应用，尤其是利用基因组编辑技术实现原位激活长非编码RNA基 因的表达方法及其应用。
[0010] 本发明首先公开了一种原位激活长非编码RNA基因的表达方法，为：通过同源重 组技术，在受体的靶基因启动子之后，靶基因的基因序列之前，插入一个第二启动子及筛选 标记基因，并通过筛选标记筛选获得阳性结果。
[0011] 所述阳性结果为筛选获得的阳性细胞，可培养所述阳性细胞以原位激活所述长非 编码RNA基因的表达。
[0012] 所述原位激活长非编码RNA基因的表达，是指激活的长非编码RNA基因的表达与 内源长非编码RNA基因的表达定位一致，可以更进一步的模拟内源长非编码RNA的功能。
[0013] 所述靶基因即为待激活的长非编码RNA基因，具体的，如CCAT1-L。
[0014] 进一步扩展的，所述长非编码RNA基因也可以为编码基因，靶基因即为待激活的 编码基因。
[0015] 具体的，本发明的原位激活长非编码RNA基因的表达方法包括下列步骤：
[0016] 1)构建特异识别靶序列TALEN质粒；
[0017] 2)设计并构建Donor质粒，所述Donor质粒的左右同源臂之间包括顺序串联的第 二启动子及筛选标记基因；
[0018] 3)将步骤1)和2)构建的TALEN质粒和Donor质粒转入受体细胞，通过同源重组 对受体细胞进行基因组改造，培养受体细胞并根据筛选标记筛选获得阳性结果并验证。 [0019] 步骤1)中，所述TALEN质粒所针对的靶位点位于靶基因的启动子与其基因起始序 列之间。所述TALEN质粒不应破坏受体基因组中靶基因的启动子及其基因。
[0020] 步骤2)中，所述Donor质粒对应的同源重组靶序列位于靶基因的启动子与其基因 起始序列之间。所述Donor质粒能保证同源重组后，插入的启动子、筛选标记基因、及靶基 因读框正确。
[0021] 所述第二启动子可选自CMV启动子、EFlalpha启动子等。所述筛选标记基因可以 为抗性基因和荧光蛋白标记基因。所述抗性基因如puromycin (嘌呤毒素）抗性基因或者 blasticidin (杀稻瘟素）抗性基因等。所述荧光蛋白标记基因如EGFP、YFP荧光蛋白标记 基因等。
[0022] 进一步的，所述Donor质粒的左右同源臂之间，筛选标记基因之后，还顺序插入有 终止序列及可诱导的启动子。该设计可实现靶基因可诱导地过表达。
[0023] 具体的，所述终止序列可为BGH和SV40两种终止序列。该设计可完全终止第二启 动子驱动的转录。所述可诱导的启动子可为Ptight启动子。
[0024] 当插入可诱导启动子时，可培养所述阳性细胞并诱导所述长非编码RNA基因的表 达。
[0025] 如本发明具体实施例列举的，所述Donor质粒的左右同源臂之间包括顺序串联的 CMV启动子、puromycin抗性基因和EGFP荧光蛋白标记基因。
[0026] 进一步优选的，所述puromycin抗性基因和EGFP突光蛋白标记基因之间还插入有 T2A序列。
[0027] 为进一步实现靶基因可诱导的过表达，所述左右同源臂之间，EGFP荧光蛋白标记 基因之后还顺序插入有BGH和SV40两种终止序列以及Ptight启动子。
[0028] 步骤3)中，对阳性结果的验证方法可以选自qPCR、Northernblot、RNA突光原位杂 交实验、以及RNA/DNA双荧光原位杂交实验。
[0029] 本发明所述的原位激活长非编码RNA基因的表达方法，也可作为一种过表达长非 编码RNA基因，以模拟内源RNA的正确定位情况，以研究RNA功能的实验方法。
[0030] 本发明所述的表达方法可用于原位激活长非编码RNA基因的过表达，从而应用于 LncRNA的功能研究领域。所述长非编码RNA基因的过表达能实现正确的亚细胞定位。
[0031] 本发明所述的表达方法同样可扩增应用于原位激活编码基因的过表达，从而应用 于编码基因的功能研究领域。
[0032] 本发明的有益效果：本发明在国际上首次实现靶基因的原位激活，为过表达包括 长非编码RNA在内的基因和研究其功能提供了新的方法和思路。
【附图说明】
[0033] 图1A:野生型RNA荧光原位杂交结果
[0034] 图1B :野生型内源CCAT1-L RNA/DNA双荧光原位杂交结果
[0035] 图1C:传统质粒过表达CCAT1-L原位杂交结果
[0036] 图2A:实施例1构建的Donor质粒结构示意图
[0037] 图2B :实施例1基因组编辑PCR验证结果
[0038] 图2C :实施例1过表达RNA RT-qPCR验证结果。WT代表野生型，1-4代表各突变 型。
[0039] 图2D :实施例1Northernblot验证试验结果
[0040] 图2E:实施例1RNA荧光原位杂交实验（RNA FISH)验证结果
[0041] 图2F:实施例1RNA/DNA双荧光原位杂交实验（RNA/DNA double FISH)验证结果
[0042] 图3A:实施例2构建的Donor质粒结构示意图
[0043] 图3B :实施例2基因组编辑PCR验证结果
[0044] 图3C :实施例2过表达RNA RT-qPCR验证结果。WT代表野生型，1-4代表各突变 型。
【具体实施方式】
[0045] 本发明的原位激活长非编码RNA基因的表达方法，主要通过同源重组技术，在受 体的靶基因启动子之后，靶基因的基因序列之前，插入一个第二启动子及筛选标记基因，从 而实现长非编码RNA基因的原