重组人乳头瘤病毒蛋白表达的制作方法
【技术领域】
[0001] 本领域涉及分子生物学领域，具体而言，本发明涉及经密码子优化而适于在毕赤 酵母中表达的各种人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，以及含有该人乳头瘤病毒主要 衣壳蛋白L1基因的载体，菌株，表达该基因的方法，及其用途。
【背景技术】
[0002] 人乳头状瘤病毒（human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的 一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者 的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。1995年，国际癌症 研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成 为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和 HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。
[0003] 目前已经确定的HPV型超过100种。采用灵敏的检测方法，可以从几乎100%的宫 颈癌患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将 HPV分为低危型和高危型。即￥6、11、34、40、42等型多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈 上皮轻度不典型性增生病变中，属HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以 HPV16、18、31、33、35、39、45,52,58型感染更为多见，这些亚型为高危型。不同人群中一系 列的研究已证实生殖道的HPV16U8型感染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更 密切。宫颈癌患者中，约50-60%是由HPV16感染引起，HPV18约占14%，HPV45占约8%， HPV31 占约 5%，其余型占 23% (Walboomers JM.et al.J Patholl999;189:12-19)。根据 2010年世界卫生组织WHO的报告，HPV58是中国大陆地区宫颈癌中HPV检测率第3位的高危 型别，发生率为11.7%，属于在中国发生率较高的HPV亚型（China Human Papillomavirus and Related Cancers, Fact Sheet2010, WHO / ICO Information Centre on HPV and CervicalCancer, Sep 15,2010)〇
[0004] 宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被 诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10. 5%。早在80年代初， Harald zur Hausen就发现人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV)的感染与宫颈癌 发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止， 已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可以感染生殖道粘膜。一个正常妇女一生中宫颈 至少感染一种HPV的终生累计概率约为40 %。
[0005] 国内目前尚无系统的尖锐湿疣和HPV相关调查，但是各地区的分别调查基本可以 说明HPV6、11在尖锐湿疣中的重要作用。近期的深圳地区的流行病学调查结果显示HPV6、 11型感染者在尖锐湿疣患者中约占80% (数据来源：深圳市人民医院352例尖锐湿疣患 者生殖道人乳头状瘤病毒基因亚型的分布及意义，唐敏；戴勇；吕晓萍；李体远；第三军医 大学学报，2007年21期）；临沂地区的调查结果HPV6、11型感染者在尖锐湿疣患者中占 85. 19%，（数据来源：108例尖锐湿疣患者HPV的基因分型及临床分析，熊瑛；社区医学杂 志，2007年17期）。
[0006] HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约 7200_8000bp，由早期编码区（early region)、晚期编码区（late region)和位于两者之间 的长调控区（long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框（0RF)，编码 病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支 撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。 L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。
[0007] 昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都 可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒（VLP)。L1 单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高 效价病毒中和抗体应答。
[0008] 因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，以 L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病毒蛋白得到 的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技 术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病 毒等表达系统中，往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低 甚至无表达。如Merck公司的美国专利No. 7,498,036中记载，野生型VLP蛋白在酿酒酵母 中的表达量为35 yg / mg (破菌上清液中的VLP /破菌上清液总蛋白）左右。
[0009] 因此，本领域中需要一种高水平表达基因的方法，所述方法应该能够高水平地、操 作简便和低成本地表达HPV基因。
【发明内容】
[0010] 为了解决上述技术问题，根据本发明的第一方面，提供了一种能够在毕赤酵母中 表达的 HPV 基因，所述基因具有 SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7，SEQID N0:8，SEQ ID N0:9 或 SEQID N0:10所示的核苷酸序列。
[0011] 利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统，具有表达量高、操作简便、成本低等 特点，并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于 不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候，往往根据 目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此，本发明 的经过密码子优化后的HPV基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平，更有利于针对 HPV的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示，本发明的密码子优化过的HPV6， 11，16，18,58基因在毕赤酵母中的表达量分别可最高达约134iig / mg，123iig / mg, 135iig / mg, 125iig / mg和132iig / mg(破菌上清液中的VLP /破菌上清液总蛋白）。
[0012] 根据本发明的第二方面，提供了一种在毕赤酵母中表达HPV L1基因的方法，包括 下述步骤：
[0013] (1)将本发明的HPV L1基因分别各自克隆入表达载体中；
[0014] (2)将步骤（1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中；
[0015] (3)使用抗生素对步骤（2)所得的转化菌株进行筛选，获得生长情况最好的一个 或多个菌株；
[0016] (4)通过测试各HPV L1基因的表达量对步骤（3)所得的菌株进行进一步筛选，获 得表达量最高的一个或多个菌株；
[0017] (5)使用步骤（4)所得的菌株进行表达，分别获得HPV L1蛋白。
[0018] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤（1)中所述的表达载体为pPICZaB载 体，并且所述步骤（3)中使用的抗生素为Zeocin。。
[0019] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤（2)中使用的毕赤酵母菌株为毕赤酵 母X-33菌株。
[0020] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤（4)中测试HPV L1基因的表达量的操 作是通过Western blot方法进行的。
[0021] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤（5)中的表达步骤为在发酵罐中进行 的发酵步骤。
[0022] 根据本发明的第三方面，提供了含有本发明的各HPV L1基因的表达载体。
[0023] 根据本发明的一个具体实施方案，所述含有本发明的各HPV L1基因的表达载体来 源于pPICZaB载体。
[0024] 根据本发明的第四方面，提供了含有本发明的HPV L1基因或表达载体的毕赤酵母 菌株，所述菌株能够高水平地表达生产各HPV L1蛋白，更利于针对HPV的预防性疫苗的研 发与生产。
【附图说明】
[0025] 图1显示了 HPV6L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1 :DL5000DNAMarker(Takara公 司）；2 :BstBI+KpnI 双酶切 pPICZ a B-6L1 样品 1 ;3 :BstBI+KpnI 双酶切 pPICZ a B-6L1 样 品2。
[0026] 图2显示了 HPV11L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1 :DL5000DNA Marker(Takara 公司）；2 :BstBI+KpnI 双酶切 pPICZa B-11L1 样品 1。
[0027] 图3显示了 HPV16L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1 :DL5000DNA Marker(Takara 公司）；2 :pPICZ a B-16L1 样品 1 ;3 :pPICZ a B-16L1 样品 2 ;4 :BstBI+KpnI 双酶切 pPICZ a B-16L1 样品 1 ;BstBI+KpnI 双酶切 pPICZ a B-16L1 样品 2。
[0028] 图4显示了HPV18L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1 :DL5000DNA Marker(Takara 公司）；2 :BstBI+KpnI双酶切pPICZa B-18L1样品。
[0029] 图5显示了 HPV58L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1 :BstBI+KpnI双酶切 pPICZ a B-58L1 样品；2:DL5000DNAMarker (Takara公司）。
[0030] 图6显示了破菌后的HPV6L1上清液Western-blot鉴定。1-8 :重组表达菌株；9: PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 :空宿主菌。
[0031] 图7显示了破菌后的HPV11L1上清液Western-blot鉴定。1-8 :重组表达菌株；9: PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 :空宿主菌。
[0032] 图8显示了破菌后的HPV16L1上清液Western-blot鉴定。1-8 :重组表达菌株；9: PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 :空宿主菌。
[0033] 图 9 显示了破菌后的HPV18L1上清液Western-blot鉴定。1 :PageRuler Prestained Protein Ladder ;2_1