红花myb12基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物工程领域，具体涉及红花的MYB12基因及其在培育高黄酮含量的转 基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002] mCarthamustinctoriush.、%一年生草本植物，为菊科、红花属植物。红花 黄色素（safflor yellow)作为其主要有效成分，是从其干燥管状花中分离的水溶性查尔酮 的混合物，具有活血化瘀，通脉止痛等功效，被广泛应用在冠心病、高血压、脑梗塞、抗肿瘤、 糖尿病并发症、慢性肾病等疾病上。可见，红花黄色素是一种极具潜力的天然药物。虽然红 花的种植面积在我国不断扩大，但仍未能解决红花黄色素资源匮乏问题。提高红花自身黄 色素含量，培育高产黄色素的红花新品系，具有重要经济意义。
[0003] 红花黄色素属于植物次生代谢产物黄酮类化合物。在植物次生代谢中，黄酮类的 生物合成是目前研宄最为深入的次生代谢途径。植物黄酮类生物合成途径主要由两类基因 控制：结构基因和调苄基因。其中，结构基因直接编码与黄酮类次生代谢生物合成有关的 各种酶类，而调苄基因则是控制结构基因表达强度和表达方式的一类基因，包括MYB、NAC、 WARY等。目前，与黄酮类生物合成的主要结构基因和调苄基因在多种植物中被克隆。尽管 已有学者利用转基因技术，将控制黄酮类次生代谢的关键酶基因或其反义序列导入植物， 通过促进或抑制该基因的表达，改变了黄酮类次生代谢途径，然而植物类黄酮生物合成途 径是非常复杂的，涉及到的酶种类繁多，有时并不是一两个关键酶所能控制。这种方法不能 诱导整个代谢通路表达，只可以获得某一产物表达量的增高，但这远远达不到实际应用的 需求，而通过转录因子作用，可以直接激活整个代谢通路，有可能激活类黄酮次生代谢途径 中多个结构基因的表达，达到的效果将比导入某个结构基因的作用更明显。
[0004] MYB蛋白作为调控因子，参与黄酮类化合物生物合成并发挥重要的作用，是目前植 物黄酮类化合物代谢分子生物学领域研宄的热点之一。其中的R2R3类MYB蛋白在植物花 色形成以及类黄酮代谢的调控起到重要的作用。Sitakanta Pattanaik等在烟草中分离到 了一个R2R3类的MYB基因NtAN2,它是在花瓣中特异表达的。NtAN2基因在烟草和拟南芥 中表达后，类黄酮代谢途径中的上下游相关基因都上调表达，而在烟草中用RNAi技术抑制 NtAN2的表达后，得到的是开白花的烟草，类黄酮代谢途径中下游基因的表达都受到了抑 制。然而，有关调控黄酮代谢的红花MYB的研宄还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为提高植物中黄酮化合物含量，而提供一种红花MYB基因。
[0006] 红花MYB基因，其碱基序列如核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 红花MYB基因，它是将塔城红花花瓣中的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用 引物： CtMYB12-l ：ATGAAGGAGCGTCAACG CtMYB12-2 ：TTAACTCAACCCATGATGATG 进行PCR扩增获得。
[0008] -种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示的基 因； 所述的植物表达载体为pBASTA。
[0009] 红花MYB基因在培育高黄酮含量的转基因植物中的应用； 所述的植物为红花或拟南芥。
[0010] 本发明提供了一个红花MYB基因，具有转录调控基因表达特性，通过转录调节黄 酮代谢相关基因的表达，能够提高红花中总黄酮的含量，为培育高黄酮含量新品系奠定了 坚实的基础。
【附图说明】
[0011] 图1通过RT-PCR扩增出798bp的含有起始密码子的片段（图1A)，回收后的片段连 接到pEASY-Tl上，进一步通过菌液PCR (图1B)和沉况1和班III酶切鉴定（图1C); 图 2 为 3' RACE ; 图3红花MYB全长基因电泳图； 图4 pBASTA载体图谱； 图5 MYB12基因的原核表达电泳图； 图 6 pBASTA-MYB12 菌液 PCR 验证； 图7 pBASTA-MYB12重组子酶切验证； 图8转基因拟南芥中黄酮含量测定。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1红花（toritts L )花辦RNA提取及cDNA合成 用TRIZOL Plus提取塔城红花花瓣RNA，取1 y g总RNA反转录为cDNA模板。
[0013] 实施例2 MYB基因的序列片段的验证 根据本实验室红花454测序结果中挑选的候选基因，设计特异性引物(表1)，验证基因 片段。根据验证的MYB的基因片段，设计引物(表1)进行基因片段克隆。根据红花454测序 结果拼接比对，获得了 MYB基因的序列片段，通过RT-PCR扩增出798bp的含有起始密码子 的片段（图1A)，RT-PCR反应体系见表2。回收后的片段连接到pEASY-Tl(北京全式金生 物技术有限公司）上，进一步通过菌液PCR (图1B)和沉况I和"i/?d III酶切鉴定（图1C)， 测序结果正确。
[0014]
【主权项】
1.红花MYB基因，其碱基序列如核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.红花MYB基因，它是将塔城红花花瓣中的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用 引物： CtMYB12-1 ：ATGAAGGAGCGTCAACG CtMYB12-2 ：TTAACTCAACCCATGATGATG 进行PCR扩增获得。
3. -种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示的基因。
4. 根据权利要求3所述的一种表达载体，所述的植物表达载体为pBASTA。
5.红花MYB基因在培育高黄酮含量的转基因植物中的应用。
6. 权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的植物为红花或拟南芥。
【专利摘要】本发明公开了一个红花MYB基因，具有转录调控基因表达特性，通过转录调节黄酮代谢相关基因的表达，能够提高红花中总黄酮的含量，为培育高黄酮含量新品系奠定了坚实的基础。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-29, C12N15-82
【公开号】CN104845978
【申请号】CN201510255199
【发明人】官丽莉, 李海燕, 李校堃, 杨晶, 杜林娜, 王法微, 董园园
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月19日