田鼠巴贝虫Bm1524抗原及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种寄生虫田鼠巴贝虫，具体来说是一种田鼠巴 贝虫Bml524抗原及其应用。
【背景技术】
[0002] 1957年，南斯拉夫报道了首例人体巴贝虫病的确诊病例。随后，欧洲多个国家和 美国相继报道了多例人体巴贝虫病，亚洲的日本、中国大陆和台湾地区、非洲的南非和埃 及也出现了少量的病例。巴贝虫病是由寄生于脊椎动物红细胞的巴贝虫感染引起，是一 种由蜱传播的人兽共患病。目前，已被鉴定可导致人体巴贝虫病的巴贝虫，包括田鼠巴贝 虫（Babesia microti)和分歧巴贝虫（Babesia divergens)为主的等少数几种巴贝虫科 (Babesiidae)原虫。
[0003] 人一般通过带虫蜱的叮咬或临床输入无症状感染者所献血液导致感染。该病的临 床症状表现不一，多为无症状的隐性感染，少数病例以发热、溶血、贫血、脾肿大为主要临床 表现，脾切除、年老和免疫功能低下者易罹患严重感染，甚至发生死亡。
[0004] 统计表明：美国近20年，以田鼠巴贝虫为主的人体巴贝虫病呈暴发流行趋势。在 我国巴贝虫病属于新发寄生虫病，近年来，时有人体感染病例报道。临床医生由于缺乏相关 认知，该病易被忽视而导致严重后果。因此，建立快速、准确的诊断方法是预防和控制巴贝 虫病的重要手段。
[0005] 目前，田鼠巴贝虫病的诊断技术主要包括病原、分子生物学和免疫学诊断技术。病 原诊断包括血液涂片显微镜检查和动物接种分离技术。镜检仍是诊断田鼠巴贝虫病的金标 准，但在低密度原虫血症的情况下易漏诊。动物接种的方法敏感性高，但耗时（数周以上） 且昂贵，无法满足快速检测的需求。分子生物学技术是通过PCR方法扩增田鼠巴贝虫特异 性DNA片段，具有较高的敏感性和特异性，但对实验室设备技术要求较高，另外，对无症状 感染者有时也无法得出阳性结果。免疫学诊断技术中，间接免疫荧光试验作为目前唯一标 准化的田鼠巴贝虫检测方法，其应用受特殊设备和专业人员操作的限制。ELISA方法近年来 也被用于田鼠巴贝虫病的检测，其中，BmSAl是目前文献报道中诊断效果最好的抗原之一， 然而，其与恶性疟原虫存在一定的交叉反应。因此，寻找诊断效果更好的田鼠巴贝虫抗原是 提高ELISA检测效果的关键。
[0006] 对已报道的田鼠巴贝虫的诊断抗原进行生物信息学分析，发现大部分抗原具有 完整或不完整的串联重复多肽，并且为分泌性蛋白，即同时含有信号肽序列。如，BmP94、 BmIRA、BMNl-8、BmSAl、BMNl-17 和 BMN1-2 等抗原。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种田鼠巴贝虫Bml524抗原及其应用，所述的这种田鼠 巴贝虫Bml524抗原及其应用解决了现有技术中诊断田鼠巴贝虫疾病的抗原及方法灵敏度 不高的技术问题。
[0008] 本发明提供了一种分离的基因，其序列如SEQ ID NO :3所示。
[0009] 本发明还提供了一种田鼠巴贝虫Bml524抗原蛋白，由上述的分离的基因编码，其 氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0010] 本发明还提供了一种抗体，它特异性的结合上述的一种田鼠巴贝虫Bml524抗原 蛋白。
[0011] 进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。
[0012] 本发明还提供了一种载体，所述载体含有编码上述的一种田鼠巴贝虫Bml524抗 原的基因。
[0013] 本发明还提供了一种宿主细胞，所述的细胞含有上述的载体，或者所述的细胞用 编码上述的一种田鼠巴贝虫Bml524抗原的基因转化或转染。
[0014] 本发明还提供了一种疫苗，包括上述的一种分离的基因、或者上述的一种田鼠巴 贝虫Bml524抗原蛋白、或者上述的抗体、或者上述的载体。
[0015] 本发明还提供了上述的一种分离的基因在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病 的药物中的应用。
[0016] 本发明还提供了上述的田鼠巴贝虫Bml524抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防 田鼠巴贝虫病的药物中的应用。
[0017] 本发明还提供了上述的抗体在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的 应用。
[0018] 本发明还提供了上述的疫苗在制备治疗、或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应 用。
[0019] 本发明还提供了一种试剂盒，含上述的一种分离的基因、上述的田鼠巴贝虫 Bml524抗原蛋白、或者上述的抗体。
[0020] 本发明还提供了一种重组蛋白，含有SEQ ID N0 :14所示的氨基酸序列。
[0021] 进一步的，上述的一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :6或者SEQ ID N0 :8 所示。
[0022] 本发明还提供了一种胶体金免疫层析试条，含有上述的重组蛋白。
[0023] 本发明还提供了一种抗体，它特异性的结合上述的重组蛋白。
[0024] 本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的重组蛋白、或者上述的抗体。
[0025] 本文中的术语"载体"，是指本领域中常用的细菌质粒、酵母质粒及其它各种病毒 载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体（原核表达载体）、在酵 母中表达用的载体（如毕赤酵母载体）、在哺乳动物细胞中表达用的载体（逆转录病毒载 体、腺病毒载体等）。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技 术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合 适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可 用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。
[0026] 本发明的宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、哺乳动物 细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化 细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿 主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化 钙法、电穿孔法用于细菌细胞，脂质体包裹、电融合法用于哺乳动物细胞等真核细胞。
[0027] 本发明的宿主细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括 发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。 根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包 括但不限于：裂菌，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱，反向色谱，以及常规 的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。
[0028] 本发明以串联重复多肽和信号肽的双重特征，搜索红内期的田鼠巴贝虫转录组数 据；同时通过免疫学方法鉴定，发现了一个新的田鼠巴贝虫抗原一Bml524。本发明为田鼠巴 贝虫病的诊断提供了新技术和手段。通过田鼠巴贝虫Bml524抗原的表达纯化，已进一步建 立了高特异性和敏感性的田鼠巴贝虫病诊断方法；并易制备多/单克隆抗体，可应用于田 鼠巴贝虫的科研和防治等不同方面；本发明的疫苗具有预防田鼠巴贝虫感染的效果。本发 明的试剂盒和胶体金免疫层析试条还可以用来检测田鼠巴贝虫。
【附图说明】：
[0029] 图1为田鼠巴贝虫总RNA与mRNA的琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA标志物，1为总 RNA，2 为 mRNA〇
[0030] 图2为串联重复序列示意图，GEG为完全重复的序列。
[0031] 图3为信号肽预测结果。
[0032] 图4为Isotig01524的blastp序列比对分析图。
[0033] 图 5 为 Bml524 基因的 RTPCR 结果图，M :DNA Marker ;1-2 :RTPCR 产物。
[0034] 图6为pET28a_Bml524C Rosetta(DE3)重组蛋白的表达鉴定图。
[0035] 图7为pET28a-Bml524C Rosetta(DE3)重组蛋白变性方式纯化12%聚丙烯酰胺凝 胶电泳图。
[0036] 图8为pET28a-Bml524S BL21 (DE3)重组蛋白的表达鉴定图。
[0037] 图9是pET28a-Bml524S BL21