用于区分和检测牛梨形虫的试剂盒及制备与使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种动物寄生虫的鉴别检测技术，确切地讲本发明提供一种用于鉴别 诊断牛属动物是否感染梨形虫病的检测试剂盒及其制备与使用方法。
【背景技术】
[0002] 牛梨形虫病（equine piroplasmosis)是牛巴贝斯虫和泰勒虫寄生于牛属动物的 红细胞内引起的一种急性、亚急性或慢性的原虫性寄生虫病，其传播媒介是蜱，主要以引 起动物发热(有时呈周期性)、贫血、黄疸、肝脾肿大为特点，病程后期动物常出现胆红素尿 和血红蛋白尿等症状。巴贝斯虫（Babesia)是原生生物界（Protista)的原生动物亚界 (Protozoa)、顶复门（Apicomplexa)、抱子虫纲（Sporozoea)、梨形虫亚纲（Piroplasmia)、 梨形虫目（Piroplasmida)中的巴贝斯科（Babesiidae)巴贝斯属（Babesia)。在我国感 染牛的主要巴贝斯虫流行虫株包括：牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝 斯虫、巴贝斯虫未定种喀什株。巴贝斯虫寄生于牛属动物的红细胞内，所引起的疾病称为 巴贝斯虫病。泰勒虫（Theileria)(旧名焦虫）是梨形虫亚纲（Piroplasmia)、梨形虫目 (Piroplasmida)中的泰勒科（Theileriidae)、泰勒虫属（Theileria)。泰勒虫寄生于牛属 动物的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，所引起的寄生虫病称为泰勒焦虫病。在我国感染牛 的主要泰勒虫流行虫株包括：环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫。牛梨形虫病在世界 许多国家和地区流行，国际兽疫局（Office International Des Epizooties, 0IE)将牛 巴贝斯虫病和泰勒焦虫病列为B类疫病（0IE. Bovine piroplasmosis. 2008)，我国将其 列为二类疫病。在我国，牛巴贝斯虫病主要流行于西北、南方等地区，牛巴贝斯虫和双芽巴 贝斯虫的主要传播媒介是硬蜱属的微小牛蜱和镰形扇头蜱；大巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫的 主要传播媒介为血蜱属的长角血蜱；巴贝斯虫未定种喀什株的主要传播媒介为璃眼蜱属的 小亚璃眼蜱。牛的泰勒焦虫病主要流行于西北、华北和东北等地区，环形泰勒虫主要传播 媒介是璃眼蜱属的蜱：包括残缘璃眼蜱、小亚璃眼蜱、盾糙璃眼蜱等。瑟氏泰勒虫的主要传 播媒介为血蜱属的长角血蜱；中华泰勒虫的主要传播媒介为青海血蜱(汪明主编.兽医 寄生虫学[M].北京：中国农业出版社，2008: 366 - 369)。牛梨形虫病的季节流行性很 强，多呈急性经过，发病率和死亡率均很高，尤其对引进疫区的外来牛属动物、改良种牛以 及肉牛的危害极大，是制约发展中国家牛属动物养殖产业发展的主要疾病之一。目前，牛梨 形虫病的检测和诊断主要有下列几类手段：（1)血涂片染色显微镜检测、淋巴结穿刺试验、 体外培养、临床诊断和动物接种试验等传统方法，此类方法检出率低，对检测人员的素质要 求非常高。（2)血清学方法，如：间接荧光抗体试验（IFAT)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、 固相酶联免疫吸附试验（SELISA)和竞争酶联免疫吸附试验（C-ELISA)等，参见Dominguez M，Echaide I，de Echaide ST, Wilkowsky S，Zabal 0，Mosqueda JJ，Schnittger L， Florin-Christensen M. 2012. Validation and field evaluation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis ofBabesia bo visinfections in Argentina. Clin Vaccine Immunol. 19，924-928. ; Altangerel K，Alhassan A， Iseki H，Sivakumar T，Boldbaatar D，Yokoyama N，Igarashi I. 2009. Evaluation ofBabesia bigemina200 kDa recombinant antigen in enzyme-linked immunosorbent assay. Parasitol Res. 105，249-254; Singh H，Mishra AK，Rao JR, Tewari AK. 2009. Comparison of indirect fluorescent antibody test (IFAT) and slide enzyme linked immunosorbent assay (SELISA) for diagnosis ofBabesia bigeminainfection in bovines. Trop Anim Health Prod. 41，153-159; Kim C，Alhassan A，Verdida RA, Yokoyama N, Xuan X，Fujisaki K，Kawazu S，Igarashi I. 2007. Development of two immunochromatographic tests for the serodiagnosis of bovine babesiosis. Vet Parasitol. 148，137-143; Barros SL，Madruga CR，Araujo FR, Menk CF，de Almeida MA, Melo EP，Kessler RH. 2005. Serological survey ofBabesia bo vis, Babesia bigemina,andAnaplasma marginaleantibodies in cattle from the semi-arid region of the state of Bahia, Brazil, by enzyme-linked immunosorbent assays. Mem Inst Oswald。Cruz. 100，513-517; Salih DE，Ahmed JS，Bakheit MA，Ali EB， El Hussein AM, Hassan SM，Shariff OE，Fadl M，Jongejan F. 2005. Validation of the indirect TaSP enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis ofTheileria annulatainfection in cattle. Parasitol Res. 97，302-308; Goff WL, McElwain TF，Suarez CE，Johnson WC, Brown WC, Norimine J，Knowles DP. 2003. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay based on a rhoptry-associated protein 1 epitope specifically identifiesBabesia bovis-infectedcattle. Clin Diagn Lab Immunol. 10，38-43; Ruiz PM, Passos LM, Machado RZ，Lima JD，Ribeiro MF. 2001. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of IgM antibodies toBabesia bigeminain cattle. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96，237-240〇 此类方法虽然能诊断和鉴别单一牛梨形虫的感染，但不同梨形虫虫株的交叉感染产生的 抗体及抗体滴度可能会对最终的结果判定产生影响，可能会出现漏检、假阳性等现象，对 检测人员的要求也很高。（3)分子检测技术，如PCR、巢氏PCR技术、多重PCR、实时定量 PCR、LAMP、反向线性印迹（RLB)等方法，具体参见Bilgip HB，Karagenp T，Simuunza M， Shiels B，Tait A，Eren H，Weir W. 2013. Development of a multiplex PCR assay for simultaneous detection ofTheileria annulata, Babesia bovisandAnaplasma marginalein cattle. Exp Parasitol. 133，222-229; Liu A，Guan G，Du P，Gou H，Zhang J，Liu Z，Ma M，Ren Q，Liu J，Yang J，Li Y，Niu Q，Bai Q，Yin H， Luo J. 2013. Rapid identification and differentiation ofTheileria sergenti andTheileria sinensisusing a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. Vet Parasitol. 191, 15-22; Ros-Garcla A, Juste RA, Hurtado A. 2012. A highly sensitive DNA bead-based suspension array for the detection and species identification of bovine piroplasms. Int J Parasitol. 42，207-214; Ramos CA， Araujo FR，Souza II，Bacanelli G，Luiz HL，Russi LS，Oliveira RH, Soares CO, Rosinha GM，Alves LC. 2011. Real-time polymerase chain reaction based on msa2c gene for detection ofBabesia bovis.Vet Parasitol. 176，79-83; Silva MG, Marques PX，Oliva A. 2010. Detection of Babesia and Theileria species infectionincattlefromPortugalusingareverselineblottingmethod.Vet Parasitol. 174, 199-205;HasleG,BjuneGA,ChristenssonD,R0edKH,Whist AC, LeinaasHP. 2010.DetectionofBabesiadivergensinsouthernNorwayby usinganimmunofluorescenceantibodytestincowsera.ActaVetScand. 52:55; AbouLailaM,YokoyamaN,IgarashiI. 2010.Developmentandevaluationof twonestedPCRassaysforthedetectionofBabesiabovisfromcattleblood. VetParasitol. 172, 65-70;Criado-FornelioA,BillingA,AsenzoG,Benitez D,Florin-ChristensenM,Gonzalez-OlivaA,HenriquesG,SilvaM,AlongiA, AgnoneA,TorinaA,MadrugaCR. 2009.Developmentoffluorogenicprobe-based PCRa