作为昆虫防治剂的dsRNA的制作方法

作为昆虫防治剂的dsRNA的制作方法
【专利摘要】本发明涉及通过RNAi介导的基因沉默来防治害虫侵害的方法，其通过将完好的昆虫细胞与该昆虫细胞外部的双链RNA接触以及通过所述双链RNA被所述完好的昆虫细胞摄取来实现。在一个具体的实施方案中，本发明的方法用于减轻昆虫害虫对植物的侵害。作为替代地，所述方法用于向有此处理和/或防止需要的基层或对象进行处理和/或防止昆虫侵害。公开了适当的昆虫靶基因及其片段、dsRNA构建体、重组构建体和组合物。
【专利说明】作为昆虫防治剂的dsRNA
[0001] 本申请是中国专利申请200780002294. X的分案，后者是2007年1月12日提交的 PCT申请PCT/EP2007/000287于2008年7月11日进入中国国家阶段的申请。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及在昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导基因沉默的领域。更具体地，本发 明涉及设计用于表达对应于新靶基因的dsRNA的遗传构建体。这些构建体在RNAi介导的 害虫防治中尤其有用。本发明还涉及用于防治昆虫的方法、用于防止昆虫侵害的方法以及 使用RNAi下调昆虫中基因表达的方法。

【背景技术】
[0003] 昆虫及其它害虫可通过其叮咬或螫刺而导致损伤甚至死亡。而且，许多害虫传播 导致疾病的细菌及其它病原体。例如，蚊子传播导致疟疾、黄热病、脑炎和另一些疾病的病 原体。腺鼠疫（或黑死病）由感染大鼠和另一些啮齿动物的细菌所引起。用于防治微观害 虫侵害的组合物已经以抗生素、抗病毒和抗真菌的组合物的形式提供。用于防治害虫（如 线虫和昆虫）侵害的方法通常采用化学组合物的形式，将所述化学组合物应用于害虫停留 的表面上，或者以丸剂、粉剂、片剂、糊剂或胶囊剂的形式施用于被侵扰动物。
[0004] 重要农作物的昆虫害虫防治是非常重要的领域，例如破坏茄科植物的昆虫害虫， 尤其是鞘翅目害虫的防治，所述爺科植物尤指马铃薯（Solanum tuberosum),以及番爺 (Solanum lycopersicum)、爺子（Solanum melongena)、辣椒（Solanum capsicum)和爺属植 物（例如，Solanum aculeastrum、S. bulbocastanum( -种野生马铃薯）、S. cardiophyllum、 S. douglasii、欧白英（S. dulcamara)、S. lanceolatum、S. robustum 和 S. triquetrum) 〇
[0005] 在过去的几十年中，用于防治植物中昆虫侵害的更有效方法和组合物的开发已取 得显著进展。化学杀虫剂在根除害虫侵害中已非常有效。
[0006] 使用印楝籽提取物进行生物防治已显示出对植物鞘翅目害虫有作用。基于印楝的 市售杀虫剂将印楝素作为主要的活性成分。这些杀虫剂适用于广谱的昆虫。它们作为昆虫 生长调节剂；印楝素通过抑制一种昆虫激素（蜕皮素）的产生而阻止昆虫蜕皮。
[0007] 使用来自苏云金芽孢杆菌粉虫变种（Bacillus thuringiensis varieties tenebrionis)和圣地亚哥变种（varieties san diego)的Cry3A蛋白以及衍生的杀虫蛋白 进行生物防治是化学防治的可替代方法。所述Bt(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白对 于防治马铃薯叶甲幼虫是有效的，该毒素蛋白或者作为在植物上喷洒的制剂或者在马铃薯 的叶中表达。
[0008] -种可替代的生物制剂是dsRNA。在过去的几年里，借助RNA干扰或"RNAi "下调 多细胞生物中的基因（也称为"基因沉默"）已成为成熟的技术。
[0009] RNA干扰或"RNAi"是序列特异性下调基因表达的方法（也称为"基因沉默"或"RNA 介导的基因沉默"），其由序列与待下调靶基因区域互补的双链RNA (dsRNA)起始（Fire， A.Trends Genet. Vol. 15, 358-363,1999 ；Sharp,P. A. Genes Dev. Vol. 15,485-490,2001)〇
[0010] 在过去的几年里，借助RNA干扰（RNAi)下调多细胞生物的靶基因已成为成熟的技 术。可参考国际申请W099/32619(卡内基学院）和W000/01846(本 申请人:）。
[0011] dsRNA基因沉默应用于许多不同的领域中，例如在临床应用（W02004/001013)和 植物中dsRNA介导的基因沉默。在植物中，还已将用于基因沉默的dsRNA构建体设计成可 被切割及加工成小干扰RNA(siRNA)。
[0012] 尽管本领域已普遍了解植物、秀丽隐杆线虫（C. elegans)和哺乳动物细胞中 的RNAi技术若干年，然而对于使用RNAi下调昆虫中基因表达迄今几乎是未知的。自从 W000/01846和W099/32619申请的提交和公布以来，仅有少量涉及使用RNAi保护植物免受 昆虫侵害的其它申请被公布。这些包括国际申请W001/37654(DNA Plant Technologies)、 W02005/019408 (Bar Ilan 大学）、W02005/049841 (CSIR0, Bayer Cropscience)、 W005/047300(犹他大学研究基金会）和美国申请2003/00150017 (Mesa等）。本发明提供 了用于RNAi介导的昆虫害虫防治的靶基因和构建体。相应地，本发明提供了通过抑制、延 迟或降低特定害虫中靶基因的表达来防治害虫侵害的方法和组合物。


【发明内容】

[0013] 本发明描述了用于防治作物昆虫害虫的不基于化合物、不基于蛋白质的新方法。 其活性成分是核酸（双链RNA (dsRNA))，所述核酸可用作杀虫制剂（例如，作为叶的喷雾 剂）。所述dsRNA的序列对应于昆虫必需基因的部分或全部，并通过RNA干扰（RNAi)导致 昆虫靶标的下调。由于mRNA的下调，所述dsRNA阻止昆虫靶蛋白的表达，并因此导致昆虫 死亡、生长停滞或不育。
[0014] 本发明的方法可实际应用在需要抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖或者降低昆 虫的致病性或感染性的任何【技术领域】。本发明的方法还实际应用于需要特异性下调昆虫中 一种或多种靶基因表达的情形。特别有用的实际应用包括但不限于：（1)保护植物免受昆 虫害虫侵害；(2)在人和动物中的药物或兽医用途（例如，控制、治疗或预防人和动物中的 昆虫感染）；(3)保护物品免遭昆虫破坏；(4)保护易腐的物品（如食品、种子等）免遭昆虫 破坏；以及通常需要防治昆虫和/或需要防止昆虫引起破坏的任何应用。
[0015] 根据一个实施方案，本发明涉及控制细胞或生物上昆虫生长的方法，或者防止昆 虫侵害对昆虫感染敏感的细胞或生物的方法，其包括将昆虫与双链RNA接触，其中所述双 链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部 分互补的核苷酸序列，该双链RNA被昆虫摄取并因此控制生长或防止侵害。
[0016] 因此，本发明提供了分离的新的昆虫靶基因核苷酸序列，所述分离的核苷酸序列 包含选自以下的至少一种核酸序列：
[0017] (i)如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513， 515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767， 768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888， 890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090, 2095,2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 或 2460, 2461，2466， 2471，2476, 2481或2486,或其互补序列，
[0018] (ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更 优选至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列：
[0019] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178.183.188.193.198.203.208.215.220.225.230.240 至 247,249,251，253,255,257， 259,275至 472,473,478,483,488,493,498,503,508至 513,515,517,519,521，533至 575， 576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793， 795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040， 1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互补 序列，以及
[0020] (iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
[0021] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178.183.188.193.198.203.208.215.220.225.230.240 至 247,249,251，253,255,257， 259,275至 472,473,478,483,488,493,498,503,508至513,515,517,519,521，533至575， 576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793， 795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040， 1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互补 序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因 的直系同源物：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或其互补序列，所述核酸序列 可用于制备本发明的用于控制昆虫生长的双链RNA。
[0022] 本发明使用的"防治害虫"意指杀死害虫，或阻止害虫发育或生长，或防止害虫感 染或侵害。本文使用的防治害虫还包括控制害虫的后代（卵的发育）。本文使用的害虫防 治还包括抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖，或降低昆虫的致病性或感染性。本文所述的 化合物和/或组合物可用于维持生物健康，并可以治疗性、预防性或全身性地使用来防治 害虫或者阻止昆虫生长或发育或者感染或侵害。
[0023] 本发明涉及的特定害虫是昆虫害虫。因此，本文使用的"防治昆虫"还包括控制昆 虫的后代（例如昆虫害虫的卵的发育）。本文使用的防治昆虫还包括抑制昆虫的生存、生 长、发育或繁殖，或者降低昆虫的致病性或感染性。在本发明中，防治昆虫可以抑制昆虫中 的生物活性，其导致一种或多种以下特征：昆虫进食减少，昆虫生存力降低，昆虫死亡，抑制 昆虫的分化和发育，以下的缺失或能力下降：昆虫有性繁殖、肌肉形成、保幼激素形成、保幼 激素功能调节、离子调节和转运、细胞膜电势的维持、氨基酸的生物合成、氨基酸降解、精子 形成、信息素合成、信息素的感知、触角形成、翅的形成、足的形成、发育和分化、卵的形成、 幼虫的成熟、消化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、 呼吸、凋亡以及真核细胞的细胞骨架结构（如肌动蛋白和微管蛋白）的任何组分。本文所 述的化合物和/或组合物可用于维持生物健康，并可以治疗性、预防性或全身性地使用来 防治昆虫，或阻止害虫生长或发育或者感染或侵害。因此，本发明可以使先前的敏感生物对 昆虫侵害产生抗性。
[0024] 本文使用的表述"与……的至少一部分互补"是指所述核苷酸序列与靶标的核苷 酸序列在超过两个核苷酸的长度上，例如超过至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更 多个连续核苷酸的长度上完全互补。
[0025] 根据又一实施方案，本发明涉及用于下调昆虫中靶基因表达的方法，其包括将所 述昆虫与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与 待下调昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其中所述双链RNA被昆虫 摄取并因此下调昆虫靶基因的表达。
[0026] 在无数量词修饰时，"靶基因"是指"至少一种"靶基因。同样地，靶生物是指"至 少一种"靶生物，RNA分子或宿主细胞是指"至少一种"RNA分子或宿主细胞。这在后面还有 详述。
[0027] 根据一个实施方案，本发明的方法依赖于昆虫摄取其外部的双链RNA(例如，通过 进食），而不需要在昆虫细胞中表达双链RNA。另外，本发明还包括如上所述的方法，其中所 述昆虫与包含该双链RNA的组合物接触。
[0028] 可通过原核的（例如但不限于细菌）或真核的（例如但不限于酵母）宿主细胞或 宿主生物来表达所述双链RNA。
[0029] 所述昆虫可以是任何昆虫，意指属于动物界、特别是节肢动物门、尤其是昆虫纲或 蛛形纲的任何生物。本发明的方法适用于对利用RNA干扰进行的基因沉默敏感的所有昆 虫，以及能够从其邻近环境将双链RNA内化的所有昆虫。本发明还适用于处于其任何发育 阶段的昆虫。因为昆虫具有无生命的外骨骼，所以它们不能以均一的速率生长，而是通过周 期性蜕落其外骨骼进行分阶段生长。该过程称作"蜕皮"。蜕皮之间的阶段称作"龄"，而这 些阶段可以作为本发明的靶标。同时，昆虫的卵或活的幼虫也可作为本发明的靶标。发育 周期中的所有阶段（包括有翅昆虫中的变态）均可以作为本发明的靶标。因此，单个阶段 (如幼虫、蛹、若虫等发育阶段）均可以作为靶标。
[0030] 在本发明的一个实施方案中，所述昆虫可以属于以下的目：蜱螨目、蜘蛛目、虱目、 鞘翅目、弹尾目、革翅目、网翅目、双尾目、双翅目、纺足目、蜉蝣目、蛩蠊目、半翅目、同翅目、 膜翅目、等翅目、鳞翅目、食毛目、长翅目、脉翅目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、櫝翅目、原尾 目、啮虫目、蚤目、虱目、缨尾目、捻翅目、缨翅目、毛翅目和缺翅目。
[0031] 在本发明优选的非限制性实施方案和方法中，所述昆虫选自：
[0032] (1)植物昆虫害虫，例如但不限于褐飞風属物种（Nilaparvata spp.))(例如，褐 飞風（N.lugens))、灰飞風属物种（Laodelphax spp.)(例如，灰飞風（L.striatellus))、 黑尾叶蝶属物种（Nephotettix spp.)(例如，二点黑尾叶蝶（N. virescens)，或黑尾叶 蝶（N.cincticeps)，或二条黑尾叶蝶（N.nigropictus))、白背飞風属物种（Sogatella spp.)(例如，白背飞風（S. furcifera))、杆长蝽属物种（Blissus spp.)(例如，美洲谷杆 长蝽（B.leucopterus leucopterus))、黑蝽属物种（Scotinophora spp.)(例如，稻黑蝽 (S. vermidulate))、绿蝽属物种（Acrosternum spp.)(例如，拟绿蝽（A. hilare))、稻弄蝶 属物种（Parnara spp.)(例如，直纹稻弄蝶（P. guttata))、禾草螟属物种（Chilo spp.)(例 如，二化螟（C.suppressalis)、台湾稻螟（C.auricilius)或稻多丽螟（C.polychrysus))、 禾草螟属物种（Chilotraea spp.)(例如，稻杆螟（C. polychrysa))ji^夜蛾属物种 (Sesamia spp.)(例如，稻駐莖夜蛾（S.inferens))、駐禾螟属物种（Tryporyza spp.)(例 如，白稻螟（T. innotata)或三化螟（T. incertulas))、纵卷叶野螟属物种（Cnaphalocrocis spp.)(例如，稻纵卷叶野螟（C. medinalis))、潜蝇属物种（Agromyza spp.)(例如，日本 稻潜蝇（A.oryzae)或玉米斑潜蝇（A.parvicornis))、杆草螟属物种（Diatraea spp.) (例如，小鹿螟（D.saccharalis)或西南玉米杆草螟（D.grandiosella))、Narnaga属 物种（例如，绿稻毛虫（N. aenescens))、黄夜蛾属物种（Xanthodes spp.)(例如，犁 纹黄夜蛾（X. transversa))、灰翅夜蛾属物种（Spodoptera spp.)(例如，草地贪夜蛾 (S. frugiperda)、甜菜夜蛾（S. exigua)、海灰翅夜蛾（S. littoralis)或西部黄条夜蛾 (S. praefica))、秘夜蛾属物种（Mythimna spp.)(例如，粘虫（Mythmna(Pseudaletia) seperata))、铃夜蛾属物种（Helicoverpa spp.)(例如，谷实夜蛾（H.zea))、Colaspis 属 物种（Colaspis spp.)(例如，葡萄肖叶甲（C.brunnea)、稻水象属物种（Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲（L.oryzophilus))、稻象属物种（Echinocnemus spp.)(例如，稻象 (E.squamos))、稻铁甲属物种（Diclodispa spp.)(例如，水稻铁甲（D.armigera))、禾谷 负泥虫属物种（Oulema spp.)(例如，水稻负泥虫（O.oryzae))、米象属物种（Sitophilus spp.)(例如，米象（S. oryzae))、Pachydiplosis 属物种（例如，稻瘿蚊（Ρ· oryzae))、 毛眼水蝇属物种（Hydrellia spp.)(例如，麦叶毛眼水蝇（H. griseola)或日稻毛眼 水蝇（H. sasakii) )、Chlorops属物种（例如，稻杆潜蝇（C. oryzae))、根萤叶甲属物 种（Diabrotica spp.)(例如，玉米根叶甲（D. virgifera virgifera)、北美玉米根叶 甲（D. barberi)、黄瓜十一星叶甲食根亚种（D. undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米 根叶甲（D. virgifera zeae)、条纹黄瓜叶甲（D.balteata))、杆野螟属物种（Ostrinia spp.)(例如，玉米螟（0. nubilalis))、地虎属物种（Agrotis spp.)(例如，小地老虎 (A. ipsilon))、Elasmopalpus 属物种（例如，南美玉米苗斑螟（E. lignosellus))、梳爪 叩头虫属物种（Melanotus spp.)(线虫）、圆头犀金龟属物种（Cyclocephala spp.)(例 如，北部伪装金龟（C. borealis)或南部伪装金龟（C. immaculata))、弧丽金龟属物种 (Popillia spp.)(例如，日本弧丽金龟（Ρ· japonica))、跳甲属物种（Chaetocnema spp.) (例如，玉米铜色跳甲（C.pulicaria))、龙颈象属物种（Sphenophorus spp.)(例如，玉米 长_象（S.maidis))、纟益管姆属物种（Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米姆（R.maidis))、 圆尾姆属物种（Anuraphis spp.)(例如，玉米根姆（A. maidiradicis))、黑幢属物种 (Melanoplus spp.)(例如，红足黑幢（M. femurrubrum))、特异黑幢（M. differentialis) 或迀飞黑幢（Μ· sanguinipes))、种蝇属物种（Hylemya spp.)(例如，种蝇（Η· platura))、 呆蓟马属物种（Anaphothrips spp.)(例如，黄呆蓟马（A. obscrurus))、火蚁属物种 (Solenopsis spp.)(例如，盗蚁（S.milesta))、叶螨属物种（Tetranychus spp.)(例如， 二点叶螨（T. urticae)、朱砂叶螨（T. cinnabarinus))、铃夜蛾属物种（例如，谷实夜蛾或 棉铃虫（H. atmigera))、Pectinophora 属物种（例如，红铃麦蛾（P. gossypiella))、金刚 钻属物种（Earias spp.)(例如，翠纹钻夜蛾（E. vittella))、实夜蛾属物种（Heliothis spp.)(例如，烟芽夜蛾（H.virescens))、花象属物种（Anthonomus spp.)(例如，墨西哥 棉铃象（A. grandis))、Pseudatomoscelis 属物种（例如，棉伪斑腿盲蝽（P. seriatus))、 结翅粉風属物种（Trialeurodes spp.)(例如，结翅粉風（T. abutiloneus)、温室粉風 (T.vaporariorum))、小粉風属物种（Bemisia spp.)(例如，银叶粉風（B.argentifolii))、 虫牙属物种（Aphis spp.)(例如，棉姆（A. gossypii))、草盲蝽属物种（Lygus spp.)(例如，美 国牧草盲畴（L. lineolaris)或美洲牧草盲畴（L. hesperus))、美洲畴属物种（Euschistus spp.)(例如，斑点美洲蝽（Ε· conspersus))、Chlorochroa属物种（例如，赛氏蝽（C. sayi))、 绿蝽属物种（Nezara spp.)(例如，稻绿蝽（N.viridula))、蓟马属物种（Thrips spp.)(例 如，烟蓟马（T. tabaci))、花蓟马属物种（Frankliniella spp.)(例如，烟褐蓟马（F. fusca) 或西方花蓟马（F.occidentalis))、马铃薯叶甲属物种（Leptinotarsa spp.)(例如，马铃 薯叶甲（L.decemlineata)、伪马铃薯叶甲（L. juncta)或胡颓子叶煎叶甲（L.texana))、 合爪负泥虫属物种（Lema spp.)(例如，三条负泥虫（L. tri 1 ineata))、煎跳甲属物种 (Epitrix spp.)(例如，美国马铃薯跳甲（E.cucumeris)、烟草跳甲（E.hirtipennis)或块 莖跳甲（E.tuberis))、豆芫菁属物种（Epicauta spp.)(例如，北美豆芫菁（E.vittata))、 猿叶甲属物种（Phaedon spp.)(例如，辣根猿叶甲（P. cochleariae))、食植瓢虫属物种 (Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢虫（E.varivetis))、Acheta属物种（例如，居屋艾 幡（A. domesticus))、绿小叶蝶属物种（Empoasca spp.)(例如，蚕豆小绿叶蝶（E. fabae))、 瘤虫牙属（Myzus spp.)(例如，桃姆（M.persicae))、薯个木風属物种（Paratrioza spp.) (例如，马铃薯木風（P.cockerelli))、宽胸金针虫属物种（Conoderus spp.)(例如，南部 马铃薯线虫（C.falli)或烟草线虫（C.vespertinus))、麦蛾属物种（Phthorimaea spp.) (例如，马铃薯麦蛾（P. operculella))、长管姆属物种（Macrosiphum spp.)(例如，大 戟长管姆（M. euphorbiae))、Thyanta 属物种（例如，红肩蝽象（T. pallidovirens))、 麦蛾属物种（Phthorimaea spp.)(例如，马铃薯麦蛾（P. operculella))、铃夜蛾属物 种（例如，谷实夜蛾）、Keiferia属物种（例如，番煎蠢蛾（K. lycopersicella))、金针 虫属物种（Limonius spp.)(线虫）、Manduca属物种（例如，烟草天蛾（M. sexta)或 番煎天蛾（M.quinquemaculata))、斑潜蝇属物种（Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潜 蝇（L.sativae)、三叶草斑潜蝇（L.trifolli)或南美斑潜蝇（L.huidobrensis))、果蝇 属物种（Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蝇（D.melanogaster)、D.yakuba、拟暗果蝇 (D.pseudoobscura)或拟果M (D.simulans))、步甲属物种（Carabus spp.)(例如，粒步甲 (C.granulatus))、摇蚊属物种（Chironomus spp.)(例如，摇蚊（C.tentanus))、柿首蚤属 物种（Ctenocephalides spp.)(例如，猫柿首蚤（C.felis))、非耳_象属物种（Diaprepes spp.)(例如，根象鼻虫（D. abbreviatus))、齿小蠢属物种（Ips spp.)(例如，美松齿小蠢 (I.pini))、拟谷盗属物种（Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗（T.castaneum))、舌蝇属物 种（Glossina spp.)(例如，刺舌蝇（G.morsitans))、按蚊属物种（Anopheles spp.)(例如， 甘比亚按蚊（A. gambiae))、铃夜蛾属（例如，棉铃虫（H. armigera))、Acyrthosiphon属物种 (例如，豌豆姆（A. pisum))、蜜蜂属物种（Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂（A. melifera))、 Homalodisca属物种（例如，琉璃叶蝶（H.coagulate))、伊蚊属物种（Aedes spp.)(例 如，埃及斑纹（Ae. aegypti))、蚕蛾属物种（Bombyx spp.)(例如，家蚕（B. mori))、飞虫皇 属物种（Locusta spp.)(例如，飞幢（L.migratoria))、牛蜱属物种（Boophilus spp.) (例如，微小牛蜱（B. microplus))、Acanthoscurria属物种（例如，红毛巧克力捕鸟蛛 (A. gomesiana))、甲蠊属物种（Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊（D. punctata))、袖 蝶属物种（Heliconius spp.)(例如，瓦氏袖蝶（H.erato)或诗神袖蝶（H.melpomene))、象 虫属物种（Curculio spp.)(例如，欧洲栎象（C. glandium))、Plutella属物种（例如，菜 蛾（P. xylostella))、钝眼蜱属物种（Amblyomma spp.)(例如，彩饰花蜱（A. variegatum))、 丰乍香属物种（Anteraea spp.)(例如，天香（A.yamamai))和阿蚊属物种（Armigeres spp.) (例如，骚扰阿蚊（A.subalbatus));
[0033] (2)能够侵扰或损伤人和/或动物的昆虫，例如但不限于具有可见于半翅目和 某些膜翅目以及双翅目（如蚊子、蜜蜂、黄蜂、虱、蚤和蚂蚁）的刺吸式口器的昆虫以及 蛛形纲动物（Arachnidae)(如蜱和螨）：蜱螨目（蜱和螨），例如代表性的科：软蜱科 (Argasidae)、皮刺螨科（Dermanyssidae)、硬蜱科（Ixodidae)、痒螨科（Psoroptidae)或 挤螨科（Sarcoptidae)，以及代表性的物种：花蜱属物种（Amblyomma spp.)、暗眼蜱属物 种（Anocentor spp·)、锐缘蜱属物种（Argas spp·)、牛蜱属物种（Boophilus spp·)、姬螯 螨属物种（Cheyletiella spp·)、足螨属物种（Chorioptes spp·)、懦形螨属物种（Demodex spp.)、革蜱属物种（Dermacentor spp.)、皮刺螨属物种（Dermanyssus spp.)、血蜱属物 种（Haemophysalis spp·)、璃眼蜱属物种（Hyalomma spp·)、硬蜱属物种（Ixodes spp·)、 Lynxacarus属物种、中气门亚目物种（Mesostigmata spp.)、背肛螨属物种（Notoedres spp.)、钝缘蜱属物种（Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种（Ornithonyssus spp.)、残_蜱 属物种（Otobius spp·)、耳痒螨属物种（Otodectes spp·)、肺刺螨属物种（Pneumonyssus spp.)、痒螨属物种（Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种（Rhipicephalus spp.)、挤螨属物种 (Sarcoptes spp.)或恙螨属物种（Trombicula spp.);風目（吸咣和叮咬的風），例如代表 性物种：牛毛風属物种（Bovicola spp·)、血風属物种（Haematopinus spp·)、颚風属物种 (Linognathus spp.)、鸡風属物种（Menopon spp.)、人風属物种（Pediculus spp.)、瘦绵虫牙 属物种（Pemphigus spp·)、根瘤姆属物种（Phylloxera spp.)或管風属物种（Solenopotes spp.);双翅目（蝇），例如代表性的物种：伊蚊属物种（Aedes spp.)、按蚊属物种 (Anopheles spp·)、丽蝇属物种（Calliphora spp·)、金蝇属物种（Chrysomyia spp·)、斑 蛇属物种（Chrysops spp·)、锥蝇属物种（Cochliomyia spp·)、库蚊属物种（Culex spp·)、 库蠓属物种（Culicoides spp·)、黄蝇属物种（Cuterebra spp·)、皮蝇属物种（Dermatobia spp·)、胃蝇属物种（Gastrophilus spp·)、舌蝇属物种（Glossina spp·)、黑角蝇属物种 (Haematobia spp.)、麻蛇属物种（Haematopota spp.)、風Μ属物种（Hippobosca spp.)、皮 蝇属物种（Hypoderma spp.)、绿蝇属物种（Lucilia spp.)、角蝇属物种（Lyperosia spp.)、 蜱蝇属物种（Melophagus spp·)、狂蝇属物种（Oestrus spp·)、绿蝇属物种（Phaenicia spp.)、白蛉属物种（Phlebotomus spp.)、伏蝇属物种（Phormia spp.)、麻蝇属物种 (Sarcophaga spp·)、蚋属物种（Simulium spp·)、螫蝇属物种（Stomoxys spp·)、蛇属物种 (Tabanus spp. )、Tannia属物种或大蚊属（Tipula spp.);食毛目（叮咬的風），例如代表 性的物种：Damalina属物种、猫毛風属物种（Felicola spp.)、Heterodoxus属物种或卩齿毛 風属物种（Trichodectes spp.);蚤目（无翅昆虫），例如角叶蚤属物种（Ceratophyllus spp·)、蚤属物种（Pulex spp.)或客蚤属物种（Xenopsylla spp.);臭虫科（臭虫），例如代 表性的物种：臭虫属物种（Cimex spp. )、Tritominae属物种、Rhodinius属物种或锥蝽属物 种（Triatoma spp.)以及
[0034] (3)导致对基层（substrate)或物品的不利破坏的昆虫，如攻击食品、种子、木材、 涂料、塑料、衣物等的昆虫。
[0035] (4)与公共健康和卫生相关的昆虫或蛛形纲动物，包括住屋昆虫和体外寄生 虫，例如但不限于蝇、叶螨、蓟马、蜱、红色家禽螨、蚂蚁、蟑螂、白蚁、蟋蟀（包括住屋蟋 蟀）、蠢虫、书虱、甲虫、蠼螋、蚊子和蚤。更优选的靶标是蟑螂（蜚蠊目），例如但不限 于小蠊属物种（Blatella spp.)(例如，德国小蠊（Blatella germanica)、大蠊属物种 (Periplaneta spp.)(例如，美洲大臟（Periplaneta americana)和澳洲大臟（Periplaneta australiasiae)、蜚臟属物种（Blatta spp.)(例如，东方蜚臟（Blatta orientalis))和皮 蠊属物种（Supella spp.)(例如，长须蜚蠊（Supella longipalpa))，蚂蚁（蚁总科），如但 不限于火蚁属（Solenopsis spp.)(例如，红火蚁（Solenopsis invicta))、小家蚁属物种 (Monomorium spp.)(例如，小家蚁（Monomorium pharaonis))、弓背蚁属物种（Camponotus spp.)(例如，弓背蚁属物种（木匠蚁））、毛蚁属物种（Lasius spp.)(例如，黑毛蚁（lasius niger))、铺道蚁属物种（Tetramorium spp.)(例如，铺道蚁（Tetramorium caespitum))、红 蚁属物种（Myrmica spp.)(例如，小红蚁（Myrmica rubra))、蚁属物种（Formica spp.)(木 蚁）、举腹蚁属物种（Crematogaster spp.)(例如，举腹蚁（Crematogaster lineolata))、 虹臭蚁属物种（Iridomyrmex spp.)(例如，阿根廷蚁（Iridomyrmex humilis))、大头 蚁属物种（Pheidole spp.)(大头蚁）和 Dasymutilla 属物种（例如，Dasymutilla occidentalis (蚁蜂）），白蚁（等翅目和/或白蚁科），例如但不限于丫白蚁属物种 (Amitermes spp.)(例如佛罗里达黑翅散白蚁（Amitermes floridensis))、散白蚁属物 种（Reticulitermes spp.)(例如，黄肢散白蚁（Reticulitermes flavips)、西部散白 蚁（Reticulitermes hesperus))、乳白蚁属物种（Coptotermes spp.)(例如，台湾乳白 蚁（Coptotermes formosanus))、植白蚁属物种（Incisitermes spp.)(例如，小植白蚁 (Incisitermes minor))、新白蚁属物种（Neotermes spp.)(例如，森林树白蚁（Neotermes connexus))〇
[0036] 受益于本发明的"敏感生物"包括对害虫侵害敏感的任何生物。许多不同生物的害 虫，所述生物例如动物（如人、家畜（如宠物（如猫、犬等））和牲畜（包括绵羊、奶牛、猪、 鸡等））。
[0037] 由此，在本发明的优选但非限制的实施方案中，所述昆虫或蛛形纲动物选自：
[0038] (1)蜱螨目：包括蜱亚目（蜱）的螨类
[0039] (2)蛛形纲：蜘蛛目（蜘蛛）和盲蛛目（盲蜘蛛），实例包括黑寡妇蜘蛛 (Latrodectus mactans)和掠色隐遁蝴蛛（Loxosceles recluse)
[0040] (3)風目：風，如体風（Pediculus humanus)
[0041] (4)蜚蠊目：蟑螂,包括德国小蠊、大蠊属的美洲大蠊和澳洲大蠊、蜚蠊属的东方 蜚蠊以及皮蠊属的长须蜚蠊。最优选的靶标是德国小蠊。
[0042] (5)鞘翅目：甲虫，实例包括长蠹总科；大小蠹属物种（Dendroctonus spp.) (Black Turpentine Beetle、南部松小蠹（Southern Pine Beetle)、IPS 雕刻小蠹（IPS Engraver Beetle));地毯甲虫（Carpet Beetles)(圆皮蠹属物种（Anthrenus spp·)、毛皮 蠹属物种（Attagenus spp·)) ;01d House Borer(天牛科：家天牛（Hylotrupes bajulus)); 家俱窃蠹（Anobium punctatum);拟谷盗属物种（面象虫）；谷斑皮蠹（Trogoderma granarium) ；0ryzaephilus sarinamensis (锅谷盗（Toothed Grain Beetle))等（书虫）
[0043] (6)革翅目：蠼螋类
[0044] (7)双翅目：蚊（蚊科）和蝇（短角亚目），实例是Anophehnae (如按蚊属物种）和 库蚊亚科（如 Aedes fulvus);蛇科如 Tabanus punctifer (马妮）、Glossina morsitans morsitans (舌蝇）、drain flies (毛艨科）以及有瓣蝇类（Calyptratae)如家蝇（Musca domestica)、肉蝇（麻蝇科）等
[0045] (8)异翅亚目：臭虫，如温带臭虫（Cimex lectularius)(床風）
[0046] (9)膜翅目：黄蜂（细腰亚目），包括蚂蚁（蚁总科）、蜜蜂（蜜蜂总科）：红火蚁、 小家蚁、弓背蚁属物种（木匠蚁）、黑毛蚁、铺道蚁、小红蚁、蚁属物种（木蚁）、举腹蚁、阿根 廷蚁、大头蚁属物种（大头蚁）和Dasymutilla occidentalis (蚁蜂）等
[0047] (10)等翅目：白蚁，实例包括佛罗里达黑翅散白蚁（Amitermes fioridensis)、 黄肢散白蚁、西部散白蚁（R.hesperus)、台湾乳白蚁、小植白蚁、森林树白蚁（Neotermes connexus))和白蚁科
[0048] (11)鳞翅目：蛾，实例包括谷蛾科和织蛾科（如衣蛾（Tineola bisselliella))以 及螟蛾科（如紫斑谷螟（Pyralis farinalis))等
[0049] (12)啮虫目：书虱（啮虫目）
[0050] (13)蚤目：蚤，如致痒蚤（Pulex irritans)
[0051] (14)胸喙亚目：虫牙虫（蚜科）
[0052] (15)衣鱼目：蠹虫，实例是：小灶衣鱼（Thermobia domestica)和衣鱼（Lepisma saccharina)
[0053] 本发明优选的植物病原性昆虫是植物害虫并选自：马铃薯叶甲属物种（例如，马 铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或胡颓子叶茄叶甲）、褐飞虱属物种（例如，褐飞虱）、灰飞虱属 物种（例如，灰飞虱）、黑尾叶蝉属物种（例如，二点黑尾叶蝉，或黑尾叶蝉，或二条黑尾叶 蝉）、白背飞虱属物种（例如，白背飞虱）、禾草螟属物种（例如，二化螟、台湾稻螟或稻多丽 螟）、蛀茎夜蛾属物种（例如，稻蛀茎夜蛾）、蛀禾螟属物种（例如，白稻螟或三化螟）、根萤 叶甲属物种（例如，玉米根叶甲、北美玉米根叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种、墨西哥玉米 根叶甲）、杆野螟属物种（例如，玉米螟）、呆蓟马属物种（例如，黄呆蓟马）、Pectinophora 属物种（例如，红铃麦蛾）、实夜蛾属物种（例如，烟芽夜蛾）、结翅粉風属物种（例如，结翅 粉虱、温室粉虱）、小粉虱属物种（例如，银叶粉虱）、蚜属物种（例如，棉蚜）、草盲蝽属物种 (例如，美国牧草盲蝽或美洲牧草盲蝽）、美洲蝽属物种（例如，斑点美洲蝽）、Chlorochroa 属物种（例如，赛氏蝽）、绿蝽属物种（例如，稻绿蝽）、蓟马属物种（例如，烟蓟马）、花蓟马 属物种（例如，烟褐蓟马或西方花蓟马）、瘤蚜属物种（例如，桃蚜）、长管蚜属物种（例如， 大戟长管蚜）、杆长蝽属物种（例如，美洲谷杆长蝽）、绿蝽属物种（例如，拟绿蝽）、禾草螟 属物种（例如，稻杆螟（C. polychrysa))、稻水象属物种（例如，稻水象甲）、缢管蚜属物种 (例如，玉米姆）和圆尾姆属物种（例如，玉米根姆（A.maidiradicis))。
[0054] 根据一个更具体的实施方案，本发明的方法适用于马铃薯叶甲属物种。马铃薯叶 甲属属于叶甲科或叶甲类。叶甲（如跳甲和玉米根虫）和象甲（如苜蓿叶象甲）是特别重 要的害虫。跳甲包括多种小型食叶甲虫，其以多种草、谷类和草本植物的叶为食。跳甲包括 多个属（例如，八1：1：；^3、4口口111：11〇仙、4找〇口丨8七68、0丨8〇115^1^、爺跳甲属、长附跳甲属、潜跳甲 属（Prodagricomela)、Systena和黄条跳甲属）。蔬菜黄条跳甲（Phyllotreta cruciferae) (也叫作油菜跳甲（Rape Flea Beetle))是特别重要的害虫。玉米根虫包括叶甲属的物种 (例如，黄瓜十一星叶甲（D. undecimpunctata undecimpunctata)、黄瓜十一星叶甲食根亚 种、D. longicornis、玉米根叶甲和条纹黄瓜叶甲）。玉米根虫对玉米和瓜类（curcubit)造 成广泛破坏。黄瓜i 星叶甲（Western Spotted Cucumber Beetle)是美国西部的瓜类害 虫。苜蓿叶象甲（亦称三叶草象甲）属于叶象属（紫苜蓿叶象（H. postica)、埃及苜蓿叶象 (H. brunneipennis)、H. nigrirostris、三叶草叶象（H. punctata)和 H. meles)，并被认为是 重要的豆类害虫。埃及苜蓿叶象是美国西部的重要苜蓿害虫。
[0055] 马铃薯叶甲属物种超过30种。因此，本发明包括用于防治马铃薯叶甲属物种的 方法，更特别地用于杀死昆虫、或阻止马铃薯叶甲属昆虫发育或生长、或者防止昆虫感染 或侵害的方法。本发明所防治的特定马铃薯叶甲属物种包括马铃薯叶甲（Leptinotarsa decemlineata(Say))和伪马铃薯叶甲（Leptinotarsa juncta(Say))。
[0056] CPB (Colorado Potato Beetle，马铃薯叶甲）对我们本国的马铃薯、其它栽培和野 生的有块茎和无块茎的马铃薯物种（例如，S.demiSSUm(墨西哥马铃薯野生种）、富利亚薯 (S.phureja a.o.))以及另一些茄属植物物种是（严重的）害虫，所述植物物种包括： [0057] (a)作物物种番爺（若干番爺属物种）、爺子、胡椒（若干辣椒属物种）、烟草（若 干烟草属物种，其包括观赏性植物）和醋栗（酸浆属物种）；
[0058] (b)杂草/草本植物物种，北美刺龙葵（S. carolinense)、欧白英（S. dulcamara)、 颠茄（颠茄属物种）、曼陀罗（曼陀罗属物种）、天仙子（天仙子属物种）和黄花刺茄 (S.rostratum)〇
[0059] FPB(False Potato Beetle,伪马铃薯叶甲）主要发现于北美刺龙葵上，也发生在 欧白英、醋栗和酸浆（酸浆属物种）上。
[0060] 术语"昆虫"包括所有类型以及所有发育阶段的昆虫，包括卵、幼虫或若虫、蛹和成 虫阶段。
[0061] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是马铃薯叶甲，所述植物是马铃薯、 茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗或者稻、玉米或棉花。
[0062] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是辣根猿叶甲，所述植物是芥菜、大 白菜、芜菁、羽衣甘蓝或小白菜。
[0063] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥豆瓢虫，所述植物是豆类、 菜豆、四季豆、食荚菜豆、利马豆、绿豆、青豆、牛眼豆、绒毛豆、大豆、豇豆、木豆、三叶草或苜 蓿。
[0064] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥棉铃象，所述植物是棉花。 [0065] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是赤拟谷盗，所述植物以贮藏谷物 的形式，如面粉、谷类、粗粉、饼干、豆类、调味品、面食、点心粉、干的宠物食品、干花、巧克 力、坚果、种子甚至干的博物馆标本。
[0066] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是桃蚜，所述植物是树木如李属，特 别是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花科和葫芦科的蔬菜作物，其包括但不限于：朝 鲜蓟、芦笋、豆类、甜菜、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、哈蜜瓜、芹菜、玉 米、黄瓜、茴香、无头甘蓝、大头菜、芜菁、茄子、莴苣、芥菜、菜秋葵、欧芹、欧洲防风草、豌豆、 胡椒、马铃薯、萝卜、菠菜、南瓜、番茄、芜菁、豆瓣菜和西瓜；农田作物例如但不限于：烟草、 糖用甜菜和向日葵；花作物或其它观赏性植物。
[0067] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是褐飞虱，所述植物是稻类植物。 [0068] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是二化螟，所述植物是稻类植物、大 麦（bareley)、高粱、玉米、小麦或草。
[0069] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是菜蛾，所述植物是芸苔属物种，例 如但不限于卷心菜、大白菜、抱子甘蓝、无头甘蓝、油菜籽、嫩茎花椰菜、花椰菜、芜菁、芥菜 或萝卜。
[0070] 本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是居屋艾蟋，所述植物是本文所述 的任何植物或任何有机体。
[0071] 在本文中，术语"植物"包括期望被处理从而阻止或降低昆虫生长和/或昆虫侵 害的任何植物材料。这包括整株植物、幼苗、增殖或繁殖材料（如种子、插条、接穗、外植体 等），以及植物细胞和组织培养物等。所述植物材料应当表达RNA分子或者具有表达RNA分 子的能力，所述RNA分子包含至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列是害虫至少一种靶基因 的有义链核苷酸序列之至少一部分的RNA互补序列或代表了其RNA等价物，从而所述RNA 分子通过植物与害虫的相互作用被害虫摄取，所述RNA分子能够通过RNA干扰来抑制靶基 因或者下调靶基因的表达。
[0072] 所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因，例如对于害虫的生存、生长、发育或繁 殖必需的靶基因。本发明涉及昆虫中可被下调的任何目的基因（本文可称作"靶基因"）。
[0073] 术语"下调基因表达"和"抑制基因表达"可互换使用，其指在靶基因的蛋白质产物 和/或mRNA产物水平上可测量的或可观察的基因表达减少或者完全消除可检测的基因表 达。优选地，所述下调不显著地直接抑制昆虫其它基因的表达。当与正常的基因表达比较 时，dsRNA对基因表达的下调效果可计算为至少为30%、40%、50%、60%，优选70%、80%， 或者更优选90 %或95 %。取决于靶基因的性质，可通过对细胞或整只昆虫进行表型分析或 者使用分子技术测量mRNA或蛋白质的表达来验证昆虫细胞中基因表达的下调或抑制，所 述分子技术如RNA溶液杂交、PCR、核酸酶保护实验、Northern杂交、逆转录、使用微列阵监 测基因表达、抗体结合、酶联免疫吸附测定（ELISA)、We Stern印迹、放射免疫测定（RIA)、其 它免疫测定或荧光激活细胞分析（FACS)。
[0074] "靶基因"基本上可以是由于其干扰昆虫的生长或致病性或感染性而期望被抑制 的几乎任何基因。例如，如果本发明的方法用于阻止昆虫生长和/或侵害，则优选地选择 对昆虫的生存、生长、发育或繁殖必需的靶基因，或者参与昆虫的致病性或感染性的任何基 因，从而对靶基因的特异性抑制导致致死性表型或者降低或阻止昆虫侵害。
[0075] 根据一个非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法下调或抑制其 表达时，昆虫被杀死或者昆虫的繁殖或生长被阻止或阻滞的那些基因。认为这类靶基因是 昆虫生存所必需的，并称作必需基因。因此，本发明包括本文所述的方法，其中所述靶基因 是必需基因。
[0076] 根据另一非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法将其下调时， 昆虫的侵害或感染、昆虫造成的破坏和/或昆虫侵害或感染宿主生物和/或导致此类破坏 的能力有所降低。一般地，术语"侵害"和"感染"始终可互换使用。认为这类靶基因参与昆 虫的致病性或感染性。因此，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述靶基因参与昆虫的致 病性或感染性。选择后一类型靶基因的优势在于阻断了昆虫进一步感染植物或植物部分， 并抑制其形成后代。
[0077] 根据一个实施方案，靶基因是保守基因或昆虫特异性基因。
[0078] 另外，在本发明的方法中可以使用能够指导RNAi或RNA介导的基因沉默或者抑制 昆虫靶基因的任何适当的双链RNA片段。
[0079] 在另一实施方案中，选择实质性参与害虫（如昆虫）生长、发育和繁殖的基因。示 例性的基因包括但不限于核糖体蛋白的结构亚基和β -外被体基因（如CHD3基因）。核 糖体蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并且是胞 质小核糖体亚基的组分，核糖体蛋白如L9和L19是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组 分，并且定位于核糖体。秀丽隐杆线虫中的β-外被体基因编码蛋白质，所述蛋白质形成 膜泡外衣的多聚复合体的亚基。已在多种生物中发现类似的序列，如拟南芥（Arabidopsis thaliana)、黑腹果妮（Drosophila melanogaster)和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。在多种生物中发现相关的序列，如马铃薯叶甲、辣根猿叶甲、墨西哥豆瓢虫、 墨西哥棉铃象、赤拟谷盗、桃蚜、褐飞虱、二化螟、菜蛾和居屋艾蟋。
[0080] 本发明使用的其它靶基因可包括例如在生存、生长、发育、繁殖和感染性中扮演重 要角色的基因。这些靶基因包括例如持家基因、转录因子和害虫特异性基因或者线虫或果 蝇中致死性敲除突变。本发明使用的靶基因还可以是来自其它生物的基因，例如来自昆虫 或蛛形纲动物（例如，马铃薯叶甲属物种、猿叶甲属物种、食植瓢虫属物种、花象属物种、拟 谷盗属物种、瘤姆属物种、褐飞風属物种、禾草螟属物种、Plutella属物种或Acheta属物 种）的基因。
[0081] 优选的靶基因包括表1A中指定的基因以及来自其它靶生物（如来自其它害虫） 的直向同源基因。
[0082] 在本发明的方法中，使用dsRNA抑制昆虫生长或干扰昆虫的致病性或感染性。
[0083] 因此，本发明涉及包含退火互补链的分离的双链RNA，其中一条退火互补链包含与 昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。所述靶基因可以是本文所述 的任意靶基因，或者其发挥同样功能的一部分。
[0084] 根据本发明的一个实施方案，提供了包含退火互补链的分离的双链RNA，其中一条 退火互补链包含与昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其中所述靶基 因包含选自以下的序列：
[0085] (i)与如下表示的任意序列具有至少75%-致性的序列：SEQ ID N01，3,5,7,9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,1160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050, 2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085, 2090,2095,2100,2102,2104, 2106， 2108.2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互补序列，以及
[0086] (ii)包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：SEQ ID N01、3、5、7、9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075, 2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104, 2106， 2108.2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476或2481，或其互补序列，或者，其中所述昆虫靶基因是包含以 下任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的昆虫直系同源物：SEQ ID N049至158、275至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384至2460或其互补序列。
[0087] 取决于用于测量基因沉默的测定，与已用对照dsRNA处理的害虫相比，生长抑制 可定量为大于约5%、10%，更优选约20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%，最优选约 90%、95%或约 99%。
[0088] 根据本发明的另一实施方案，提供了分离的双链RNA，其中至少一条所述退火互 补链包含如下表示的任意序列之至少一种核苷酸序列的RNA等价物：SEQ ID N01、3、5、 7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198， 203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483， 488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，566,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1662,1684,1666,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055, 2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090, 2095,2100,2102,2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476或2481，或者其中至少一条所述退火互补链包含其长度为至 少17个碱基对、优选其长度为至少18、19、20或21，更优选至少22、23或24个碱基对的RNA 等价物的片段。
[0089] 如果本发明的方法用于在宿主细胞或宿主生物中或者对宿主细胞或宿主生物特 异性控制特定昆虫的生长或侵害，则优选所述双链RNA不与任何宿主基因具有任何显著的 同源性，或者至少不与宿主的任意必需基因具有任何显著的同源性。在这种情况下，优选所 述双链RNA与宿主细胞任意基因的核酸序列一致性低于30%，更优选低于20%，更优选低 于10%，甚至更优选低于5%。序列一致性百分比应当在所述双链RNA的全长区域上计算。 如果可获得宿主生物的基因组序列数据，则可以使用标准生物信息学工具来相互校验与所 述双链RNA的序列一致性。在一个实施方案中，所述dsRNA与宿主序列之间不存在超过21 个连续核苷酸的序列一致性，即在这种情况下，优选宿主生物的基因组中不存在所述dsRNA 的21个连续碱基对。在另一实施方案中，所述dsRNA与宿主物种任意核苷酸序列之间在24 个连续核苷酸上的序列一致性低于约10%或低于约12. 5%。
[0090] 所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含对应于待下调之靶基 因的靶核苷酸序列的核苷酸序列。所述双链RNA的另一条链能够与上述第一条链进行碱基 配对。
[0091] 所述昆虫靶基因的"靶区域"或"靶核苷酸序列"可以是基因的任何适当的区域或 核苷酸序列。所述靶区域应包含靶基因的至少17、至少18或至少19个连续核苷酸，更优选 至少20或至少21个核苷酸，并且更优选所述靶基因的至少22、23或24个核苷酸。
[0092] 优选（至少部分的）所述双链RNA与昆虫靶基因的靶区域具有100%的序列一致 性。然而应当理解的是，在所述双链区域的全长上具有100 %序列一致性不是功能性RNA抑 制的必要条件。还发现，相对于靶序列来说带有插入、缺失和单点突变的RNA序列对RNA抑 制是有效的。术语"对应于"或"与……互补"在本文可互换使用，并且当这些术语用于指所 述双链RNA和靶基因的靶区域之间的序列对应性时，应解释为并非绝对需要100%的序列 一致性。然而，所述双链RNA和靶区域之间的序列一致性百分比通常为至少80%或85% - 致，优选至少90%、95%、96%-致，或者更优选至少97%、98%-致，以及更优选至少99% 一致。当两条核酸链的至少85%碱基配对时，它们是"基本上互补的"。
[0093] 本文使用的术语"互补的"涉及DNA-DNA互补性和DNA-RNA互补性。类似地，术语 "RNA等价物"实际上指在DNA序列中碱基"T"可以被通常存在于核糖核酸中的对应碱基 "U"所替代。
[0094] 尽管所述dsRNA包含对应于靶基因中靶区域的序列，然而整个dsRNA都对应于靶 区域的序列却不是绝对必需的。例如，所述dsRNA可在靶标特异性序列的侧翼包含短的非 靶区域，只要该序列不实质性影响该dsRNA的RNA抑制性能即可。
[0095] 所述dsRNA可包含一个或多个替代碱基从而优化RNAi的性能。对于本领域技术 人员来说，如何依次改变所述dsRNA的每个碱基并测试所得dsRNA的活性（例如，在适当的 体外测试系统中）从而优化给定dsRNA的性能是显而易见的。
[0096] 所述dsRNA还可以包含DNA碱基、非天然的碱基或者糖-磷酸主链的非天然主链 连接或修饰，从而例如提高保藏期间的稳定性或者增强对核酸酶降解的抗性。
[0097] 先前已有报道，对于有效的基因沉默来说，形成约21bp的小干扰RNA(siRNA)是理 想的。然而，在 申请人:的应用中已显示，dsRNA的最小长度优选至少约80-100bp以便被某 些害虫有效摄取。有迹象表明，在无脊椎动物（如自由生活的秀丽隐杆线虫或植物寄生性 的南方根结线虫（Meloidogyne incognita))中，这些较长的片段在基因沉默中更加有效， 这可能由于无脊椎动物摄取这些较长的dsRNA更为有效所致。
[0098] 最近还提出，与常规的21聚体（21-mer)siRNA相比，由27聚体平端组成的合成 RNA双链体或者具有29bp的茎和2-nt3'突出端的短发夹（short hairpin，sh)RNA组成的 合成RNA双链体是RNA干扰更有力的诱导物。因此，基于上述已鉴定靶标、并且为27聚体 平端RNA分子或者具有29bp的茎和2-nt3'突出端的短发夹RNA分子的分子也包括在本发 明的范围内。
[0099] 因此，在一个实施方案中，所述双链RNA片段（或区域）本身的长度优选为至少 17bp，长度优选为18或19bp，更优选至少20bp，长度更优选至少21bp，或至少22bp，或至少 23bp，或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp。"双链RNA片段"或"双链RNA区域"是指对应 于（部分）靶基因的双链RNA小实体。
[0100] 通常，所述双链RNA优选为约17-1500bp，更优选约80-1000bp，最优选约17-27bp 或约 80-250bp ;如双链 RNA 区域约为 17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、 27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、 600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp 或 1500bp。
[0101] 所述双链RNA的长度上限可取决于i)昆虫摄取该dsRNA的需要，以及ii)该dsRNA 在细胞内部加工成指导RNAi的片段的需要。所选长度还可受RNA合成方法以及向细胞递 送RNA的模式的影响。优选地，本发明方法中待使用的双链RNA的长度小于10, 000bp，更优 选1000bp或更小，更优选500bp或更小，更优选300bp或更小，更优选100bp或更小。对于 任何给定的祀基因和昆虫来说，所述dsRNA进行有效抑制的最佳长度可通过实验来确定。
[0102] 所述双链RNA可以是完全或部分双链的。部分双链RNA可在双链部分的一端或两 端包含短的单链突出端，只要所述RNA仍能被昆虫摄取并指导RNAi即可。所述双链RNA还 可包含内部的非互补区。
[0103] 本发明的方法包括向同一昆虫同时或依次提供两种或更多种不同的双链RNA或 RNA构建体，从而实现下调或抑制多种靶基因或者更有效地抑制单种靶基因。
[0104] 或者，通过提供命中多种靶序列的一种双链RNA来命中多个靶标，并且多于一个 拷贝的对应于靶基因的双链RNA片段的存在可更有效地抑制单个靶标。因此，在本发明的 一个实施方案中，所述双链RNA构建体包含多个dsRNA区域，每个dsRNA区域的至少一条链 包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据本发明，所述RNA 构建体中的dsRNA区域可以与同样或不同的靶基因互补，和/或所述dsRNA区域可以与来 自相同或不同昆虫物种的靶标互补。
[0105] 术语"命中"是指所述dsRNA的至少一条链与靶基因或核苷酸序列互补，并由此可 与之结合。
[0106] 在一个实施方案中，所述双链RNA区域包含与靶基因互补的核苷酸序列的多个拷 贝。或者，所述dsRNA命中同一靶基因的多于一种靶序列。因此，本发明包括分离的双链 RNA构建体，其包含与昆虫靶标的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列的至少两个 拷贝。
[0107] 在本文中，本发明的术语"多种（个）"意指至少2种（个）、至少3种（个）、至少 4种（个）、至少5种（个）、至少6种（个）等。
[0108] "另一靶基因"或"至少另一种靶基因"是指例如第二、第三或第四种靶基因等。
[0109] 本发明的方法开发并使用了命中多于一种上述靶标的dsRNA或者针对上述不同 靶标的不同dsRNA的组合。
[0110] 因此，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含如下表示的至少一种核苷酸序 列之RNA等价物的至少两个拷贝：
[0111] SEQ ID 吣1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49至158，1599，160-163，168，173， 178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,2249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586， 591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799， 801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702， 1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095， 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368， 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或者其长度为至少 17 个碱基对、 优选其长度为至少18、19、20或21个碱基对，更优选至少22、23或24个碱基对之片段的 RNA等价物的至少两个拷贝，。优选地，所述双链RNA包含核苷酸序列SEQ ID N0159或160 的RNA等价物，或者其长度为至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个 碱基对的片段。在另一实施方案中，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含核苷酸序列 SEQ ID N0159或160的RNA等价物的至少两个拷贝。
[0112] 因此，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互补链，其中一 条退火互补链包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互补并包含彼此独立选择 的至少两种核苷酸序列的RNA等价物的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述dsRNA包含独 立选自如下表示的序列之至少两种、优选至少三种、四种或五种核苷酸序列的RNA等价物 ：
[0113] SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173， 178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586， 591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799， 801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702， 1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095， 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368， 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或者其长度为至少 17 个碱基对， 优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个碱基对的片段。
[0114] 所述至少两种核苷酸序列可以来源于本文所述的靶基因。根据一个优选的实施方 案，所述dsRNA命中对昆虫生存、生长、发育或繁殖必需的至少一种靶基因，并命中参与上 文所述的致病性或感染性的至少一种基因。或者，所述dsRNA命中同类的多种基因，例如所 述dsRNA命中至少两种必需基因或者至少两种参与同样细胞功能的基因。根据又一实施方 案，所述dsRNA命中至少两种靶基因，所述靶基因参与不同的细胞功能。例如，所述dsRNA 命中参与蛋白质合成（例如核糖体亚基）、细胞内蛋白质转运、细胞核mRNA剪接或者参与表 1A中所述功能之一的两种或更多种基因。
[0115] 优选地，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫靶基因包含选自以下的序 列：
[0116] (i)与如下表示的任意序列具有至少75%-致性的序列：SEQ ID N01，3,5,7， 9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互补序列，以及
[0117] (ii)包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：SEQ ID N01、3、5、7、9， 11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203， 208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605， 607.609.621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868， 873.878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101， 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481，或其互补序列，
[0118] 或者其中所述昆虫靶基因是包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 昆虫直系同源物：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040U161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460 或其互补序列。
[0119] 所述双链RNA中的dsRNA区域（或片段）可如下进行组合：
[0120] a)当组合那些靶向单一靶基因的多个dsRNA区域时，在RNA构建体中可以以原始 的顺序（即，该区域在靶基因中出现的顺序）对它们进行组合，
[0121] b)或者，可以不管所述片段的原始顺序，将它们随机地或有目的地以任意顺序组 合成双链RNA构建体，
[0122] c)或者，一种片段可以在所述dsRNA构建体中重复若干次，例如1?10次，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 次，或者
[0123] d)所述dsRNA区域（靶向一种或不同的靶基因）可以以有义或反义的方向进行组 合。
[0124] 另外，所述待组合的靶基因可选自以下种类的一种或多种基因：
[0125] e)上述"必需的"基因或"致病性基因"包括对于一种或多种靶昆虫来说关键性的 基因，当其被沉默时导致致死的或严重的（例如，进食、繁殖、生长）表型。选择强致死性靶 基因导致有效的RNAi效果。在本发明的RNA构建体中，靶向相同或不同的（非常有效的） 致死基因的多个dsRNA区域可以进行组合，以进一步增强RNAi作用在防治害虫中的效力、 功效或速度。
[0126] f) "弱"基因包括在本文所述的细胞途径之一中具有特别感兴趣的功能、但当其被 单独沉默时导致弱表型效果的靶基因。在本发明的RNA构建体中，靶向一种或不同弱基因 的多个dsRNA区域可以进行组合从而获得较强的RNAi效果。
[0127] g) "昆虫特异性"基因包括在非昆虫生物中没有显著同源性对应物的基因，其可以 通过生物信息同源性检索来确定，例如通过BLAST检索。选择昆虫特异性靶基因导致物种 特异性的RNAi作用，而在非靶生物中没有作用或没有显著的（不利）作用。
[0128] h) "保守基因"包括在靶生物和非靶生物之间（在氨基酸水平上）保守的基因。 为了降低对非靶物种的可能的作用，分析这些有效但保守的基因，并选择这些保守基因可 变区域的靶序列作为RNA构建体中的dsRNA区域的靶标。此时，在核酸序列水平评估保守 性。因此，这些可变区域包括保守靶基因中最不保守的部分（核酸序列水平）。
[0129] i) "保守途径"基因包括参与相同生物学途径或细胞过程的基因，或者包括在不同 昆虫物种中具有相同功能的基因，其导致特异性且有力的RNAi作用并更有效地防治昆虫；
[0130] j)或者，本发明的RNA构建体靶向来自不同生物学途径的多种基因，其导致广泛 的细胞RNAi作用并更有效地防治害虫。
[0131] 根据本发明，所有双链RNA区域包含与本文所述任何靶基因之至少一部分核苷酸 序列互补的至少一条链。然而，如果一个双链RNA区域包含与本文所述任一靶基因的核苷 酸序列一部分互补的至少一条链，则另一个双链RNA区域可包含与任何其它昆虫靶基因 (包括已知靶基因）的一部分互补的至少一条链。
[0132] 根据本发明的另一实施方案，提供了本文所述的分离的双链RNA或RNA构建体，其 还包含至少一种另外的序列以及任选地包含接头。在一个实施方案中，所述另一序列选自 ： (i)有利于大规模生产所述dsRNA构建体的序列；（ii)提高或降低所述dsRNA稳定性的序 列；（iii)允许结合蛋白质或其它分子从而有利于昆虫摄取所述RNA构建体的序列；（iv) 适配子序列，其结合昆虫表面上或细胞质中的受体或分子，从而有利于昆虫的摄取、胞吞和 /或转胞吞；或者（v)催化dsRNA区域加工的其它序列。在一个实施方案中，所述接头是条 件性自切割RNA序列，优选pH敏感性接头或疏水敏感性接头。在一个实施方案中，所述接 头是内含子。
[0133] 在一个实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域通过一个或多个接头 进行连接。在另一实施方案中，所述接头存在于所述RNA构建体中使得所述dsRNA区域与 另一目的区域分隔的位点。本发明提供了用于所述dsRNA构建体的不同类型接头。
[0134] 在另一实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域不使用接头而进行连 接。
[0135] 在本发明的一个具体实施方案中，所述接头可用于隔开害虫中多个较小的dsRNA 区域。有利的是，在该情形中所述接头序列可以在特定的条件下促使将长的dsRNA拆分为 较小的dsRNA区域，这导致在这些条件下释放单独的dsRNA区域，并且这些较小的dsRNA 区域导致更有效地基因沉默。适当的条件性自切割接头的实例是在高pH条件下自切割的 RNA 序列。这些 RNA 序列的适当实例由 Borda 等（Nucleic Acids Res. 2003Mayl5;31(10): 2595-600)描述，该文献通过参考并入本文中。所述序列源自锤头核酶HH16的催化核心。
[0136] 在本发明的另一方面，接头定位于所述RNA构建体中使得所述dsRNA区域与例如 另一目的序列分隔的位点，所述另一目的序列优选地向所述RNA构建体提供某种额外的功 能。
[0137] 在本发明的一个具体实施方案中，本发明的dsRNA构建体包含适配子从而有利于 昆虫摄取该dsRNA。设计所述适配子使之结合昆虫摄取的物质。这样的物质可来源于昆虫 或植物。适配子的一个具体实例是结合跨膜蛋白（例如，昆虫的跨膜蛋白）的适配子。或 者，所述适配子可以结合昆虫摄取的（植物）代谢物或营养物。
[0138] 或者，所述接头在内体中进行自切割。这在本发明的构建体通过胞吞作用或转胞 吞作用被昆虫摄取并因此在昆虫的内体中被区室化时可能是有利的。所述内体可具有低的 pH环境，导致所述接头被切害|]。
[0139] 当通过细胞壁转运从一个细胞向另一细胞转移时，例如当穿过昆虫害虫的细胞壁 时，上述在疏水条件中自切割的接头对于本发明的dsRNA构建体尤其有用。
[0140] 内含子也可用作接头。本文使用的"内含子"可以是信使RNA的任何非编码RNA序 列。用于本发明构建体的适当的具体内含子序列为⑴富含U(35-45%) ; (2)平均长度为 100bp (在约50和约500bp之间变化），可随机选择其碱基对或者可以基于已知的内含子序 列；（3)在5'端以-AG :GT-或-CG :GT-起始，和/或⑷在其3'端具有-AG :GC-或-AG : AA。
[0141] 约1个碱基对至约10, 000个碱基对的非互补RNA序列也可用作接头。
[0142] 不希望拘泥于任何特定的理论或机制，认为昆虫从其邻近的环境摄取长的双链 RNA。双链RNA被摄取进入肠道并转移至肠上皮细胞，然后通过内源核酸内切酶的作用在细 胞内加工成为短的双链RNA (称为小干扰RNA(siRNA))。然后，所得的siRNA通过形成多组 分的RNA酶复合体（称为RISC或RNA干扰性沉默复合体）来介导RNAi。
[0143] 为了实现在昆虫细胞内下调靶基因，加至细胞壁外部的双链RNA可以是可被摄取 进入细胞然后在细胞内加工成siRNA从而介导RNAi的任何dsRNA或dsRNA构建体，或者加 至细胞外部的RNA本身可以是可被摄取进入细胞从而指导RNAi的siRNA。
[0144] siRNA通常是短的双链RNA，其长度范围为19?25个碱基对，或20?24个碱基 对。在优选的实施方案中，可使用对应于待下调靶基因的siRNA，其具有19、20、21、22、23、 24或25个碱基对，尤其是21或22个碱基对。然而，本发明不意在限于这样的siRNA的用 途。
[0145] siRNA可以在双链部分侧翼的一端或两端包含单链突出端。在一个特别优选的 实施方案中，所述siRNA可包含3'突出的核苷酸，优选两个3'突出的胸苷（dTdT)或尿苷 (UU)。如果紧接所述dsRNA双链部分所包含序列的上游靶基因序列是AA，则在siRNA中可 包含3'TT或UU突出端。这使得所述siRNA中的TT或UU突出端与靶基因杂交。尽管所述 siRNA的另一端也可包含3' TT或UU突出端，然而所述siRNA双链部分所包含序列的下游 靶序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA嵌合体形式的siRNA也涵盖在内。这些 嵌合体包括：例如，包含具有3'DNA碱基突出端（例如，dTdT)的双链RNA的siRNA (如上所 述），以及其中一个或多个RNA碱基（或核糖核苷酸）或者甚至整条链上所有核糖核苷酸被 替换为DNA碱基（或脱氧核糖核苷酸）的多核苷酸形式的双链RNA。
[0146] 所述dsRNA可由通过（非共价）碱基配对退火到一起的两条单独的（有义和反义） RNA链形成。或者，所述dsRNA可具有折回的茎-环或发夹结构，其中所述dsRNA的两条退 火链是共价连接的。在该实施方案中，所述dsRNA的有义链和反义链由部分自我互补的单 个多核苷酸分子的不同区域形成。如果所述dsRNA欲通过体内表达（例如在如下所述的宿 主细胞或生物中）或通过体外转录进行合成，则具有该结构的RNA是方便的。除了不应当 破坏所述分子的双链部分介导RNAi的能力以外，连接所述两条RNA链的"环"的确切性质 和序列对于本发明来说通常是不重要的。用于RNAi中的"发夹"或"茎-环"RNA的特征通 常是本领域已知的（参见，例如CSIR0名下的W099/53050,其内容通过参考并入本文中）。 在本发明的另一些实施方案中，所述环结构可包含接头序列或如上所述的其它序列。
[0147] 所述双链RNA或构建体可以通过本身已知的方式进行制备。例如，可以使用本领 域公知的化学或酶促RNA合成技术在体外合成双链RNA。在一个方法中，可以分别合成两 条单独的RNA链，然后退火从而形成双链。在另一实施方案中，可以在宿主细胞或生物中从 适当的表达载体通过细胞内表达来合成双链RNA或构建体。以下将进一步详细地讨论该方 法。
[0148] 昆虫接触的所述双链RNA的量要能够实现特异性下调所述一种或多种靶基因。所 述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量被引入。然而，在某些实施方案中，较高剂量 (例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝）的双链1?^可得到更有效地抑制。对 于任意给定的昆虫基因靶标来说，可通过常规实验来确定有效抑制的最佳dsRNA量。
[0149] 所述昆虫可以以允许昆虫直接摄取所述双链RNA的任何适当的方式与所述双链 RNA接触。例如，所述昆虫可以接触纯净或基本纯净形式的所述双链RNA，例如含有所述 dsRNA的水溶液。在该实施方案中，可以仅用含有所述双链RNA的水溶液将所述昆虫"浸 湿"。在另一实施方案中，可通过用包含所述双链RNA的液体组合物向昆虫喷洒从而使所述 昆虫与所述双链RNA进行接触。
[0150] 或者，所述双链RNA可以与所述昆虫的食物组分（如哺乳动物病原性昆虫的食物 组分）连接，从而增强该昆虫对所述dsRNA的摄取。
[0151] 还可以将所述双链RNA掺入所述昆虫生长的培养基中，或者被该昆虫侵扰的物品 或基层中（或其上），或者浸入对昆虫侵害敏感的基层或物品中。
[0152] 根据另一实施方案，所述dsRNA表达在细菌或真菌的细胞中，并且所述细菌或真 菌的细胞被所述昆虫摄取或摄食。
[0153] 如实施例中举例说明的，可以改造细菌从而产生本发明的任何dsRNA或dsRNA构 建体。这些细菌可被昆虫摄食。一旦被摄取，所述dsRNA可以起始RNAi应答，其导致靶mRNA 降解并削弱或杀死摄食昆虫。
[0154] 因此，在更具体的实施方案中，所述双链RNA或RNA构建体通过原核的（如细菌） 或真核的（如酵母）宿主细胞或宿主生物来表达。根据该实施方案，可以使用能够表达 dsRNA或dsRNA构建体的任何细菌或酵母细胞。所述细菌选自革兰氏阴性细菌和革兰氏阳 性细菌，例如但不限于埃希氏菌属物种（Escherichia spp.)(例如，大肠杆菌（E.coli)、芽 孢杆菌属物种（Bacillus spp.)(例如，苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis))、根瘤菌属物 种（Rhizobium spp·)、乳杆菌属物种（Lactobacillus spp·)、乳球菌属物种（Lactococcus spp.)等。所述酵母可选自酵母属物种（Saccharomyces spp.)等。
[0155] 某些细菌与宿主植物具有非常紧密的相互作用，例如但不限于共生的根瘤菌与豆 科植物（Legminosea)(例如，大豆）。这样的重组细菌可以与种子混合（例如，作为涂层） 并用作土壤改良剂。
[0156] 因此，本发明还包括包含本文所述的任何核苷酸序列或重组DNA构建体的细胞。 本发明还包括原核细胞（例如但不限于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞）和真核细胞 (例如但不限于酵母细胞或植物细胞）。优选地，所述细胞是细菌细胞或酵母细胞或藻类细 胞。
[0157] 在另一些实施方案中，所述昆虫可以与本文进一步描述的组合物接触。除了所述 dsRNA或DNA，所述组合物还可包含赋形剂、稀释剂或载体。这样的组合物的优选特征在以 下更详细地讨论。
[0158] 或者，可以将产生dsRNA的细菌或酵母细胞直接喷洒到作物上。
[0159] 因此，如上所述，本发明提供包含本发明的RNA构建体和/或DNA构建体和/或表 达构建体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是细菌或酵母的细胞，也可以是例如病毒。可 以使用特异性感染昆虫的病毒（如杆状病毒）。这确保了对哺乳动物（尤其是人类）的安 全性，因为所述病毒不会感染哺乳动物，所以不会发生不希望的RNAi作用。
[0160] 优选地，所述细菌细胞或酵母细胞在用作生物杀虫剂前应被灭活，例如当该试剂 用于人类或其它哺乳动物可能接触的环境（如厨房）时。可通过任何方法实现灭活，如通 过热处理、苯酚或甲醛处理，或通过机械处理。
[0161] 在一个可替代的实施方案中，可利用灭活的病毒（如适当修饰的杆状病毒）来递 送本发明的dsRNA区域用于介导昆虫害虫的RNAi。
[0162] 可能的应用包括集中的温室培育（例如从GM0角度而言意义较小的作物）以及更 广泛的农田作物（如大豆）。
[0163] 该方法具有几个优势，例如：因为不存在可能的植物宿主切割（dicing)的问题， 所以它允许将大的dsRNA片段递送进入摄食害虫的肠内腔；使用细菌作为杀虫剂不涉及产 生转基因作物，尤其是对于某些难以获得转基因变体的作物；存在广泛和灵活的应用，因为 可以在同一块农田上同时处理不同的作物和/或可以同时靶向不同的害虫，例如通过组合 那些产生不同dsRNA的不同细菌。
[0164] 本发明的另一方面是本文公开的昆虫靶基因的靶核苷酸序列。所述靶核苷酸序列 对于设计本发明的dsRNA构建体特别重要。这些靶核苷酸序列的长度优选至少17、优选至 少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个核苷酸。优选靶核苷酸序列的非限制性实例 在实施例中给出。
[0165] 根据一个实施方案，本发明提供了编码本文所述的双链RNA或双链RNA构建体的 分离的核苷酸序列。
[0166] 根据一个更具体的实施方案，本发明涉及由如下表示的任意序列组成的分离的核 酸序列：SEQ ID N049 至 158、275 至 472、533 至 575、621 至 767、813 至 862、908 至 1040、 1161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460,或者其至少 17、优选至少 18、19、20 或21、更优选至少22、23或24个核苷酸的片段。
[0167] 本领域技术人员会认识到，可以找到这些靶基因的同源物，并且这些同源物也用 于本发明的方法。
[0168] 如果蛋白质或核苷酸序列显示"显著"水平的序列相似性或更优选地序列一致 性，则它们可能是同源的。真正同源的序列通过从共同的祖先基因趋异从而具有相关性。 序列同源物可以有两种类型：（i)当同源物存在于不同物种中时，它们被称为直系同源物 (orthologue)。例如，小鼠和人中的α-珠蛋白基因是直系同源物。（ii)旁系同源物是在一 个物种内部的同源基因，例如小鼠中的α-和β-珠蛋白基因是旁系同源物（paralogue)。
[0169] 优选的同源物是包含与选自如下表示的序列具有至少约85 %或87. 5 %，更优选 约90%，更优选至少约95%以及最优选至少约99%-致性的序列的基因 ：SEQ ID N01，3， 5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198， 203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483， 488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071， 1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101, 1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602， 1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677， 1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040， 2045,2050,2055,2060,2065,2070, 2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102, 2104, 2106， 2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列。用于确定序列一致性的方法是本领域 常规的，其包括使用 Blast 软件和 EMBOSS 软件（The European Molecular Biology Open Software Suite(2000), Rice, P.Longden, I.and Bleasby, A.Trends in Geneticsl6, (6) PP276-277)。本文使用的术语"一致性"是指序列之间在核苷酸水平上的关系。通过在比 较窗中对最优比对的序列（例如，两条或更多）进行比较来确定"一致性百分比"，其中所述 比较窗中的序列部分与最优序列比对的参考序列相比可包含插入或缺失。所述参考序列不 包含插入或缺失。所述参考窗选自至少10个连续核苷酸至约50、约100或者至约150个核 苷酸，优选约50?150个核苷酸。然后，通过测定所述窗中的序列之间一致的核苷酸数目 并将该数目除以所述窗中的核苷酸数并乘以100来计算"一致性百分比"。
[0170] 另一些同源物是包含如下表示的任意序列的等位基因 ：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll， 13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208， 215,220,225,230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493， 498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607， 609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873， 878.883.888.890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073， 1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103， 1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607， 1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682， 1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045， 2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108, 2120 至 2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460， 2461，2466，2471，2476或2481。另一些优选的同源物是与包含如下表示的任意序列的基因 相比包含至少一种单核苷酸多态性（SNP)的基因 ：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19， 21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225， 230,247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513， 515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767， 768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888， 890.892.894.896.908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359,2364, 2366, 2368, 2370, 2372,2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481。
[0171] 根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序列的基因的 昆虫直系同源物的靶基因 ：SEQ ID 吣1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49 至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253， 255.257.259.275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788， 793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087， 1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571， 1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642， 1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359， 2364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481。举例来说，直 系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N049至123、275至434、533至562、 621 至 738、813 至 852、908 至 1010U161 至 1437U730 至 1987、2120 至 2290 以及 2384 至 2438,或其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。表4中给出了包 含本发明所述序列之一的至少17bp片段的昆虫或蛛形纲直系同源物基因或序列的非限制 性列表。
[0172] 根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序列的基因的 线虫直系同源物的靶基因：1、3、5, 7,9,11，13,15,17,19, 21，23,49 至 158,159,160-163， 168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257， 259.275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091， 1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577， 1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652， 1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700， 1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090， 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366， 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 248。举例来说，线虫直系同源物 可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N0124至135、435至446、563至564、739至 751、853、854、1011 至 1025U438 至 1473U988 至 200U2291 至 2298、2439 或 2440,或者其 至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段。根据另一方面，本发明因此包括本文所述的用于 控制线虫在生物中生长的任何方法，或者用于防止线虫侵害对线虫感染敏感的生物的任何 方法，所述方法包括将线虫细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其 中一条退火互补链包含与祀基因的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其包含如 下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段 ：SEQIDN0124至135、435 至 446、563 至 564、739 至 751、853、854、1011 至 1025U438 至 1473U988 至 200U2291 至 2298、2439或2440,所述双链RNA被线虫摄取并因此控制生长或防止侵害。表5中给出了 包含本发明的序列之一的至少17bp片段的线虫直系同源物基因或序列的非限制性列表。
[0173] 根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表不的任意核苷酸序列的基因的 真菌直系同源物的靶基因：1、3、5、7、9,11，13,15,17,19, 21，23,49 至 158,159,160-163， 168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251，253,255,257， 259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，566,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091， 1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577， 1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652， 1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700， 1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090， 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366， 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476 或 2481。举例来说，真菌直系同源 物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID N0136至158、447至472、565至575、752至 767、855 至 862U026 至 1040U475 至 157U2002 至 2039、2299 至 2338、2441 至 2460,或者 其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。根据另一方面，本发明因 此包括本文所述的用于控制真菌在细胞或生物上的生长、或者用于防止真菌侵害对真菌感 染敏感的细胞或生物的任何方法，该方法包括将真菌细胞与双链RNA接触，其中所述双链 RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与祀基因的核苷酸序列之至少一部分互 补的核苷酸序列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段： SEQ ID N0136 至 158、447 至 472、565 至 575、752 至 767、855 至 862U026 至 1040、1475 至 157U2002至2039、2299至2338、2441至2460,所述双链RNA被真菌摄取并因此控制生长 或防止侵害。表6中给出了包含本发明的序列之一的至少17bp片段的真菌直系同源物基 因或序列的非限制性列表。
[0174] 术语"调节序列"涉及较宽的范围，其指能够实现与其有效连接之序列的表达的调 节性核酸。
[0175] 上述术语包括激活或增强核酸表达的启动子和核酸或其合成的融合分子或衍生 物，称为激活子或增强子。本文使用的术语"有效连接"是指在"启动子"序列与目的核酸 分子之间的功能性连接，使得所述"启动子"序列能够起始核酸分子转录从而产生适当的 dsRNA〇
[0176] 优选的调节序列是启动子，其可以是组成型或诱导型启动子。优选的启动子是诱 导型启动子，从而严格控制所述RNA分子的表达。优选可通过使用适当的化学试剂（如 IPTG)来诱导的启动子。或者，将编码所述RNA分子的转基因置于强组成型启动子的控制 下。优选地，所使用的任何启动子将指导所述RNA强烈表达。所使用启动子的性质可部分 地由用于产生所述RNA的特定宿主细胞来决定。在一个实施方案中，所述调节序列包含噬 菌体启动子，如T7、T3、SV40或SP6启动子，最优选T7启动子。在本发明的另一些实施方案 中，使用用于表达RNA的另一些启动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II 或RNA聚合酶III的启动子。也可以酌情使用来源于酵母或病毒基因的其它启动子。
[0177] 在一个可替代的实施方案中，所述调节序列包含启动子，该启动子选自公知的 tac、trc和lac启动子。适用于细菌宿主的诱导型启动子包括β -内酰胺酶启动子、大肠 杆菌λ噬菌体PL和PR启动子以及大肠杆菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子和碱性磷酸 酶启动子。因此，本发明还包括用于得到本发明的任何RNA分子或RNA构建体的方法。该 方法包括以下步骤：在允许所述核酸或重组（DNA)构建体转录从而产生下调目的靶基因的 RNA (当所述宿主细胞被靶生物摄食时，或者当宿主细胞或从其来源的提取物被靶生物摄取 时）的条件下，将本发明的分离的核酸或重组（DNA)构建体引入（例如，通过转化、转染或 注射）本发明的宿主细胞中。
[0178] 任选地，也可以将一种或多种转录终止序列或"终止子"引入本发明的重组构建体 中。术语"转录终止序列"包括转录单元末端的控制序列，其发出初级转录物的3'加工和 多聚腺苷酸化作用以及转录终止的信号。所述转录终止序列用于防止转录的连读，从而所 述RNA分子在宿主细胞中或者由宿主细胞正确地产生。在一个实施方案中，所述终止子包 括T7、T3、SV40或SP6终止子，优选T7终止子。也可以酌情使用来源于酵母或病毒基因的 其它终止子。
[0179] 可以将另外的调节元件（如转录或翻译的增强子）引入所述表达构建体中。
[0180] 本发明的重组构建体还可包含在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起 点。一个实例是表达构建体需要作为细胞中的附加型遗传元件（例如，质粒或粘粒分子） 在细菌细胞中维持的情形。优选的复制起点包括但不限于fl-ori和colElori。
[0181] 所述重组构建体任选地可包含选择性标记基因。本文使用的术语"选择性标记基 因"包括赋予细胞一种表型的任何基因，该基因在所述细胞中表达从而有利于鉴定和/或选 择用本发明的重组（表达）构建体转染或转化的细胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨 苄青霉素的基因（Ampr)、抗四环素的基因（Ter)、抗卡那霉素的基因（Kanr)、抗膦丝菌素的 基因和抗氯霉素的基因（CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例如manA。还可 使用可见的标记基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶（GUS)、萤光素酶和绿色荧光蛋白（GFP)。
[0182] 在本发明的另一些实施方案中，使用可用于表达dsRNA的另一些启动子，其包括 但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚 合酶的启动子。这些启动子通常用于体外产生dsRNA，然后将所述dsRNA包含在杀虫剂 (antiinsecticidal agent)中，例如在杀虫剂液体、喷雾剂或粉末中。
[0183] 因此，本发明还包括用于产生本发明的任何双链RNA或RNA构建体的方法。该方 法包括以下步骤：
[0184] a.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体与无细胞组分接触；或者
[0185] b.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体引入（例如，通过转化、转染或注射） 细胞，
[0186] 以上在允许所述核酸或重组DNA构建体转录从而产生所述dsRNA或RNA构建体的 条件下进行。
[0187] 任选地，本发明的重组构建体中还可以引入一种或多种转录终止序列。术语"转录 终止序列"包括转录单元末端的控制序列，其发出初级转录物的3'加工和多聚腺苷酸化作 用以及转录终止的信号。可将另一些调节元件（如转录或翻译的增强子）引入所述表达构 建体。
[0188] 本发明的重组构建体还可包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起 点。一个实例是表达构建体需要作为细胞中的附加型遗传元件（例如，质粒或粘粒分子） 在细菌细胞中维持。优选的复制起点包括但不限于Π -ori和colElori。
[0189] 所述重组构建体任选地可包含选择性标记基因。本文使用的术语"选择性标记基 因"包括赋予细胞以表型的任何基因，该基因在所述细胞中表达从而有利于鉴定和/或选择 经本发明的重组（表达）构建体转染或转化的细胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨苄 青霉素的基因（Ampr)、抗四环素的基因（Ter)、抗卡那霉素的基因（Kanr)、抗膦丝菌素的基 因和抗氯霉素的基因（CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例如manA。还可使 用可见的标记基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶（GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP)。
[0190] 本发明涉及用于阻止昆虫在植物上生长或用于防止昆虫侵害植物的方法。根据 本发明的方法待处理的植物包括选自以下的植物：苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香 蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰菜、 谷类、芹菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘（clemintine)、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、 桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、莴苣、亜、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒 果、瓜、小米、蘑菇、燕麦（nut aot)、菜秋葵、洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、 豌豆、桃、花生、豌豆（peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝 卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、黄豆（soy)、大豆（soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘 蔗、向日葵、红薯、橘子、茶、烟草、番茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药或西葫芦；优选马铃薯、 茄子、番爺、胡椒、烟草、醋栗、稻米或棉花植物），或者种子或块茎（例如，苜蓿、苹果、杏、朝 鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡 萝卜、木薯、花椰菜、谷类、芹菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、 菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、称猴桃、莴苣、·、梓檬、莱姆酸橙、松树、玉 米、芒果、瓜、小米、蘑燕、燕麦（nut aot)、菜秋葵、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧疗、 豌豆、桃、花生、豌豆（peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝 卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、大豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、 橘子、茶、烟草、番茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药或西葫芦。
[0191] 所述靶生物摄取（优选摄食）靶向RNA的量要实现特异性下调一种或多种靶基 因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量在宿主细胞中表达。然而，在某些实施 方案中，较高剂量（例如，每个靶生物细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝）的双链1?^ 可得到更有效的抑制。对于任意给定的靶基因和靶生物来说，可通过常规实验来确定有效 抑制的靶标RNA分子的最佳量。
[0192] 所述靶生物可以以任何适当的方式与表达所述RNA分子的宿主细胞接触，从而允 许靶生物摄食。优选地，表达所述dsRNA的宿主细胞可以与所述靶生物的食物组分连接，从 而增强该靶生物对所述dsRNA进行摄取。还可以将表达所述dsRNA的宿主细胞引入所述靶 生物生长的培养基中，或者被害虫生物侵扰的物品或基层中（或其上），或者浸入对害虫生 物侵害敏感的基层或物品中。
[0193] 在可替代的实施方案中，可使用源自表达所述RNA分子的宿主细胞的适当提取物 来实现下调靶生物中的靶基因。此时，所述提取物可以通过裂解表达所述RNA分子的宿主 细胞的任何适当的方法来产生。例如，可以使用如超声处理、弗氏压碎（French press)、冻 融和溶菌酶处理的技术（参见 Sambrook and Russell-Molecular Cloning A laboratory manual-third edition以及表15-4中提供的参考文献）来制备宿主细胞粗提物（裂解 物）。可以酌情对该提取物进行进一步纯化，只要所述提取物介导靶基因表达的靶向下调的 能力不受不利影响即可。例如可以使用亲和纯化。向所述提取物添加某些成分以防止RNA 分子降解可能也是合适的。例如，可以向源自表达RNA的宿主细胞的提取物添加 RNA酶抑 制剂。在一个实例中，所述靶生物可以接触纯净或基本纯净形式的表达RNA的宿主细胞，例 如含有所述细胞提取物的水溶液。在该实施方案中，可以简单地用含有所述宿主细胞提取 物的水溶液将所述靶生物（尤其是害虫生物，如昆虫）"浸湿"。在另一实施方案中，可通过 用包含所述细胞提取物的液体组合物向所述靶生物喷洒从而使所述靶生物与所述表达RNA 分子的宿主细胞进行接触。
[0194] 如果使用本发明的方法来特异性控制特定害虫的生长或侵害，则优选宿主细胞中 表达的RNA不与非害虫生物的基因具有任何显著的同源性，尤其是不与非害虫生物的任何 必需基因具有任何显著的同源性。因此，所述非害虫生物通常是对害虫侵害敏感的生物，为 此根据本发明的方法保护所述非害虫生物免受所述害虫侵害。因此，例如，非害虫物种可包 括植物或哺乳动物物种。优选地，所述哺乳动物物种为人类。所述非靶物种还可包括除了 人以外的动物，其可以暴露于所述保护免受侵害的生物或基层。实例包括鸟类（其可以以 被保护的植物为食）以及牲畜和家畜（如猫、犬、马、牛、鸡、猪、绵羊等）。在这种情况下， 优选所述dsRNA与敏感生物或非靶生物的任一基因的核酸序列一致性低于30%，更优选低 于20 %，更优选低于10 %，甚至更优选低于5 %。序列一致性百分比应当在所述靶标RNA的 全长区域上来计算。如果可获得本发明待保护生物或任一非靶生物的基因组序列数据，则 可以使用标准生物信息学工具来相互校验与所述靶标RNA的序列一致性。在一个实施方案 中，所述RNA分子与非害虫生物的基因之间不存在21个连续核苷酸上的序列一致性，即在 这种情况下，优选所述非害虫生物的基因组中不存在所述RNA的21个连续核苷酸。在另一 实施方案中，所述RNA与非害虫（敏感的）物种的任一核苷酸序列之间在24个连续核苷酸 上的序列一致性低于约10%或低于约12. 5%。特别地，可以特别注意非害虫物种的直向同 源基因，因为所述害虫生物的必需基因常可成为本发明的方法的靶标。因此，在一个实施方 案中，所述RNA分子与非害虫物种直向同源基因的对应核苷酸序列具有低于12. 5%的序列 一致性。
[0195] 在另一实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或降低昆虫侵害的 组合物，该组合物包含至少一种双链RNA，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条 退火互补链包含与昆虫靶基因的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。本发明还涉 及包含本文所述的至少一种核苷酸序列或至少一种重组DNA构建体的组合物。本发明还涉 及包含至少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的 至少一种双链RNA或双链RNA构建体，或者表达本文所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA 构建体。任选地，所述组合物还包含至少一种适当的载体、赋形剂或稀释剂。所述靶基因可 以是本文所述的任一靶基因。优选地，所述昆虫靶基因是昆虫生存、生长、发育或繁殖所必 需的。
[0196] 另一方面，本发明涉及如上所述的组合物，其中所述昆虫靶基因包含与选自如 下表示的的任意序列具有至少75 %，优选至少80 %、85 %、90 %，更优选至少95 %、98 % 或99%的一致性的序列：SEQIDN01，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49 至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249， 251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517， 519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773， 778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892， 894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476， 2481或2486,或其互补序列，或者其中所述昆虫靶基因是包含如下表示的任意序列之至 少17个连续核苷酸的基因的昆虫直系同源物：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21， 23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230， 240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883， 888,890,892,894,896,908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090,2095, 2100, 2102, 2104, 2106,2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466， 2471，2476, 2481或2486,或其互补序列。
[0197] 本发明还涉及组合物，其包含至少一种双链RNA、至少一种双链RNA构建体、至少 一种核苷酸序列、至少一种重组DNA构建体和/或至少一种表达本发明的dsRNA的宿主细 胞（例如，细菌细胞或酵母），或者编码本发明的dsRNA的病毒，任选地还包含至少一种适当 的载体、赋形剂或稀释剂。
[0198] 所述组合物可以采用向昆虫应用的任何适当的物理形式。例如，所述组合物可以 采用固体形式（如粉剂、丸剂或饵剂）、液体形式（如，喷雾剂）或凝胶形式。
[0199] 根据非常优选的实施方案，所述组合物采用适于昆虫摄食的形式。
[0200] 所述组合物可包含另外的组分，所述组分作用于在组合物长期储存期间稳定所述 dsRNA和/或防止dsRNA降解。
[0201] 所述组合物还可包含增强或促进昆虫摄取所述dsRNA的组分。这些可包括例如通 常促进RNA摄取进入细胞的化学试剂，例如lipofectamin (脂转染胺）等。
[0202] 所述组合物还可包含在长期储存期间保持所述宿主细胞生存力的组分。
[0203] 所述组合物可采取向昆虫、基层、细胞（例如，植物细胞）或者被昆虫感染的或对 昆虫侵害敏感的生物应用的任何适当的物理形式。
[0204] 在一个实施方案中，所述组合物可以采用喷雾剂的形式。因此，使用者可以直接用 该组合物喷洒昆虫或基层。
[0205] 因此，本发明涉及喷雾剂，其包含含有至少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所 述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链RNA或双链RNA构建体，或表达本文 所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA构建体。更特别地，本发明涉及如上定义的喷雾剂， 其中所述细菌细胞包含如下表示的任意序列之至少一种序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll， 13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208， 215,220,225,230,240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488， 493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603， 605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863， 868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099， 1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597， 1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672， 1677.1682.1684.1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039， 2040,2045, 2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080, 2085,2090,2095,2100,2102,2104， 2106, 2108, 2120 至 2338,2339, 2344, 2349, 2354, 2359,2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至2460，2461，2466，2471，2476、2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。优选地，所 述喷雾剂包含至少一种如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21， 23,49 至 158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230， 240 至 247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883， 888,890,892,894,896,908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075， 1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105， 1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612， 1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684， 1686.1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050， 2055, 2060, 2065, 2070,2075, 2080, 2085, 2090, 2095,2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466， 2471，2476、2481或2486,或其至少17个连续核苷酸的片段。
[0206] 本发明还涉及喷雾剂，其包含本文所述的至少一种组合物或者包含至少一种宿主 细胞，还包含至少一种佐剂以及任选地至少一种表面活性剂。
[0207] 杀虫剂的有效性可取决于所述喷雾剂应用的有效性。佐剂可以减少或消除喷雾剂 应用的许多问题，所述问题与杀虫剂的稳定性、溶解度、不相容性、悬浮、泡沫形成、飘移、蒸 发、挥发、降解、粘附、渗透、表面张力和覆盖范围有关。将佐剂设计成实现特定的功能，包括 润湿、分散（spread)、粘着、降低蒸发、降低挥发、缓冲、乳化、散布（disperse)、降低喷雾剂 飘移以及减少泡沫形成。没有一种佐剂可以实现所有这些功能，然而常常可以将不同的相 容性佐剂进行组合来同时实现多种功能。这些化学品（也叫作润湿剂和分散剂）从物理上 改变了喷雾剂液滴的表面张力。为了使杀虫剂正确地发挥其功能，喷雾剂液滴必须能够使 叶子润湿并在叶上均匀散开。表面活性剂扩大了杀虫剂覆盖的范围，从而增加了害虫接触 化学试剂的机会。将杀虫剂施加于蜡质或具毛的叶时，表面活性剂尤为重要。不进行适当 的润湿和分散，则喷雾剂液滴常常流失或者不能充分地覆盖这些表面。然而，过多的表面活 性剂可导致过度的流失或沉淀损失，因此降低了杀虫剂的功效。杀虫剂配方常包含表面活 性剂以改进该杀虫剂活性成分的悬浮。这尤其用于可乳化浓缩物（EC)配方。
[0208] 本文使用的术语"佐剂"指添加至杀虫剂产品或杀虫剂喷雾剂混合物以改进喷雾 箱中产品的混合和稳定性以及应用的任何非杀虫剂材料。本文另外使用的术语"表面活性 剂"指改变表表面张力的化学试剂。表面活性剂可以影响液体的润湿和分散，并且可以改变 杀虫剂在水中的分散、悬浮或沉淀。存在非离子型表面活性剂（不带电荷）、阴离子表面活 性剂（负电荷）和阳离子表面活性剂（正电荷）。
[0209] 在特别的实施方案中，所述喷雾剂中包含的所述宿主细胞是灭活的，例如通过热 灭活或者机械破坏（如本文所详细讨论地）来实现。
[0210] 所述赋形剂的性质和所述组合物的物理形式可根据期望处理的基层的性质而变 化。例如，所述组合物可以是被刷至或喷洒至待处理的物品或基层上或者压印至待处理的 物品或基层中的液体，抑或是应用于待处理的物品或基层的涂层或粉末。因此，在一个实施 方案中，所述组合物在适当的表面上采用涂层的形式，其粘附昆虫并最终被接触该涂层的 昆虫所摄取。
[0211] 根据一个优选的实施方案，所述基层是意在针对昆虫害虫侵害而进行处理的植物 或作物。然后，所述组合物被昆虫内化或摄食，在其中该组合物可以介导RNA干扰，从而防 治昆虫。所述喷雾剂优选为加压的/气雾状的喷雾剂或泵式喷雾剂。所述颗粒可以采取适 当的大小，从而其粘附于待处理的基层或者粘附于昆虫，例如粘附于昆虫和/或蛛形纲动 物的外骨骼，并可以从此处被吸收。
[0212] 在一个实施方案中，所述组合物采用饵剂的形式。设计所述饵剂使之引诱昆虫与 所述组合物接触。一旦接触后，所述组合物被昆虫内化（例如通过摄食）并介导RNAi从而 杀死昆虫。所述饵剂可包含食物，如基于蛋白质的食物，例如鱼粉。也可以使用硼酸作为饵 齐U。所述饵剂可取决于作为靶标的物种。还可以使用引诱剂。所述引诱剂可以是信息素， 例如雄性或雌性信息素。作为一个实例，本发明可使用《昆虫信息素及其在害虫管理中的 应用(Insect Pheremones and their use in Pest Management)》（Howse et a 1, Chapman and Hall, 1998)中提及的信息素。所述引诱剂将昆虫引诱至所述饵剂，并可以靶向特定昆 虫或可以引诱所有昆虫。所述饵剂可采用任何适当的形式，如固体、糊剂、丸剂或粉剂形式。
[0213] 所述饵剂还可被昆虫携带回群体。然后，该饵剂可以作为群体中其它成员的食物 来源，因而对大量昆虫并且可能对整个昆虫害虫群体实现有效控制。使用双链RNA或表达 本发明的dsRNA的细菌是有利的，因为RNAi介导的对害虫影响的延迟作用使饵剂被携带回 群体，从而实现了在接触昆虫方面的最大影响。
[0214] 另外，与所述昆虫接触的组合物可残留在该昆虫的角质层上。当清洁（一只昆虫 清洁其自身或昆虫相互清洁）时，所述组合物可以被摄取，并可以因此介导其在昆虫中的 作用。这需要所述组合物足够稳定，从而即使暴露于外界环境条件一段时间（例如，可以是 几天）后，所述dsRNA或表达dsRNA的宿主细胞仍保持完好并能够介导RNAi。
[0215] 所述饵剂可以以适当的"外罩"或"陷阱"来提供。这样的外罩和陷阱是市售的， 并且现有的陷阱可适于包含本发明的组合物。本发明的范围包括可吸引昆虫进入的任何 外罩或陷阱。所述外罩或陷阱可以例如是盒形的，并且可以例如以预成型状态提供或者可 以由可折叠纸板形成。用于外罩或陷阱的适当的材料包括塑料和纸板，尤其是瓦楞纸板 (corrugated cardboard)。这样的外罩或陷讲的合适尺寸为例如7_15cm宽，15_20cm长以 及l-5cm高。所述陷阱的内表面可覆盖粘性物质，使得昆虫一旦进入该陷阱则被限制移动。 所述外罩或陷阱可包含适当的槽，所述槽的内部可以在适当的位置装有所述饵剂。陷阱不 同于外罩是因为昆虫在进入后不能轻易地逃离陷阱，而外罩作为"饲喂处"，其向昆虫蛛形 纲动物提供较佳的环境，在其中它们可以进食并且感觉远离捕食者的安全感。
[0216] 因此，本发明的另一方面提供了针对昆虫的外罩或陷阱，其包含本发明的组合物， 该组合物可以合并本文所述组合物的任何特征。
[0217] 本发明的"组合物"可以是"组合试剂盒（kit-of-parts) "，其包含一个容器中的 所述双链RNA以及一个单独容器中的针对含有RNA的实体（如dsRNA或dsRNA构建体、DNA 构建体、表达构建体）的适当稀释剂、赋形剂或载体；或者包含一个容器中的宿主细胞以及 一个单独容器中的针对该宿主细胞的适当稀释剂、赋形剂、载体或防腐剂。本发明还涉及提 供单独的双链RNA或宿主细胞，而没有任何其它组分。在这些实施方案中，所述dsRNA或宿 主细胞可以以浓缩形式来提供，如浓缩的水溶液。它甚至可以以冷冻形式或者以冻干形式 来提供。后者对于长期保藏来说可能更稳定，并且可以在临使用前被解冻和/或用适当的 稀释剂复原。
[0218] 本发明还包括在基层上控制害虫生物的生长和/或防止敏感生物被害虫生物侵 害的方法，其包括向所述基层应用本文所述的有效量的任何组合物和/或喷雾剂。
[0219] 本发明还包括用于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病或病症的方法，其包括向 有此治疗和/或预防需要的对象施用本文所述的组合物或喷雾剂，其中由所述组合物或喷 雾剂造成的所述靶生物中靶基因的表达下调对于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病是 有效的。优选的靶生物是害虫，尤其是本文详细描述的昆虫。
[0220] 本发明还涉及本文所述的任何双链RNA、双链RNA构建体、核苷酸序列、重组DNA构 建体或组合物的医学用途。
[0221] 昆虫和另一些节肢动物可通过其叮咬或螫刺而导致损伤甚至死亡。在美国，每年 由于蜜蜂和黄蜂螫伤而死亡的人比被蛇咬伤而死亡的人更多。许多昆虫可以传播导致疾病 的细菌和其它病原体。在每次国家间大规模战争期间，由于昆虫传播的疾病而受伤或死去 的人比由于子弹和炸弹而受伤或死去的人更多。叮咬人和家畜的昆虫大多是具有如半翅目 和某些双翅目昆虫中所见的刺吸式口器的昆虫。叮咬引起的主要不适是由昆虫注入对象的 酶所致。蜱和恙螨是不同种类的螨（蛛形纲），其以动物血液为食。蜱还可以传播导致疾 病的病毒和另一些病原体，所述疾病包括莱姆病和落肌山斑疫热。另一些种类的螨可引起 人、犬、猫和其它动物的兽挤癣。半翅目包括床風、接吻虫（kissing bug)和猎蝽（assassin bug)，所有这些昆虫具有用于刺入其宿主的喙。所有昆虫中最疼痛的叮咬是猎蝽的叮咬。 在中美州和南美洲，接吻虫参与导致查加斯病。某些蛾的毛虫可以"螫刺"。双翅目是影响 人类的最重要的昆虫目。叮咬飞虫（biting flies)包括多种蚊、蚋、biting gnats、蛇等。 这些叮咬飞虫中有许多是疾病的传播者，如传播非洲睡眠病的舌蝇。具有舐吸式口器的蝇 (如家蝇）也传播导致伤寒热及另一些疾病的细菌和其它病原体。蛆是这两种侵入动物活 组织的飞虫的幼虫。蚊子传播导致疟疾、黄热病、脑炎和另一些疾病的病原体。疟疾由原生 动物寄生物导致，所述原生动物寄生物的部分生活周期生活在按蚊属蚊中，部分生活周期 生活在人中。鼠疫也叫作腺鼠疫或黑死病，由感染大鼠及另一些啮齿动物的细菌导致。该 疾病针对人的主要转播者是东方具带病蚤（Oriental rat flea)(蚤目）。许多蜜蜂、黄蜂 和蚂蚁（膜翅目）可通过其螫刺导致疼痛甚至死亡。死亡通常是对毒物的变态反应的结 果。其它重要的螫刺动物包括大黄蜂（hornets)、小黄蜂（yellow jackets)和胡蜂（paper wasps)。非洲化蜜蜂（Africanized honey bee)或"杀人蜂"（"killer"bee)是人类驯化 的蜜蜂品系。这两种品系在外观上几乎相同。然而，非洲化蜜蜂品系更具攻击性，并且以更 大的数目进行攻击。
[0222] 在一个具体的实施方案中，所述组合物是分别用于治疗或预防人类或动物的昆虫 疾病或感染的药物组合物或兽用药组合物。这样的组合物包含至少一种双链RNA或RNA构 建体，或者编码所述双链RNA或RNA构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体（其中所述双 链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与导致所述疾病或感染的昆虫靶基因 的靶核苷酸序列互补的核苷酸序列）以及适用于药物用途的至少一种载体、赋形剂或稀释 剂。
[0223] 所述组合物可以是适于局部使用的组合物，如应用在动物或人的皮肤上，例如应 用于皮肤的液体组合物（滴剂、凝胶剂、气雾剂），或者通过刷、或喷雾剂、乳剂、软膏等用于 局部应用，或者作为透皮贴剂。
[0224] 或者，所述昆虫dsRNA由细菌（例如，乳杆菌属）或真菌（例如酵母属 (Sacharomyces)物种）产生，其可以包含在食物中并作为抗御昆虫感染的口服疫苗。
[0225] 也可以制备成其它常规的药物剂型，包括片剂、胶囊、阴道栓剂、透皮贴剂、栓剂 等。所选形式取决于靶昆虫的性质以及期望治疗的疾病的性质。
[0226] 在一个具体的实施方案中，所述组合物可以是涂层、糊剂或粉剂，其可以应用于基 层从而保护所述基层免受昆虫和/或蛛形纲动物的侵害。在该实施方案中，可使用所述 组合物保护对昆虫侵害或昆虫造成的破坏敏感的任何基层或物品，例如食物及其它易腐 物品，以及基层（如木材）。白蚁、粉蠹甲虫和木匠蚁可破坏房屋及其它木制品。散白蚁 (subterranean termite)和台湾乳白蚁（Formosan termite)是美国南部和热带地区最严 重的房屋害虫。昆虫可以袭击任何收获的植物或动物产品。面象虫、谷类象鼻虫、谷螟及其 它储藏品害虫以储藏的粮食、谷类、宠物食品、巧克力粉以及厨房食品柜中未得到保护的几 乎所有其它食物为食。衣服蛀虫的幼虫蛀蚀由动物产品（如毛皮、丝和羊毛）制成的衣服。 地毯甲虫的幼虫蛀蚀动物和植物产品，包括皮革、毛皮、棉花、储存的粮食甚至博物馆标本。 书虱和蠹虫是图书馆的害虫。这些昆虫蛀蚀书装订处的淀粉胶。侵入房屋的其它昆虫包括 蟑螂，其摄食几乎任何东西。蟑螂不被认为是疾病的特定传播者，但是它们污染食物并带有 令人不悦的气味。它们非常令人讨厌，许多害虫防治公司致力于尝试对它们进行防治。在 房屋、食品商店和饭店中的最常见的蟑螂包括德国小蠊、美洲大蠊、东方蜚蠊和长须蜚蠊。
[0227] 所述组合物的赋形剂和物理形式的性质可取决于期望处理的基层的性质而有所 变化。例如，所述组合物可以是被刷或喷洒至待处理的物品或基层上的液体，或者压印至待 处理的物品或基层中的液体，或者是应用至待处理的物品或基层的涂层。
[0228] 本发明还包括用于处理和/或防治昆虫对基层侵害的方法，其包括向所述基层应 用有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。
[0229] 本发明还包括用于治疗和/或预防昆虫疾病或病症的方法，其包括向有此治疗和 /或预防需要的对象施用本文所述的任何组合物或喷雾剂，所述组合物或喷雾剂包含至少 一种双链RNA或双链RNA构建体，其包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与导致所 述昆虫疾病或病症的昆虫的昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据 一个更具体的实施方案，所述待施用的组合物或喷雾剂包含和/或表达至少一种细菌细胞 或酵母细胞，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链RNA或双链RNA构建 体；或者包含和/或表达本文所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA构建体，所述RNA或核 苷酸序列与导致所述昆虫疾病或病症的昆虫的昆虫靶基因之至少一部分核苷酸序列是互 补的。
[0230] 在本发明的另一实施方案中，所述组合物用作植物或者植物的增殖或繁殖材料 (如种子）的杀虫剂。举例来说，所述组合物可通过向植物组织喷洒或应用或者在幼苗出苗 前后向土壤喷洒或混合而用作杀虫剂。
[0231] 在另一实施方案中，本发明提供了用于处理和/或阻止昆虫生长和/或昆虫侵害 植物或者植物的增殖或繁殖材料的方法，其包括向植物或者向植物的增殖或繁殖材料应用 有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。
[0232] 在另一实施方案中，本发明涉及任何双链RNA或RNA构建体、或者编码所述双链 RNA或RNA构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体、或者表达本发明的dsRNA的至少一种宿 主细胞（例如，细菌或酵母）、或者编码本文所述的dsRNA的病毒、或者包含上述的任何组合 物或喷雾剂的用途，其用于控制昆虫生长，用于防治昆虫侵害对昆虫感染敏感的植物，或用 于处理植物的昆虫感染。针对特定昆虫导致的昆虫感染而进行处理的特定植物如前所述， 并包含在所述用途中。
[0233] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种宿主细胞，或表达本发明 的dsRNA的至少一种宿主细胞（例如，细菌或酵母），或编码本文所述的dsRNA的病毒，或者 涉及包含上述的任何组合物的喷雾剂的用途，该喷雾剂用于控制昆虫生长，用于防治昆虫 侵害对昆虫感染敏感的植物，或用于治疗植物的昆虫感染。优选地，所述宿主细胞包含如下 表示的任意序列之至少一种：SEQ ID 勵1，3,5,7,9，11，13，15，17，19,21，23,49至158，159， 160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247,249， 251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517， 519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773， 778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892， 894,896,908 至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079， 1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109， 1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622， 1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688， 1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060， 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476， 2481或2486,或其至少17个连续核苷酸的片段。
[0234] 另一方面，本发明还提供了用于防止或保护植物免受害虫侵害的方法组合和组合 物。例如，一种方法提供了使用转基因方法与使用双链RNA分子以及与一种或多种对靶标 害虫具有毒性的Bt杀虫蛋白或化学的（有机的）化合物的组合物的方法组合。另一方法 提供了使用转基因方法与使用在细菌或酵母中表达双链RNA分子以及在同样的细菌或酵 母中或者在不同的细菌或酵母中表达所述Bt杀虫蛋白的方法的组合。例如根据这些方法， 可以使用基于RNAi的方法或技术来靶向或杀死一种昆虫，而使用Bt杀虫剂或化学的（有 机的）杀虫剂可以靶向或杀死另一种昆虫。
[0235] 因此，本发明还涉及本文所述的用于处理植物的任何组合物、喷雾剂或方法，其中 所述组合物包含表达所述RNA分子的细菌细胞或酵母,并且还包含杀虫剂或者包含含有或 表达杀虫剂的细菌细胞或酵母细胞（可以与上面提及的是同一细菌或酵母细胞或者不同 的细菌或酵母细胞），所述杀虫剂选自化学的（有机的）杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢 杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧抱芽抱杆菌杀虫蛋白和球形芽抱 杆菌杀虫蛋白。优选地，所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自：Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、 Cry22、二元杀虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋 白TIC100和TIC101以及二元杀虫蛋白PS149B1。
[0236] 所述喷雾剂可用于温室中或农田上。对于水基喷雾剂来说，包含细菌的生物杀虫 剂（例如，作为可乳化的混悬液）的通常应用率为25-100升/公顷（10-40升/英亩）：每 公顷包含约2. 5-5升的配制产品（可乳化的混悬液），其中所述配制产品包含约25% (体 积/体积）的'细菌细胞'加75% (体积/体积）的'其它成分，。细菌细胞的量以单位来 计，例如一个单位定义为lml中109个细菌细胞。取决于每公顷的作物密度和每株植物的叶 面积，1升的配制产品包含〇. 001?10000个单位的细菌，优选地至少〇. 〇〇l、〇. 003、0. 005、 0· 007、0· 01、0· 03、0· 05、0· 07、0· 1、0· 3、0· 5、0· 7,更优选至少 1、3、5、7、10、30、50、70、100、 300、500、700，或者更优选至少1000、3000、5000、7000或者10000个单位的细菌。
[0237] 例如，马铃薯作物植物的通常植物密度约为每平方米4. 5株植物或者每公顷 45, 000株植物（成排种植，排与排之间距离为75cm，每排的植物之间距离为30cm)。因此，本 发明涉及喷雾剂，其包含至少 〇· 〇〇1、〇· 003、0· 005、0· 007、0· 01、0· 03、0· 05、0· 07、0· 1、0· 3、 〇· 5、0· 7,更优选至少 1、3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700,或者更优选至少 1000、 3000、5000、7000或者10000个单位的细菌，所述细菌表达本文所述的至少一种dsRNA分子 或dsRNA构建体。
[0238] 本发明还涉及用于处理植物中昆虫感染的试剂盒，其包含先前所述的至少一种双 链RNA、或双链RNA构建体、或核苷酸序列、或重组DNA构建体、或宿主细胞、或组合物或喷雾 齐U。所述试剂盒可以与适当的使用说明书一起提供。该说明书可印刷在提供其它组分的合 适的包装上，或者可作为单独的实体来提供，例如可以采用纸页或小册子的形式。该说明书 可以卷起或折叠（例如在储存状态时），然后可以将其展开从而指导所述试剂盒其余组分 的用途。
[0239] 参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。

【专利附图】

【附图说明】
[0240] 图1-LD :使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。使用以50 μ 1 局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照）溶液处理的饲料喂食第二幼虫阶段的昆虫。7天后， 将饲料替换为包含局部应用的dsRNA的新鲜饲料。在第2、5、7、8、9和13天评估存活昆虫 数。相对于第〇天（测定开始时）来计算存活幼虫的百分比。靶标LD006:(SEQ ID N0178); 靶标 LD007(SEQ ID N0183);靶标 LD010(SEQ ID N0188);靶标 LD011(SEQ ID N0193);靶标 LD014(SEQ ID N0198) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0241] 图2-LD :使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。使用以50 μ 1 局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照）溶液处理的饲料喂食第二幼虫阶段的昆虫。7天后， 将饲料替换成仅为新鲜饲料。在第2、5、6、7、8、9、12和14天评估存活昆虫数。相对于第0 天（测定开始时）来计算存活幼虫的百分比。靶标LD001(SEQ ID N0163);靶标LD002(SEQ ID N0168);靶标 LD003(SEQ ID N0173);靶标 LD015(SEQ ID N0215);靶标 LD016(SEQ ID N0220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0242] 图3-LD :使用用dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶甲幼虫的平均重量。使 用以20 μ 1局部应用的dsRNA (靶标LD002或gfp)溶液（10ng/ μ 1)处理的叶盘喂食第二 幼虫阶段的昆虫。2天后，每天将昆虫转移至未经处理的叶子上。
[0243] 图4-LD :使用以较短形式的靶标LD014dsRNA和多联体dsRNA处理的人工饲料喂 食的马铃薯叶甲的存活。使用以50 μ 1局部应用的dsRNA (gfp或靶标）溶液处理的饲料喂 食第二幼虫阶段的昆虫。在第3、4、5、6和7天评估存活昆虫数。相对于第0天（测定开始 时）来计算存活幼虫的百分比。
[0244] 图5-LD :使用以不同浓度的dsRNA (靶标LD002 (a)、靶标LD007 (b)、靶标 LD010(c)、靶标 LDOll(d)、靶标 LD014(e)、靶标 LD015(f)、LD016(g)和靶标 LD027(h))处 理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲幼虫的存活。使用以50 μ 1局部应用的dsRNA溶液处理的 饲料喂食第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将饲料替换为包含局部应用的dsRNA的新鲜饲料。 以固定的时间间隔评估存活昆虫数。相对于第〇天（测定开始时）来计算存活幼虫的百分 比。
[0245] 图6-LD.表达dsRNA (靶标LD010)的大肠杆菌菌株对马铃薯叶甲幼虫存活的随时 间的影响。在基于人工饲料的分别的生物测定中检测两株细菌菌株：（a)AB301-105(DE3)， PGBNJ003和pGN29的数据点表示来自5个不同细菌克隆的平均死亡率值，（b)BL21 (DE3)， PGBNJ003和pGN29的数据点分别表示来自5个不同的细菌克隆以及一个单独的细菌克隆的 平均死亡率值。误差条线代表标准差。
[0246] 图7-LD.表达dsRNA (靶标LD010)的大肠杆菌菌株的不同克隆（a) ΑΒ301-105ΦΕ3)和（b)BL21(DE3)在侵害后12天对马铃薯叶甲幼虫存活的影响。数据点 是PGN29和pGBNJ003的每个克隆的平均死亡率值。在该时间点，包含质粒pGBNJ003的 ΑΒ301-105ΦΕ3)克隆1显示出CPB100%死亡率。误差条线代表标准差。
[0247] 图8-LD.表达dsRNA (靶标LD010)的大肠杆菌菌株的不同克隆（a) ΑΒ301-105ΦΕ3)和（b)BL21(DE3)在侵害后7天对存活的马铃薯叶甲幼虫的生长和发育的 影响。基于表10的数据，数据点是每个克隆（一个PGN29克隆和5个pGBNJ003克隆）的 幼虫平均重量值的百分数。只用饲料处理代表100%的正常幼虫重量。
[0248] 图9-LD.喂食马铃薯植物的马铃薯叶甲幼虫在侵害后7天的存活，所述马铃薯植 物用产生双链RNA的细菌喷洒。计算存活幼虫数并表示为死亡率百分数。所使用的细菌宿 主菌株是RNA聚合酶III缺陷型菌株AB301-105 (DE3)。昆虫基因靶标是LD010。
[0249] 图10-LD.喂食马铃薯植物的存活的马铃薯叶甲幼虫在侵害后11天的生长/发 育延迟，所述马铃薯植物用产生dsRNA的细菌喷洒。所使用的细菌宿主菌株是RNA聚合酶 III缺陷型菌株ΑΒ301-105ΦΕ3)。数据图表示正常幼虫重量的百分比，只用饲料的处理代 表100%的正常幼虫重量。昆虫基因靶标是LD010。误差条线代表标准差。
[0250] 图11-LD.在侵害后7天，产生双链RNA的细菌对马铃薯叶甲幼虫导致的马铃薯损 伤的抗性。左图，用含有PGN29质粒的7个单位的细菌ΑΒ301-105ΦΕ3)喷洒植物；右图，用 含有PGBNJ003质粒的7个单位的细菌ΑΒ301-105ΦΕ3)喷洒植物。一个单位定义为在600nm 0D值为1的lml细菌悬液的等价物。昆虫基因靶标为LD010。
[0251] 图12-LD.使用以dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶甲成虫的存活。开 始两天使用以双链RNA处理的叶盘喂食年幼成虫，然后将其置于未经处理的马铃薯叶上。 定期评估存活昆虫数；活的并且看起来运动正常的昆虫记录为可动的昆虫；活的但似乎有 病且运动缓慢的昆虫记录为濒死的昆虫--一旦将其背部朝下，这些昆虫不能翻身。靶 标 LD002(SEQ ID N0168);靶标 LD010(SEQ ID N0188);靶标 LD014(SEQ ID N0198);靶标 LD016(SEQ ID N0220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0235)。
[0252] 图13-LD.细菌产生的靶标双链RNA对马铃薯叶甲幼虫的影响。将0D为1的经热 处理的表达dsRNA(SEQ ID N0188)的50μ1细菌ΑΒ301-105ΦΕ3)悬液局部应用于48孔板 每个孔中的固体人工饲料上。将L2阶段的CPB幼虫置于每个孔中。在第7天，对包含（a) 含有表达靶标10双链RNA的细菌的饲料，（b)含有空载体pGN29的细菌的饲料，以及（c)只 有饲料的平板中的CPB幼虫进行拍照。
[0253] 图14-LD.在昆虫侵害前，将不同量的含有质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌 ΑΒ301-105ΦΕ3)菌株局部应用于马铃薯叶对CPB幼虫存活和生长的影响。用经处理的马铃 薯喂食10只L1幼虫7天。喷洒在植物上的细菌悬液的量为：0. 25U、0. 08U、0. 025U、0. 008U 的靶标10以及0. 25U的pGN29 (阴性对照；还包含Milli-Q水）。一个单位（U)定义为与在 600nm吸光度值为1的lml培养物中等量的细菌量。将1. 6ml总体积喷洒至每株植物上。 昆虫基因靶标为LD010。
[0254] 图15-LD在侵害后7天，含有质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌ΑΒ301-105ΦΕ3) 菌株对CPB幼虫导致的马铃薯损伤的抗性。（a)水，（b)包含pGN29的0. 25U大肠杆 菌 AB301-105 (DE3)，（c)含有 pGBNJ003 的 0· 025U 大肠杆菌 AB301-105 (DE3)，（d)含有 PGBNJ003的0. 008U大肠杆菌AB301-105 (DE3)。一个单位（U)定义为与在600nm吸光度值 为1的lml培养物等量的细菌量。将1. 6ml总体积喷洒至每株植物上。昆虫基因靶标为 LD010。
[0255] 图1-PC :喂食靶标dsRNA对辣根猿叶甲幼虫的存活和生长的影响。使用以25 μ 1 局部应用的〇. 1 μ g/ μ ldSRNA(靶标或gfp对照）溶液处理的油菜叶盘喂食新生幼虫。2天 后，将所述昆虫移至新鲜的经dsRNA处理的叶盘上。在第4天，针对每种处理收集来自一次 重复实验的幼虫，并置于含有未经处理的新鲜油菜叶的培养皿中。在第2、4、7、9和11天评 估所述昆虫。（a)使用以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫幼虫的存活。相对于 第〇天（测定开始时）来计算存活幼虫百分比，（b)使用以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的辣 根猿叶甲幼虫的平均重量。一起称重来自每次重复的昆虫并确定每只幼虫的平均重量。误 差条线代表标准差。靶标1 :SEQ ID473 ;靶标3 :SEQ ID N0478 ;靶标5 :SEQ ID N0483 ;靶 标 10 :SEQ ID N0488 ;靶标 14 :SEQ ID493 ;靶标 16 :SEQ ID N0498 ;靶标27 :SEQ ID N0503 ; gfp dsRNA ：SEQ ID N0235〇
[0256] 图2-PC :使用以不同浓度dsRNA(a)靶标PC010和（b)靶标PC027处理的油菜叶 盘喂食辣根猿叶甲的存活。将初生幼虫置于用25 μ 1局部应用的dsRNA溶液处理的油菜叶 盘上。在第2天，将昆虫移至经处理的新鲜叶盘上。在第4天（针对靶标PC010)和第5天 (针对靶标PC027)，将昆虫移至未经处理的叶子。在第2、4、7、8、9和11天（针对PC010) 和第2、5、8、9和12天（针对PC027)评估昆虫的存活数。相对于第0天（测定开始时）来 计算存活幼虫的百分比。
[0257] 图3-PC :表达dsRNA (靶标PC010)的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株对辣根猿叶 甲幼虫存活的随时间的影响。每种处理的数据点表示来自3次不同重复实验的平均死亡率 值。误差条线表示标准差。靶标10 :SEQ ID N0488。
[0258] 图1-EV :使用以dsRNA处理的豆叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫的存活。使用以25 μ 1 局部应用的1 μ g/ μ 1 dsRNA (靶标或gfp对照）溶液处理的豆叶盘喂食初生幼虫。2天后， 将所述昆虫移至经dsRNA处理的新鲜叶盘上。在第4天，收集来自一种处理的幼虫，并置于 含有未经处理的新鲜豆叶的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天评估昆虫的死亡率。相对于 第〇天（测定开始时）来计算存活幼虫的百分比。靶标5 :SEQ ID N0576 ;靶标10 :SEQ ID N0586 ;靶标 15 :SEQ ID N0591 ;靶标 16 :SEQ ID N0596 ;gfp dsRNA :SEQ ID N0235。
[0259] 图2-EV :喂食靶标dsRNA对墨西哥豆瓢虫成虫的存活的影响，以及对食荚菜豆叶 的昆虫侵害的抗性。（a)使用以dsRNA处理的豆叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫成虫的存活。使 用以75 μ 1局部应用的0. 1 μ g/μ 1 dsRNA (靶标或gfp对照）溶液处理的豆叶盘喂食成虫。 24小时后，将昆虫移至经dsRNA处理的新鲜叶盘上。再过24小时后，收集来自一种处理的 成虫，并置于包含未经处理的新鲜的盆栽整株豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、7、8和11天 评估昆虫的死亡率。相对于第0天（测定开始时）来计算存活幼虫的百分比。靶标10 :SEQ ID N0586 ;靶标 15 :SEQ ID N0591 ;靶标 16 :SEQ ID N0596 ;gfp dsRNA :SEQ ID N0235。（b) dsRNA对墨西哥豆瓢虫成虫所造成豆叶损伤的抗性。在第9天，目测检查包含来自一种处理 (参见（a))的昆虫的整株植物的叶损伤。⑴祀标10 ; (ii)祀标15 ; (iii)祀标16 ; (iv) gfp dsRNA ;(v)未处理。
[0260] 图1-TC :使用以dsRNA(靶标14)处理的人工饲料喂食的赤拟谷盗的存活。基于含 有lmg dsRNA (靶标14)的面粉/奶混合物喂食初生幼虫。饲料中的水（不含dsRNA)是对 照。针对每种处理，进行4次重复实验，每次重复实验使用10只1龄幼虫。在第6、17、31、 45和60天评估昆虫的存活的平均数百分比。相对于第0天（测定开始时）来计算存活幼 虫的百分比。误差条线代表标准差。靶标TC014:SEQ ID N0878。
[0261] 图1-MP :摄取dsRNA(靶标27)对桃蚜若虫存活的影响。将1龄昆虫置于包含50μ 1 液态饲料（含有2 μ g/ μ 1 dsRNA (靶标27或gfp dsRNA对照））的喂料室中。针对每种处 理，建立5个喂料室，其中每个喂料室包括10只龄虫。在生物测定开始后的第8天评估存 活数。误差条线代表标准差。靶标 MP027:SEQ ID N01061;gfp dsRNA:SEQ ID N0235。
[0262] 图1-NL :使用以dsRNA处理的液体人工饲料喂食的褐飞虱的存活。在分别的生 物测定中用补充有2mg/ml dsRNA靶标的溶液的饲料喂食第一至第二幼虫阶段的若虫：(a) NL002、NL003、NL005、NL010 ;(b)NL009、NL016 ;(c)NL014、NL018 ;(d)NL013、NL015、NL021。 昆虫针对靶标的存活与喂食相同浓度的只有饲料和含有gfp dsRNA对照的饲料进行比较。 每两天将饲料替换为含有dsRNA的新鲜饲料。每天评估存活昆虫数。
[0263] 图2-NL :使用以不同浓度的靶标dsRNA(NL002)处理的液体人工饲料喂食的褐飞 虱的存活。用补充有l、〇. 2、0. 08和0. 04mg/ml (终浓度）NL002的饲料喂食第一至第二幼 虫阶段的若虫。每两天将饲料替换为含有dsRNA的新鲜饲料。每天评估存活昆虫数。

【具体实施方式】
[0264] 实施例
[0265] 实施例1 :在高通量筛诜中沉默秀丽隐杆线虫中的靶某闵
[0266] 在pGN9A载体（W001/88121)中相同的两个T7启动子和终止子之间制备秀丽隐杆 线虫基因组范围的文库，其在T7聚合酶表达的情况下通过IPTG诱导而驱动有义和反义方 向的表达。
[0267] 以96孔板的形式，将此文库转化入ΑΒ301-105ΦΕ3)细菌菌株。为了在基因组范 围进行筛选，用这些细菌细胞喂食核酸酶缺陷型秀丽隐杆线虫nuc-1 (el392)株。
[0268] 遵循下述步骤，在96孔板中用所述AB301-105(DE3)细菌菌株中产生的dsRNA喂 食秀丽隐杆线虫nuc-1 (el392):将nuc-1卵移至不同的板中，并使其在20°C同时孵化从而 使L1代同步化。将包含IPTG的100 μ L液体生长培养基以及含有秀丽隐杆线虫dsRNA文 库的〇D_l的10μ L ΑΒ301-105ΦΕ3)细菌细胞培养物加至96孔板中，所述文库中每个载 体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将4只同步化的L1线虫加至每 个孔中，在25°C孵育至少4至5天。这些实验一式四份进行。在所述筛选中使用了 6种对 昭. >、?、 ·
[0269] -pGN29 =阴性对照，野生型
[0270] -pGZl = unc-22 =颤搐表型
[0271] _pGZ18 =几丁质合酶=胚胎致死
[0272] _pGZ25 = pos-Ι =胚胎致死
[0273] -PGZ59 = bli_4D =急性致死
[0274] -ACC =乙酰辅酶A羧化酶=急性致死
[0275] 5天后，将用产生dsRNA的细菌喂食的秀丽隐杆线虫nuc-1 (el392)与用空载体 (PGN29)及其它对照喂食的线虫的表型进行比较。针对亲代（P0)的（急性的或幼虫的）致 死性、子一代（F1)的（胚胎）致死性或者针对P0的生长阻滞对使用所述dsRNA喂食的线 虫讲行筛诜，具体如下：（i)P0的急件致死：L1不发育且死亡，该表型不产生后代，所述孔看 h去相当宇：（ii)P0的（幼虫）致死：P0在比L1更晚的阶段死亡，该表型也不产生后代。 在孔中发现死亡的幼虫或死亡的成虫；(iii)Fl致死：L1发育至成虫阶段并仍然存活。该表 型不产生后代。这可能是由于不育、胚胎致死（孔底部有死亡的卵）、胚胎停滞或幼虫停滞 (最终致死）；(iv)牛长停滞及牛长阻滞/延迟：与包含ιΗ常发育和ιΗ常后代数的孔讲行比 较。
[0276] 对于表1A中所示的靶序列来说，所得结论为：在线虫（如秀丽隐杆线虫）中由 dsRNA介导的秀丽隐杆线虫靶基因沉默对线虫的生长和存活具有重要影响。
[0277] 在上述dsRNA沉默实验之后，在24孔板中以高通量形式对秀丽隐杆线虫进行更细 致的表型实验。按照如下步骤，用如上所述ΑΒ301-105ΦΕ3)细菌菌株中得到的dsRNA文库 喂食24孔板中的秀丽隐杆线虫nuc-1 (el392)，具体如下：将nuc-Ι卵移至不同的板中，并 使其在20°C同时孵化从而使L1代同步化。然后，将100只同步化的L1线虫浸泡于500yL S完全喂食培养基（含有5 μ g/mL胆固醇、4 μ L/mL PEG和ImM IPTG)和包含秀丽隐杆线虫 dsRNA文库的0D_为1的500μ L ΑΒ301-105ΦΕ3)细菌细胞培养物的混合物中，所述文库 中每个载体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将被浸泡的L1线虫在 25°C滚动孵育2小时。
[0278] 在离心并除去950 μ L上清液后，将所剩5 μ L经重悬的沉淀（包含约10至15只 线虫）移至24孔板每个孔的中部，加入一层琼脂LB液体培养基。将所接种的板在25°C孵 育2天。在成虫阶段，挑出单只成虫并在25°C孵育2天用于检查其后代。在最初的24孔板 上原位检查其它线虫成虫。一式四份地进行这些实验。
[0279] 用另一批线虫重复上述细致的表型筛选，唯一的区别在于第二批线虫在20°C孵育 3天。
[0280] 对用秀丽隐杆线虫dsRNA喂食的线虫之表型以及用所述空载体喂食的秀丽隐杆 线虫nuc-1 (el392)之表型进行比较。
[0281] 基于该实验，所得结论为：如表1A中所示秀丽隐杆线虫靶基因的沉默对于线虫的 生长和存活具有重要影响，所述靶基因对于线虫的存活是必需的。因此，这些基因是利用 dsRNA介导的基因沉默来防治（杀死或阻止其生长）线虫的理想靶基因。因此，本发明包括 上述秀丽隐杆线虫靶基因的线虫直向同源物用于防治线虫侵害（例如线虫对植物的侵害） 的用途。
[0282] 实施例2 :鉴定黑腹果蝇的官系同源物
[0283] 如实施例1中所述，鉴定了许多秀丽隐杆线虫的致死序列，并且所述致死序列 可用于鉴定其它种属中的直向同源物。例如，所述秀丽隐杆线虫致死序列可用于鉴定黑 腹果蝇的直向同源序列。也就是说，可使用每种秀丽隐杆线虫序列在公共数据库（例如 GenBank)中检索黑腹果蝇的直向同源物。选择具有高度序列同源性的（E值优选小于或等 于1E-30)可能的黑腹果蝇直向同源物，所述序列是相blast的最佳命中结果，后者指来自 不同生物（例如秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇）的序列相互为最佳blast命中结果。例如，使 用BLAST将来自秀丽隐杆线虫的序列C与黑腹果蝇的序列D进行比对。如果黑腹果蝇序列 D是序列C的最佳命中结果，并且与秀丽隐杆线虫的所有序列进行比对时序列C也是D的最 佳命中结果，那么D和C是相互最佳命中结果。该标准常用于定义直系同源物，意指不同物 种中具有相似功能的相似序列。所鉴定的黑腹果蝇序列示于表1A。
[0284] 实施例 3 :马铃葉叶甲(Colorado potato beetle, CPB)
[0285] A.克隆来自马铃薯叶甲的部分基因序列
[0286] 按照制造商的说明，使用 TRIzol 试剂（Cat. Nr. 15596-026/15596-018， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从4个不同幼虫阶段的马铃薯叶甲（科罗拉 多甲虫；来源：Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbusl62,6700AD Wageningen，the Netherlands)分离高质量的完整 RNA。按照制造 商的说明，通过DNA酶（Cat.Nr. 1700, Promega)处理除去该RNA制备物中的基因组DNA。 按照制造商的说明，使用市售试剂盒（Superscript? III逆转录酶，Cat. Nr. 18080044， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到 cDNA。
[0287] 为了分离包含 LD001、LD002、LD003、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014、LD015、 LD016、LC018和LD027基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用 Amplitaq Gold (Cat. Nr. N8080240, Applied Biosystems)进行一系列 PCR 反应。
[0288] 表2-LD中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包括引物序列和 所得cDNA序列的马铃薯叶甲靶基因。使用这些引物进行各自的PCR反应，其使用以下条件： 95°C 10分钟，然后是40个循环的95°C 30秒、55°C 1分钟和72°C 1分钟，然后是72°C 10分 钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化（QIAquick Gel Extraction kit, Cat. Nr. 28706, Qiagen)，将其克隆入 pCR8/GW/topo 载体（Cat. Nr. K250020, Invitrogen)并 测序。表2-LD中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。 表3-LD中给出了用各自SEQ ID N0表示的相应部分氨基酸序列，其中读码框的起点在括号 中指明。
[0289] B.产生马铃薯叶甲基因的dsRNA
[0290] 使用市售试剂盒 T7Ribomax? Express RNAi System (Cat. Nr. P1700, Promega)合 成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得到最初两种独立的单个5'T7RNA聚合酶启 动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。
[0291] 对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模 板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应的条件 如下：95°C4分钟，然后是35个循环的95°C30秒、55°C30秒和72°C 1分钟，然后是72°C 10 分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得 到反义T7模板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物的序列。在琼脂 糖凝胶上分析所得的PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒（Qiaquick PCR Purification Kit, Cat. Nr. 28106, Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正 向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸 钠进行纯化。表8-LD中给出了每种靶基因所得dsRNA的有义链。表8-LD显示了用于制备 马铃薯叶甲靶序列的dsRNA片段的序列和多联体序列，其包括引物序列。
[0292] C.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行筛选
[0293] 如下制备马铃薯叶甲的人工饲料（修改自Gelman et al. ,2001，J. Ins. Sc.， vol. 1，no. 7,1-10):对水和琼脂进行高压灭菌，当温度降至55°C时加入其余的成分（如下 文表A中所示）。在此温度下，均匀混合所述成分，然后将所述饲料以每孔lml的量等分至 24孔板（Nunc)。使所述人工饲料在室温下冷却而固化。饲料在4°C最多保存3周。
[0294] 表A :人工饲料的成分
[0295]

【权利要求】
1.分离的核苷酸序列，其包含选自以下的核酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158， 159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240 至 247， 249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515， 517,519,521，533 至 575,576,581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768， 773,778,783,788,793,795,797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890， 892,894,896,908tol040,1041，1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077， 1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107， 1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617， 1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686， 1688.1690.1692.1694.1696.1698.1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055， 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338， 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471， 2476,2481或2486,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178， 183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797,799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089， 1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572， 1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647， 1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698， 1700.1702.1704.1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085， 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364， 23613, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互补序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9,11，13,15,17,19,21，23,49 至 158,159,160-163,168,173,178， 183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473,478,483,488,493,498,503,508 至 513,515,517,519,521，533 至 575,576， 581，586,591，596,601，603,605,607,609,621 至 767,768,773,778,783,788,793,795， 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,896,908 至 1040,1041， 1046,1051，1056,1061，1066 至 1071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089， 1091，1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572， 1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647， 1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698， 1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085， 2090, 2095, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339, 2344, 2349, 2354, 2359, 2364， 2366, 2368, 2370, 2372, 2384 至 2460, 2461，2466, 2471，2476, 2481 或 2486,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N049至 158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至 1040、 1161 至 1571U730 至 2039、2120 至 2338、2384 至 2460,或其互补序列。
2. 权利要求1的多核苷酸序列表达产生的双链核糖核苷酸序列，其中植物昆虫害虫摄 取所述核糖核苷酸序列抑制所述昆虫害虫的生长。
3. 权利要求2的核糖核苷酸序列，其中摄取所述序列抑制与所述序列基本上互补的核 苷酸序列的表达。
4. 包含根据权利要求2或3的核糖核苷酸序列的组合物，其还包含至少一种佐剂以及 任选地至少一种表面活性剂。
5. 包含至少一种双链RNA的组合物，其中一条链包含与选自权利要求1中所限定序列 的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其还任选地包含至少一种适当的载体、赋 形剂或稀释剂。
6. 用包含权利要求1中所限定核酸序列的多核苷酸转化的细胞，所述核酸序列任选地 与调节序列有效连接。
7. 权利要求6的细胞，其中所述细胞是原核细胞，例如革兰氏阳性细胞或革兰氏阴性 细菌细胞；或者其中所述细胞是真核细胞，例如酵母细胞或藻类细胞。
8. 权利要求7的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
9. 权利要求7的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
10. 包含至少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞包含权利 要求1中所限定的至少一种多核苷酸。
11. 权利要求10的组合物，其中所述细菌或酵母细胞被灭活或被杀死，例如通过热处 理或机械处理。
12. 包含表达至少一种双链RNA的至少一种细菌或酵母细胞的组合物，其中所述双链 RNA的一条链包含与选自权利要求1中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷 酸序列，该组合物中还任选地包含至少一种适当的载体、赋形剂或稀释剂。
13. 权利要求5或10至12中任一项的组合物，所述组合物还包含至少一种选自以下的 杀虫剂：化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状 菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白，所述杀虫剂具有对抗与权 利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫的活性，或者其中所述杀虫剂具有对抗一种或多 种其它植物昆虫害虫的活性。
14. 权利要求10至12中任一项的组合物，其中所述至少一种细菌或酵母细胞还包含 或还表达至少一种选自以下的杀虫剂：化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋 白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧抱芽抱杆菌杀虫蛋白和球形芽抱杆菌杀虫蛋 白，所述杀虫剂具有对抗与权利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫的活性，或者其中 所述杀虫剂具有对抗一种或多种其它植物昆虫害虫的活性。
15. 权利要求5或10至12中任一项的组合物，其还包含至少一种其它细菌或酵母细 胞，所述细胞包含或表达至少一种选自以下的杀虫剂：化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金 芽抱杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧抱芽抱杆菌杀虫蛋白和球形 芽孢杆菌杀虫蛋白，所述杀虫剂具有对抗与权利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫的 活性，或者其中所述杀虫剂具有对抗一种或多种特定植物昆虫害虫的活性。
16. 权利要求13至15中任一项的组合物，其中所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自： Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元杀虫蛋白 CryET33 和 CryET34、二元杀虫蛋白 CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101以及二元杀虫蛋白PS14981。
17. 权利要求13至16中任一项的组合物，其作为杀昆虫试剂。
18. 权利要求13至16中任一项的组合物，其用作预防或治疗人或动物机体免受昆虫侵 害的药物。
19. 包含权利要求10至18中任一项的至少一种组合物的喷雾剂，其还任选地包含至少 一种佐剂和至少一种表面活性剂。
20. 包含权利要求10至18中任一项所限定组合物的用于害虫的外罩、陷阱或诱饵。
21. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的 外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：马铃薯叶甲属物种 (Leptinotarsa spp.)(例如，马铃薯叶甲（L.decemlineata)、伪马铃薯叶甲（L.juncta)或 胡颓子叶爺叶甲（L. texana))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互补序列，以 及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N01，3,5,7,9，ll，13，15，17，19,21，23,49 至 158，159，160 至 163，168，173， 178.183.188.193.198, 203, 208, 215, 220, 225, 230, 240 至 246,或 2486,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N049至158,或其互补序列。
22. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20 的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：猿叶甲属物种 (Phaedon spp.)(例如，辣根猿叶甲（P.cochleariae))并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N0247, 249, 251，253, 255, 257, 259, 275 至 472,473， 478,483,488,493,498, 503, 508 至 512,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498， 503, 508至512,或其互补序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N0247,249,251，253,255,257,259,275 至 472,473,478,483,488,493,498， 503, 508至512,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0275至472,或其互补序列。
23. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20 的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：食植瓢虫属 (Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢虫（E.varivetis))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互补序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N0513, 515, 517, 519, 521，533 至 575, 576, 581，586, 591 或 596,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0533至575,或其互补序列。
24. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20 的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：花象属物种 (Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉铃象（A. grandis))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互补序列， 以及 (iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N0601，603,605,607,609,621 至 767, 768, 773, 778, 783 或 788,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0621至767,或其互补序列。
25. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20 的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：拟谷盗属物种 (Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗（T.castaneum))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互补序列， 以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N0793, 795, 797, 799,801，813 至 862,863,868,873,878 或 883,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0813至862,或其互补序列。
26. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的 外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：瘤蚜属物种（Myzus spp.)(例如，桃姆（Μ· persicae))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID 勵888,890,892,894,896,908 至 1040，1041，1046， 1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N0888,890,892,894,896,908至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互补序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N0888,890,892,894,896,908至 1040,1041，1046,1051，1056,1061，或 1066 至 1070,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N0908至1040,或其互补序列。
27. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20 的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：褐飞虱属物种 (Nilaparvata spp.)(例如，褐飞風（N. lugens))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列： SEQ ID N01071，1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091，1093， 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1822,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093, 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互补序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N01071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093, 1095,1097,1099,1101，1103,1105,1107,1109,1111，1113,1161 至 1571，1572,1577,1582， 1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657， 1662,1667,1672或1677,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N01161至1571，或其互补序列。
28.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20 的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：禾草螟属物种 (Chilo spp.)(例如，二化螟（C.suppressalis)、台湾稻螟（C.auricilius)或稻多丽螟 (C. polychrysus))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696， 1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080， 2085, 2090或2095,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090 或 2095,或其互补 序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N01682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730 至 2039, 2040, 2045, 2050, 2055, 2060, 2065, 2070, 2075, 2080, 2085, 2090 或 2095,或其互补 序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N01730至2039,或其互补序列。
29. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外 罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：Plutella属物种（例 如，菜蛾），并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 如下表示的任意序列：SEQ ID N02100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339， 2344, 2349, 2354或2359,或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N02100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2120 至 2338, 2339,2344, 2349, 2354 或 2359， 或其互补序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N02100,2102,2104,2106,2108,2120 至 2338,2339,2344,2349,2354 或2359,或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N02120至2338,或其互补序列。
30. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的 外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自：Acheta属物种（例 如，居屋艾幡（A. domesticus))，并且 -其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或 -其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列： (i) 以下任意序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互补序列， (ii) 与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选 至少95%、96%、97%、98%或99%-致性的序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2364 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互补序列，以及 (iii) 包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID N02364,2366,2368,2370,2372,2384 至 2460,2461，2466,2471，2476 或 2481， 或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的 直系同源物：SEQ ID N02384至2460,或其互补序列。
31. 权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外 罩、陷阱或诱饵在药物或兽医应用中的用途。
32. 用于防止昆虫在植物上生长或者防止昆虫侵害植物的方法，其包括将权利要求10 至18中任一项的组合物或者权利要求19的喷雾剂应用到所述植物。
33. 提高产量的方法，其包括将有效量的权利要求10至18中任一项的组合物或权利要 求19的喷雾剂应用到植物。
34. 权利要求32或33的方法，其中所述植物选自：苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、 香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰 菜、谷类、芹菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、无花 果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、甜瓜、 小米、蘑菇、燕麦、菜秋葵、洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、豌 豆、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、 高粱、黄豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、茶树、烟草、番茄、藤本植 物、西瓜、小麦、山药以及西葫芦。
35. 根据权利要求32至34中任一项的方法，其中所述昆虫选自：马铃薯叶甲属（例 如，马铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或胡颓子叶茄叶甲）、合爪负泥虫属物种（Lema spp.) (例如，三条负泥虫（L. trilineata))、爺跳甲属物种（Epitrix spp.)(例如，美国马铃 薯跳甲（E.cucumeris)、烟草跳甲（E.hirtipennis)或块莖跳甲（E.tuberis))、豆芫菁 属物种（Epicauta spp.)(例如，北美豆芫菁（E. vittata))、食植瓢虫属物种（例如， 墨西哥豆瓢虫）、猿叶甲属物种（例如，辣根猿叶甲）、褐飞虱属物种（例如，褐飞虱）、 灰飞風属物种（Laodelphax spp.)(例如，灰飞風（L.striatellus))、黑尾叶蝶属物种 (Nephotettix spp.)(例如，二点黑尾叶蝶（N. virescens)，或黑尾叶蝶（N. cincticeps), 或二条黑尾叶蝶（N.nigropictus))、白背飞風属物种（Sogatella spp.)(例如，白背飞 風（5.：1；\11'(^€6四)）、4(3116七3属物种（例如，居屋艾幡）、杆长蝽属物种（131188118 8口口·） (例如，美洲谷杆长蝽（B. leucopterus leucopterus))、黑蝽属物种（Scotinophora spp.)(例如，稻黑蝽（S. vermidulate))、绿蝽属物种（Acrosternum spp.)(例如，拟 绿蝽（A. hilare))、稻弄蝶属物种（Parnara spp.)(例如，直纹稻弄蝶（P. guttata))、 禾草螟属物种（例如，二化螟、台湾稻螟或稻多丽螟（C. polychrysus))、禾草螟属物种 (Chilotraea spp.)(例如，稻杆螟（C.polychrysa))Ji^夜蛾属物种（Sesamia spp.) (例如，稻駐莖夜蛾（S. inf erens))、駐禾螟属物种（Tryporyza spp.)(例如，白稻螟 (T.innotata)或三化螟（T.incertulas))、纵卷叶野螟属物种（Cnaphalocrocis spp.) (例如，稻纵卷叶野螟（C. medinal i s))、潜蝇属物种（Agromyza spp.)(例如，日本稻 潜蝇（A.oryzae)或玉米斑潜蝇（A.parvicornis))、杆草螟属物种（Diatraea spp.) (例如，小鹿螟（D. saccharalis)或西南玉米杆草螟（D. grandiosella))、Narnaga属 物种（例如，绿稻毛虫（N. aenescens))、黄夜蛾属物种（Xanthodes spp.)(例如，犁 纹黄夜蛾（X. transversa))、灰翅夜蛾属物种（Spodoptera spp.)(例如，草地贪夜蛾 (S.frugiperda)、甜菜夜蛾（S.exigua)、海灰翅夜蛾（S.littoralis)或西部黄条夜蛾 (S. praefica))、秘夜蛾属物种（Mythimna spp.)(例如，粘虫（Mythmna(Pseudaletia) seperata))、铃夜蛾属物种（Helicoverpa spp.)(例如，谷实夜蛾（H.zea))、Colaspis 属 物种（Colaspis spp.)(例如，葡萄肖叶甲（C.brunnea))、稻水象属物种（Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲（L.oryzophilus))、稻象属物种（Echinocnemus spp.)(例如，稻 象（E. squamos))、稻铁甲属物种（Diclodispa spp.)(例如，水稻铁甲（D. armigera))、 禾谷负泥虫属物种（Oulema spp.)(例如，水稻负泥虫（0. oryzae))、米象属物种 (Sitophilus spp.)(例如，米象（S. oryzae))、Pachydiplosis 属物种（例如，稻瘿蚊 (P.oryzae))、毛眼水蝇属物种（Hydrellia spp.)(例如，麦叶毛眼水蝇（H.griseola)或 日稻毛眼水蝇（H. sasakii))、Chlorops属物种（例如，稻杆潜蝇（C. oryzae))、根萤叶甲 属物种（Diabrotica spp.)(例如，玉米根叶甲（D.virgifera virgifera)、北美玉米根 叶甲（D. barberi)、黄瓜十一星叶甲食根亚种（D. undecimpunctata howardi)、墨西哥玉 米根叶甲（D.virgifera zeae)、条纹黄瓜叶甲（D.balteata))、杆野螟属物种（Ostrinia spp.)(例如，玉米螟（0. nubilalis))、地虎属物种（Agrotis spp.)(例如，小地老虎 (A. ipsilon))、Elasmopalpus属物种（例如，南美玉米苗斑螟（E. lignosellus))、梳爪叩 头虫属（Melanotus spp.)(线虫）、圆头犀金龟属（Cyclocephala spp.)(例如，北部伪装 金龟（C. borealis)或南部伪装金龟（C. immaculata))、弧丽金龟属物种（Popillia spp.) (例如，日本弧丽金龟（P. japonica))、跳甲属物种（Chaetocnema spp.)(例如，玉米铜色跳 甲（C.pulicaria))、龙颈象属物种（Sphenophorus spp.)(例如，玉米长_象（S.maidis))、 溢管姆属物种（Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米姆（R.maidis))、圆尾姆属（Anuraphis spp.)(例如，玉米根姆（A.maidiradicis))、黑幢属物种（Melanoplus spp.)(例如，红足 黑虫皇（M.femurrubrum))、特异黑幢（M.differentialis)或迁飞黑幢（M.sanguinipes))、 种蝇属物种（Hylemya spp.)(例如，种蝇（H. platura))、呆蓟马属物种（Anaphothrips spp.)(例如，黄呆蓟马（A. obscrurus))、火蚁属物种（Solenopsis spp.)(例如，盗 蚁（S. milesta))、叶螨属物种（Tetranychus spp.)(例如，二点叶螨（T. urticae)、朱 砂叶螨（T. cinnabarinus)、铃夜蛾属物种（例如，谷实夜蛾或棉铃虫（H. armigera))、 Pectinophora属物种（例如，红铃麦蛾（P.gossypiella))、金刚钻属物种（Earias spp.) (例如，翠纹钻夜蛾（E. vittella))、实夜蛾属物种（Heliothis spp.)(例如，烟芽夜蛾 (H.virescens))、花象属物种（Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉铃象（A.grandis))、 Pseudatomoscelis属物种（例如，棉伪斑腿盲蝽（P. seriatus))、结翅粉風属物种 (Trialeurodes spp.)(例如，结翅粉風（T. abutiloneus)、温室粉風（T. vaporariorum))、 小粉風属物种（Bemisia spp.)(例如，银叶粉風（B. argentifolii))、姆属物种（Aphis spp.)(例如，棉姆（A. gossypii))、草盲蝽属物种（Lygus spp.)(例如，美国牧草盲蝽 (L· lineolaris)或美洲牧草盲蝽（L. hesperus))、美洲蝽属物种（Euschistus spp.) (例如，斑点美洲蝽（Ε· conspersus))、Chlorochroa属物种（例如，赛氏蝽（C. sayi))、 绿蝽属物种（Nezara spp.)(例如，稻绿蝽（N.viridula))、蓟马属物种（Thrips spp.) (例如，烟蓟马（T.tabaci))、花蓟马属物种（Frankliniella spp.)(例如，烟褐蓟马 (F.fusca)或西方花蓟马（F.occidentalis))、绿小叶蝶属物种（Empoasca spp.)(例如， 蚕豆小绿叶蝶（E.fabae))、瘤姆属物种（Myzus spp.)(例如，桃姆（M.persicae))、薯个 木風属物种（Paratrioza spp.)(例如，马铃薯木風（P. cockerelli))、宽胸金针虫属物 种（Conoderus spp.)(例如，南部马铃薯线虫（C.falli)或烟草线虫（C.vespertinus))、 麦蛾属物种（Phthorimaea spp.)(例如，马铃薯麦蛾（P. operculella))、长管姆属物种 (Macrosiphum spp.)(例如，大戟长管姆（M. euphorbiae))、Thyanta 属物种（例如，红 肩蝽象（1'.?&111(1〇^1^1^))、麦蛾属物种（例如，马铃薯麦蛾）、铃夜蛾属物种（例如，谷 实夜蛾）、Keiferia属物种（例如，番爺蠹蛾）、金针虫属物种（Limonius spp.)(线虫）、 Manduca属物种（例如，烟草天蛾（M. sexta)或番爺天蛾（M. quinquemaculata))、斑潜蝇 属物种（Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潜蝇（L. sativae)、三叶草斑潜蝇（L. trifolli) 或南美斑潜蝇（L.huidobrensis))、果蝇属物种（Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蝇 (D. melanogaster)、D. yakuba、拟暗果妮（D. pseudoobscura)或拟果妮（D. simulans))、 步甲属物种（Carabus spp.)(例如，粒步甲（C.granulatus))、摇蚊属物种（Chironomus spp.)(例如，摇蚊（C. tentanus))、柿首蚤属物种（Ctenocephalides spp.)(例如，猫柿首 蚤（C.felis))、非耳_象属物种（Diaprepes spp.)(例如，根象鼻虫（D.abbreviatus))、 齿小蠹属物种（Ips spp.)(例如，美松齿小蠹（I.pini))、拟谷盗属物种（Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗（Τ· castaneum))、舌蝇属物种（Glossina spp.)(例如，刺舌蝇 (G.morsitans))、按蚊属物种（Anopheles spp.)(例如，甘比亚按蚊（A.gambiae))、铃夜蛾 属物种（例如，棉铃虫（H. armigera))、Acyrthosiphon属物种（例如，豌豆虫牙（A. pisum))、 蜜蜂属物种（Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂（A.melifera))、Homalodisca属物种（例如， 琉璃叶蝶（H. coagulate))、伊蚊属物种（Aedes spp.)(例如，埃及斑纹（Ae. aegypti))、蚕 蛾属物种（Bombyx spp.)(例如，家蚕（B.mori))、飞幢属物种（Locusta spp.)(例如，飞 幢（L.migratoria))、牛蝶属物种（Boophilus spp.)(例如，微小牛蝶（B.microplus))、 Acanthoscurria属物种（例如，红毛巧克力捕鸟蛛（A. gomesiana))、甲蠊属物种 (Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊（D.punctata))、袖蝶属物种（Heliconius spp.) (例如，瓦氏袖蝶（H.erato)或诗神袖蝶（H.melpomene))、象虫属物种（Curculio spp.) (例如，欧洲栎象（C. glandium))、Plutella属物种（例如，菜蛾（P. xylostella))、花 蝶属物种（Amblyomma spp.)(例如，彩饰花蝶（A.variegatum))、作蚕属物种（Anteraea spp.)(例如，天蚕（A. yamamai))和阿蚊属物种（Armigeres spp.)(例如，骚扰阿蚊 (A. subalbatus)) 〇
36. 用于防止昆虫在基层上生长的方法，其包括将权利要求10至18中任一项的组合物 或权利要求19的喷雾剂应用到所述基层。
37. 用于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病或病症的方法，其包括将权利要求10至 18中任一项的组合物或权利要求19的喷雾剂施用于有此治疗和/或预防需要的对象。
【文档编号】C12N15/113GK104087577SQ201410305513
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2007年1月12日 优先权日:2006年1月12日
【发明者】罗曼·雷马克斯, 劳伦特·库布勒, 格特·普莱廷克, 埃尔丝·万布勒, 蒂埃里·博盖尔特 申请人:德福根有限公司