专利名称：鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测和鉴定特定寄生虫的试剂盒。确切讲本发明是一种可用于针对羊吕氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫的多重PCR鉴定试剂盒。
背景技术：
羊泰勒虫可感染绵羊和山羊，呈全球性分布，来源于不同地域的羊泰勒虫可能具有不同的生物学特性和致病性。根据虫体形态、传播媒介、致病力、培养特性等，并结合羊泰勒虫18S rRNA基因序列差异，目前将羊的泰勒虫共分为6个种，即莱氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、分离泰勒虫、隐藏泰勒虫、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫。在我国，已报道的羊泰勒虫病的病原有尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫三种。经传播试验和感染实验证实,不同地方泰勒虫虫株，在一定程度上存在致病力强弱差别。而泰勒虫的种属鉴定可以为其种间差异的研究奠定很好的基础，因此，建立一种快速、准确的鉴定方法是非常必要的。目前，对于泰勒虫的种间鉴定主要依赖单一虫种的PCR检测，其检测时间长，步骤复杂，不能很好的满足野外样品的快速检测与鉴定工作。目前，国内已有一些鉴定牛泰勒虫的方法，但对于羊泰勒虫大部分是通过单一 PCR或血清学方法进行鉴定，其鉴定时间长，步骤也较为繁琐。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足的，可同时检测和鉴定多种羊泰勒虫的试剂盒。
本发明的鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒中包括有三对特异性引物，它们分别是:羊吕氏泰勒虫上、下游引物，羊尤氏泰勒虫上、下游物和绵羊泰勒虫上、下引物。本发明的具体实施例中。鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒内的引物分别为SEQID Na U SEQ ID Na 2、SEQ ID Na 3、SEQ ID Na 4、SEQ ID Na 5 和 SEQ ID Na 6。为方便具体的使用，本发明的的鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒内还可放置有10XPCR Buffer+MgC12，dNTP，去离子水，DNA 聚合酶。本发明的试剂盒中的引物是依据泰勒虫较为保守的5.8s序列设计，因此在流行病学调查方面有更好的说明性，稳定性也较高，这一点明显优于现有技术的试剂盒引物设计运用的表面蛋白基因，因为各虫种的表面蛋白基因间变异性较大。同时，本发明试剂盒三对引物均设计于同一段保守基因，可为后续研究工作的完善和发展奠定一定基础，例如引入套式PCR技术，可提高整体鉴定检出能力。本发明的试剂盒基于普通的PCR技术，操作简便，试剂价格低廉,并且能够同时、快速的检测目前国内所有的羊泰勒虫虫种，极大的减少了检测时间及费用，同时为其他后续研究奠定了很好的基础。本发明的试剂盒可一次同时检测全部羊泰勒虫虫种，极大克服了部分现存检测方法的缺点，可为日后相关工作的开展提供一定的依据。
附图1为本发明特异性检测的电泳图，其中=MSMaker DL2000，I为牛瑟氏泰勒虫DNA，2为牛中华泰勒虫DNA，3为牛环形泰勒虫DNA，4为羊临潭巴贝斯虫DNA，5为羊新疆巴贝斯虫DNA，6为牛巴贝斯虫DNA，7为羊吕氏泰勒虫DNA，8为羊尤氏泰勒虫DNA，9为绵羊泰勒虫DNA, 10为羊吕氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫混合DNA ；。附图2为本发明灵敏度检测的电泳图，其中:1浓度为800μ g/mL的羊吕氏泰勒虫羊尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫混合DNA, ；2为400 μ g/mL的羊吕氏泰勒虫羊尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫混合DNA, 3为200 μ g/mL的羊吕氏泰勒虫羊尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫混合DNA, 4为100 μ g/mL的羊吕氏泰勒虫羊尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫混合DNA ；
附图3为对野外样品检测的电泳图，其中泳道1-21为舟曲地区的关基本组DNA，而22泳道为羊吕氏泰勒虫羊尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫混合DNA。
具体实施例方式以下结合本发明的实施例解说.制备如下三对特异性引物:
(1)羊吕氏泰勒虫上游引物5-’ GATGTGTTGGTTGAGGGTGCTATG-3’ (SEQ ID Na I)
羊吕氏泰勒虫下游引物 5’ -CGTCAATCACAACCCGATACTTTAC-3’ (SEQ ID Na 2)
(2)羊尤氏泰勒虫上游物引物5’-TCCATCACCCAATGTTTC-3’ (SEQ ID Na 3)
羊尤氏泰勒虫下游物引物 5’-TAGCGTTAGTCGGTAGGG-3’ (SEQ ID Na 4)
(3)绵羊泰勒虫上游引物5’-TCTCGCATTAAGGCCTCCGGCT-3’ (SEQ ID Na 5)绵羊泰勒虫下游引物 5’-TCCAACGGATGGTAGCCTCGCA-3’ (SEQ ID Na 6)
特异性试验:
实验室条件下，家畜体内培养与羊泰勒虫种属相近的梨形虫虫种，分别采染虫家畜抗凝血300 μ L，提取其基因组作为模板验证引物特异性。具体虫种名称如下:羊吕氏泰勒虫，羊尤氏泰勒虫，绵羊泰勒虫，羊临潭巴贝斯虫，羊新疆巴贝斯虫，牛巴贝斯虫，牛瑟氏泰勒虫，牛环形泰勒虫，牛中华泰勒虫(以上虫种均保存于中国农业科学院兰州兽医研究所)；取各受试样本DNA以上述引物进行PCR反应:
PCR 反应条件:94°C 预变性 3 min ；94°C 30 s、59°C I minlO s、72°C I min 进行 35个循环，72°C延伸8 min结束。PCR 反应体系:10 X PCR Buf f er+MgC12 共 3 μ L，dNTP 2 μ L，模板 I μ L，上游混合引物(羊吕氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫上游引物各0.3 μ L，引物浓度50μπιΟ1/mL)，下游混合引物(羊吕氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫下游引物各0.3 μ L，引物浓度50 μ mol/mL), DNA聚合酶0.3 μ L，去离子水16.9 μ L，构建25 μ L反应体系。产物检测:将5 μ L产物与I μ L溴甲酚蓝混合，配制1%的琼脂糖凝胶，电压120 V、电流120 mA条件下进行电泳检测，于凝胶成像系统中观察结果。从检测结果(图1)中可看出，本套检测方法有较好特异性，在330bp、540bp、880bp左右分别产生了羊吕氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫以及绵羊泰勒虫的特异性条带，而与羊临潭巴贝斯虫，羊新疆巴贝斯虫，牛巴贝斯虫，牛瑟氏泰勒虫，牛环形泰勒虫，牛中华泰勒虫均无交叉反映。
敏感性试验:将提取的三种虫体基因组经浓度测定后等浓度混合，将其分别稀释成总浓度为800 V- g/mL、400 u g/mL, 200 u g/mL, 100 u g/mL后进行多重PCR检测验证。从检测结果(图2)可看出，当模版总浓度稀释为100 ymol/时无羊尤氏泰勒虫及绵羊泰勒虫基因扩增产物生成，而其他浓度的模版均能够产生较亮特异性条带，因此其样品的最小检出浓度为200ii g/mL。野外样品检测:
对2012年舟曲地区血样所提取的基因组共21份进行多重PCR检测，结果如图3所示。其中，感染羊吕氏泰勒虫绵羊数10只，感染羊尤氏泰勒虫绵羊数I只，感染绵羊泰勒虫绵羊只0份，羊尤氏泰勒虫与羊吕氏泰勒虫的混合感染绵羊数3只，羊吕氏泰勒虫感染率为47.62%，羊尤氏泰勒虫感染率为4.76%，绵羊泰勒虫感染率为0，羊尤氏泰勒虫与羊吕氏泰勒虫混合虫种感染率14.29%o`
权利要求
1.鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有三对特异性引物，它们分别是:羊吕氏泰勒虫上、下游引物，羊尤氏泰勒虫上、下游物和绵羊泰勒虫上、下引物。
2.根据权利要求1所述的鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒，其特征在于试剂盒内的引物分别为 SEQ ID Na K SEQ ID Ns 2、SEQ ID Ns 3、SEQ ID Ns 4、SEQ ID Na 5 和 SEQ IDNa 6。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有IOXPC R Buffer+MgC12, dNTP，去离子水，DNA聚合酶。
全文摘要
本发明公开一种用于检测和鉴定对羊吕氏泰勒虫、羊尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫的多重PCR鉴定试剂盒。本发明的鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒中包括有三对特异性引物，它们分别是羊吕氏泰勒虫上、下游引物，羊尤氏泰勒虫上、下游物和绵羊泰勒虫上、下引物。本发明的具体实施例中。鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒内的引物分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。用本发明的试剂盒检测具有操作简便、试剂价格低廉，并能同时、快速的检测目前国内所有的羊泰勒虫虫种的优点。
文档编号C12Q1/04GK103146836SQ20131010195
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月27日 优先权日2013年3月27日
发明者殷宏, 罗见勋, 李有全, 张晓 , 刘志杰, 陈泽, 杨吉飞, 关贵全, 牛庆丽, 任巧云, 刘爱红, 刘军龙, 马米玲, 岺双庆, 何海宁 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所