专利名称：检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜及方法
技术领域：
本发明涉及一种检测青海血蜱体内是否带有牛羊梨形虫，并可区分出患病 动物寄生有何种梨形虫的检测膜、这种检测膜的制备方法和使用方法。
技术背景梨形虫病是由顶复门、梨形虫纲中、梨形虫目的巴贝斯科和泰勒科的原虫 引起的血液原虫病的总称。梨形虫病又名"焦虫病"或"血孢子虫病"。是由 媒介蜱传播的巴贝斯科的巴贝斯属和泰勒科的泰勒属的多种梨形虫寄生于红细 胞内所引起的血液原虫病，临床以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为主要特征， 严重时可造成死亡。由于全世界各地分布有各种各样的蜱类，所以该病的分布也很广，1914年最先发现于埃及，随后在非洲、欧洲、亚洲的许多国家都发现 该病原。比如原苏联、印度、斯里兰卡、日本，南美洲，非洲，亚洲，以及 南欧等地都有此病发生的报道。我国的养牛、羊区主要分布于北部地区。相关 调查表明，在这些地区梨形虫病甚为流行。青海血蜱隶属于硬蜱科，是邓国藩 1978年命名的一个新种。它分布于我国的青海，甘肃，宁夏，四川，云南等海 拔高度在1600-4200米的区域，国外尚无记录，该蜱生活与山区草地或灌木丛， 属三宿主蜱，在自然界3年完成1个世代[2]，近年来的研究表明，青海血蜱是羊泰 勒虫，包括尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫，中华泰勒虫和羊莫氏巴贝斯虫四种梨形 虫病的传播媒介。现有技术中对梨形虫病的诊断方法主要包括三种方法(l)通过血涂片的方 法和临床症状，参见Leemans I, Hooshmand-Rad P， Uggla A. The indirect fluorescent antibody test based on schizont antigen for study of the sheep parasite T72ez7en.a ksfc^waraf/[J]. Veterinary Parasitology, 1997， 69(1-2): 9 18. 。 (2)应用一 些血清学方法，如:补体结合试验(CFT)和间接荧光抗体试验(IFAT)检测，但 这些方法很难排除不同种之间的交叉反应，而且常会出现假阳性和漏检，参见 Bruning A. Equine piroplasmosis an update on diagnosis[J]. Br Vet J, 1996， 152: 139 151禾口Papadopoulos B， Brossard M, Perie NM (1996) Piroplasms of domestic animals in the Macedonia region of Greece. Piroplasms of small ruminants. Vet Parasitol 63:67-74.。 (3) PCR技术，是目前检测泰勒虫最常用的分子诊断方法， 与常规的方法相比具有敏感性高、特异性强、检出率高等优点。但PCR方法通常 不能同时检测出混合感染的发生，参见Alhassan A, Pumidonming W, OkamuraM, Hirita H， Battsetseg B， Fujisaki F， Yokoyama N, Igarashi I (2005) Development of asingle-round and multiplex PCR method for the simultaneous detection of Babesia caballi and Babesia equi in horse blood. Vet Parasitol 129:43~49,。提供一种能同时检测出被检牛羊是否患有梨形虫病，特别是能检测出混合 感染，并区分出患病动物所患为何种梨形虫病，对牛羊的饲养、疾病防治有着 积极的意义。 发明内容本发明提供一种能同时检测出被检牛羊是否患有梨形虫病，特别是能检测 出混合感染，并可以区分出患病动物所患为何种梨形虫病的检测膜，以及这种 检测膜的制备方法和使用方法。本发明用于检测牛羊体内吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和梨形虫的检测膜是在 Biodyne C薄膜上固定有吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，或者其上 还固定有巴贝斯虫特异性寡核苷酸和泰勒虫通用特异性寡核苷酸。本发明用于检测牛羊体内吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和梨形虫的检测膜中， 在Biodyne C薄膜上固定的吕氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为 atcttctttttgatgagttg,固定的尤氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为tgcattttccgagtgttact， 固定的梨形虫通用寡核苷酸序列为ctgtcagaggtgaaattct，固定的巴贝斯虫通用寡 核苷酸序列为ccttggtaatggttaataggaa，固定的中华泰勒虫特异性寡核苷酸探针序 列为tcgcatetcttgctgagtg ，固定的莫氏巴贝斯虫特异性寡核苷酸序列为 gaatgatgccgacttaaaccct 。本发明用于检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜的制备方法是分别人工 合成出梨形虫通用寡核苷酸探针，泰勒虫通用寡核苷酸探针，巴贝斯虫通用寡 核苷酸探针，中华泰勒虫特异性寡核苷酸，莫氏巴贝斯虫特异性寡核苷酸，吕 氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，将所得到的各寡核苷酸5'端用氨基 团修饰，再将其分别共价结合到带有负电荷的Biodyne C薄膜上。采用本发明的检测膜检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的方法是以从待检青海 血蜱体内提取的DNA作为模板，在泰勒虫和巴贝斯虫18S rRNA基因序列V4 高变区两端的保守区域设计一对扩增出的片段大小为480bp-491bp的引物，其中 一条引物用生物素标记，然后进行PCR扩增，获得生物素标记的PCR产物，生 物素标记的PCR产物和固定在Biodyne C膜上的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸 进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内，在薄膜 上放X光胶片进行曝光，再对胶片进行显影和定影处理，根据胶片上产生的强 度信号确定被检动物是否有患有相应的疾病。综上所述，本发明根据己报道的梨形虫18SrRNA基因序列设计梨形虫的通用性引物对和梨形虫种特异性寡核苷酸探针固定于Biodyne C薄膜上，将PCR 方法和RLB方法相结合建立了一种特异，敏感的诊断方法，可以识别相应的梨 形虫种或属；其敏感性明显高于槽式PCR方法。 本发明有如下优点采用本发明的检测膜可以很方便地检测出被检青海血蜱体内是否带有梨形 虫，并可区分出青海血蜱体内所带的为何种梨形虫，例如携带的是中华泰勒虫， 莫氏巴贝斯虫还是吕氏泰勒虫或尤氏泰勒虫。由于本发明的检测膜上还固定有 梨形虫的通用寡核苷酸探针，因此本发明可以同时检测多个虫种的存在，这对 于牛羊群疾病的控制及预防治疗有积极的意义。本发明的方法最大优点是可以同时检测出青海血蜱体内同时携带有泰勒 虫和巴贝斯虫的情况，而且只需要作一次PCR，如果有扩增产物，说明该蜱肯定 是携带有巴贝斯虫或泰勒虫的某一种或几个种。另外，PCR产物与探针杂交后， 还能说明被检蜱所携带的虫体的种类，这对于疾病的控制及预防有更为积极的 意义。第三，本发明的敏感性要高于PCR，且能同时区分病原的属和种，这一特 性在流行病学调查上具有重要意义。由于与探针杂交的PCR产物可以除去，因此 杂交膜可以反复使用，据报道这种膜至少可以使用20次以上，另外，在一张膜 上，可以固化45个探针，同时检测45个PCR产物，其成本相对低廉。采用本发明的检测膜进行检测的方法非常的简单，而且检测用时较少，其 检测成本相对也比较低，而且漏检率要远远小于现有技术。
图1为青海血蜱体内四种牛羊梨形虫RLB标准阳性特异性试验图。
具体实施方式
一、引物和探针的设计与合成泰勒虫和巴贝斯虫的特异性寡核苷酸序列根据每个虫种的18S rRNA基因 序列设计。在泰勒虫和巴贝斯虫18SrRNA基因序列V4高变区两端的保守区域 设计一对扩增出的片段大小为480bp-491bp的引物，其中上游引物RLB-F (5-gaggtagtgacaagaaataacaata-3),下游弓l物RLB-R (biotin-5- tcttcgatcccctaactttc -3)，根据已确定的18SrRNA基因序列的V4高变区域设计针对莫氏巴贝斯虫、 中华泰勒虫、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫不同虫种的四个特异性寡核苷酸探针(这 里的问题是仅以现在的记载，是否本领域技术人员也可设计出这四个特异性寡 核苷酸探针，如不行则需要给出设计探针的技术及相关要求)，即B.m， T.s， T. l和T. u，另外，针对所有梨形虫的通用探针catch-all和泰勒虫通用探针，巴 贝斯虫通用探针Tall, Ball也分别被设计合成。所有的寡核苷酸探针N-(trifluoroacetamidohexyl-cyanoethyl, N, N-diisopropyl phosphoramidite[TFA])-C6氨基团连接修饰，将合成的探针0-800pmol/150ul 500mM NaHC03(pH8.4)，寻找最佳浓度用于杂交。本发明所用的核酸探针序列和其最佳浓度见表.1，所涉及的梨形虫和它们对应的寡核苷酸探针识别模式见表2。二、含有泰勒虫和巴贝斯虫特异寡核苷酸Biodyne C膜的制备 所有的寡核苷酸5'端被氨基团修饰后合成。它们能够共价结合到带有负电荷的Biodyne C薄膜上。按照Gubbels等1999描述的方法改进后进行操作，基本过程如下(1) 用149ul 500 mM NaHC03. pH 8,4(每次都要精确校对pH值)稀释泰勒 虫和巴贝斯虫的特异性寡核苷酸到己经确定的最佳浓度。(2) 将BiodyneC膜剪成14.5cmX14.5cm大小，用记号笔标记薄膜以便能 在以后的操作中辨别方向。用去离子水配制新鲜的16% (w/v) l-ethyl-3-(3陽dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)，力口 10ml孵育10分钟活 化BiodyneC膜，室温下旋转培养瓶。(3) 将薄膜放在塑料容器中用去离子水摇洗两分钟，然后放入洁净的印迹 仪中。旋紧手柄。(4) 通过抽吸除去孔里残留的液体。将150ul稀释的寡核苷酸溶液加入印 迹仪的孔槽，第一个和最后一个孔不加寡核苷酸。(5) 将墨水用2xSSPE缓冲液按1: 100的比例稀释，加入第一个孔和最 后一个孔。(6) 所有的样品都加入以后，室温下孵育2分钟。(7) 通过抽吸除去每个孔槽内的寡核苷酸溶液及第一和最后一个孔槽的墨 水稀释液。(8) 用镊子从印迹仪中除去膜,然后用250ml新鲜配制的100mMNaOH(最 大量)在塑料容器中孵育10分钟，不断摇动容器使膜钝化。(9) 用去离子水漂洗薄膜。(10) 在塑料容器中用250 ml 2x SSPE /0.1% SDS 60。C漂洗5分钟，漂洗 期间轻微摇动溶液瓶。(11) 用100ml20mMEDTApH8，0在塑料容器中漂洗薄膜，室温下轻轻 摇动15分钟。(12) 4°C保存薄膜直到使用(用塑料制品密封或者用包装膜包装避免薄膜 脱水)。三、 蜱体内虫体基因组DNA的提纯
1、 从待检测区域捕捉蜱。
2、 将蜱进行清洗，并用70%的酒精洗蜱三次，置于干净纸巾上，确定蜱的 雌雄。
3、 取出蜱，置于Ependorf管的盖子内，用两只12针头将蜱中间切开，再 切成4块，然后放入加有100ul cell lysis solution的Ependorf管内，颠倒数次， 使所有的组织进入cell lysis solution ，盖住管，在管子上标记好样品的性别及来 源。
4、 在加热振荡器上65"C、 800rpm条件下加热2小时。
5、 加入腦Ase0.5ul，颠倒25次，65°C， 15分钟。
6、 力口入40ul Protein Preciptation solution
7、 Vertex 20second,使溶液完全混合。
8、 13000g离心3分钟
9、 将上清移置一标记好的Ependorf管中，加入lOOul异丙醇，颠倒50次。
10、 13000g离心10分钟
11、 倾去上清，置于干净的吸水纸上，吸干剩余液体。
12、 加入100ul70。/。的乙醇
13、 13000g离心3分钟，小心除去乙醇，在吸水纸上吸干剩余液体。
14、 在DNA干燥仪上干燥。
15、 加入20ulDNA Hydration solution,将其加热至65。C后保温1小时，再 冷却至将4'C或者-2(TC保存。
本发明的实施例中采用GENTRA的DNA提取试剂盒提取蜱的DNA。
四、 PCR扩增
基因片段PCR扩增的反应体系及程序
H20 56.0(il
10x buffer* 7.2|il
10mMdNTP 1.6^1
lOOuM上游引物(RLBF) 3.6(il
lOOuM下游引物(RLBR) 3.6|^1
Genomic DNA lul
Taq酶 0.36|il
*(200 mM Tris-HCl (pH 8.55), 160mM (NH4)2S04禾B 20mM MgC12)> 40个循环
所有的样品混合后12000rpm离心10秒，置于PCR扩增仪中按照如下循环
进行扩增
94 °C 3min
94 。C lmin30sec
55。C lmin30sec
72 。C lmin30sec
72 。C 3min
4°C 保存 取PCR产物1.5ul在1.0。/。的琼脂糖凝胶(含0.5。/。ug/ml溴化乙锭)，在75伏的电压
下进行电泳分析，观察扩增结果。
五、检测青海血蜱体内牛羊梨形虫RLB方法的建立
生物素标记的PCR产物和固定在Biodyne C膜上的泰勒虫和巴贝斯虫的寡 核苷酸进行杂交。如果存在泰勒虫或巴贝斯虫，则和寡核苷酸特异性作用后用 streptavidin-peroxidase和ECL-detection (增强化学发光)孵育后在黑色的方格里 面的胶片上可以看到显影，操作步骤如下
(1) 准备下面的缓冲液，用无离子水稀释，所有的缓冲液使用前要预热。 (按一张膜的量)
250 ml 2xSSPE/0.1% SDS, 60。C, 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS, 60oC， 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS, 42。C. 500ml2xSSPE,室温.
(2) 加20 nl的PCR产物至ij 130 pi 2xSSPE/0.1 % SDS中。
(3) 稀释后的PCR产物99°C热激10分钟然后立即在冰中冷却。
(4) 用250 ml2xSSPE/0.1% SDS 60°C漂洗膜5分钟。
(5) 在印迹仪中按照与寡核苷酸成垂直的方向放入薄膜和支持气垫。
(6) 通过抽吸的方法除去印迹仪中残留的液体。
(7) 用稀释后的PCR产物填充孔槽，在水平面上60。C杂交10分钟。
(8) 通过抽吸除掉印迹仪中的样品，然后用镊子将膜取出。
(9) 用250ml2xSSPE/0.5。/。SDS60。C， IO分钟，漂洗膜两次。
(10) 放置膜在旋转瓶中使其冷却，以免下一步因过氧化物酶作用而失活。
(11) 加入2.5ul链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(500U/ml)结合到10ml 2xSSPE/0.5°/。 SDS中，将此溶液加入旋转瓶中42°C孵化薄膜45-60分钟。
(12) 用250 ml的2xSSPE/0.5% SDS溶液42°C 10分钟漂洗两次。(13) 用250 ml的2xSSPE在室温下5分钟漂洗膜两次。
(14) 力口 lml免疫印迹发光氨试剂A于一个5ml试管中，随后加入lml的 试剂B，混合均匀。
(15) 将薄膜放置在塑料布或者包装膜内，滴加A、 B混合液在膜上含有 寡核苷酸和PCR产物杂交的区域，用塑料层覆盖膜，塑料薄膜封闭器封闭薄膜。
(16) 放置封闭好的薄膜于曝光储片夹内，放一张X光胶片在薄膜上(在 胶片的左侧角打折为了以后辨认方向)，曝光30分钟。
(17) 取出X光胶片放入显影液中显影5分钟，然后用无离子水漂洗2分 钟，随后转入定影液中定影5分钟，再用无离子水漂洗，充分洗去定影液后观 察结果。
(18) 如果胶片上的信号太弱或太强，可延长或縮短曝光时间将薄膜直接 曝光于另一张胶片。杂交过的PCR产物可以从膜上除去。 一张膜可以重复利用 大约15次。
结果判定通过PCR扩增表1中列出的所有虫株的18SrRNA基因V4高变 区域，产生的DNA片段和固定在薄膜上的寡核苷酸探针进行核酸杂交，寡核苷 酸探针经光学发光作用，在胶片上产生一定强度的信号，所有的探针仅与它们 各自的靶序列进行结合，不同的种、属和株之间没有交叉反应，很清楚的与相 应的虫种或者株产生杂交信号。每个泰勒虫种可以被四个核苷酸探针识别梨 形虫通用探针(ca841-859)，泰勒虫通用探针(T-all 811-832),和吕氏泰勒虫探针 (T-l 628-647)或尤氏泰勒虫探针(T-u 678-697)或中华泰勒虫(T. s 627-645)。 巴 贝斯虫可被三个探针识别梨形虫通用探针(ca841-859)、巴贝斯通用探针(B-all 745-766)，和莫氏巴贝斯虫探针(B.m466487)。附结果见图1。
通过对甘肃省甘南自治州临潭县的99份青海血蜱样品进行实际检测，并与 特异性引物扩增的槽式PCR方法进行比较，RLB的检出率明显高于槽式PCR 方法，该方法可以检测出梨形虫的种类和混合感染的情况，为梨形虫病的检测、 虫种鉴定和流行病学调査提供了工具。附表:
表.1，泰勒虫和巴贝斯虫寡核苷酸探针序列和最佳浓度
寡核苷酸 (Oligonucleotides)
序列
(Sequence5'-3')
最佳浓度 (Optimised concentrations)
梨形虫通用探针
(Cat-all) (ca 841-859) 巴贝斯虫通用探针
(￡-all) (B-all 745-766) 泰勒虫通用探针
(r-all) (T-all 811-832) 莫氏巴贝斯虫探针
(￡. motaw.) (B. m 466^487) 中华泰勒虫探针 (7". sinensis) (T. s 627-645) 吕氏泰勒虫探针
(71. /脂e/ts/ ,' ) (丁.l 628-647)
CTGTCAGAGGTGAAATTCT
CCTTGGTAATGGTTAATAGGA
A
TACCAAAGTAATGGTTAATAG
G
GAATGATGCCGACTTAAACCC
TCGCATCTCTTGCTGAGTG
ATCTTCTTTTTGATGAGTTG
J00 200pmo1
100 200pmol
10 50pmol
100 200pmol
600 800pmol
300 400pmol
尤氏泰勒虫探针 (r. !^7ew6e/^ ) 678-697)
(T.u
TGCATTTTCCGAGTGTTACT
600 800pmol
表2本发明所涉及的梨形虫和它们对应的寡核苷酸探针识别模式
种群
Isolates
吕氏泰勒虫(麻当株) 7 /證e似tew' (Madang)
中华泰勒虫(渭源株)
尤氏泰勒虫(隆德株) T (Longde)
莫氏巴贝斯虫(宁县株)
种 Species
7!
7
寡核苷酸
Oligonucleotide
种特异性 Species-specific
T. 1
属特异性 Group-specific
T. s
T. i
B. m
T-all
B-all
(Cat-All)
权利要求
1、一种用于检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜，其特征是在Biodyne C薄膜上固定有牛羊梨形虫的特异性寡核苷酸探针。
2、 根据权利要求l所述的用于检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜，其 特征是牛羊梨形虫的通用特异性寡核苷酸探针序列为ctgtcagaggtgaaattct。
3、 根据权利要求2所述的用于检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜，其 特征是在Biodyne C薄膜.卜.还固定有巴贝斯虫通用寡核苷酸探针和泰勒虫通用 寡核苷酸探针。
4、 根据权利要求3所述的用于检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜，其 特征在于在Biodyne C薄膜上固定的巴贝斯虫通用特异性寡核苷酸探针序列为 ccttggtaatggttaataggaa ，固定的泰勒虫通用寡核苷酸探针序列为 taccaaagtaatggttaatagg ，固定的吕氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为 atc加tttttgatgagttg，固定的尤氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为tgcattttccgagtgttact， 固定的梨形虫特异性寡核苷酸序列为ctgteagaggtgaaattct，固定的中华泰勒虫特 异性寡核苷酸探针序列为tcgcatctcttgctgagtg,固定的莫氏巴贝斯虫特异性寡核苷 酸序列为gaatgatgccgacttaaaccct 。
5、 权利要求1或2所述的用于检测青海血蜱体内梨形虫的检测膜的制备方 法，其特征是人工合成出牛羊梨形虫的特异性寡核苷酸探针，将所得到的寡核 苷酸5'端用氨基团修饰，再将其共价结合到带有负电荷的Biodyne C薄膜上。
6、 权利要求3或4所述的用于检测青海血蜱体内梨形虫的检测膜的制备方 法，其特征是人工分别合成出牛羊梨形虫的特异性寡核苷酸探针、巴贝斯虫通 用寡核苷酸探针、泰勒虫通用寡核苷酸探针及中华泰勒虫、莫氏巴贝斯虫特异 性寡核苷酸探针、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸探针，将所得到 的各寡核苷酸5'端用氨基团修饰，再将其分别共价结合到带有负电荷的Biodyne C薄膜上。
7、 采用权利要求1至4所述的任'检测膜检测青海血蜱体内梨形虫的方法， 其特征是以从青海血蜱体内提取的DNA作为模板，在牛羊梨形虫18S rRNA基 因序列V4高变区两端的保守区域设计一对扩增出的片段大小为480bp-491bp的 引物，其中一条引物用生物素标记，然后进行PCR扩增，获得生物素标记的PCR 产物，生物素标记的PCR产物和固定在Biodyne C膜上的泰勒虫和巴贝斯虫的 寡核苷酸进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内， 在薄膜上放X光胶片进行曝光，再对胶片进行显影和定影处理，根据胶片上产 生的强度信号确定被检蜱是否带有相应的梨形虫。
全文摘要
本发明涉及检测青海血蜱体内有无牛羊梨形虫，并可区分是何种梨形虫的检测膜。本发明用于检测牛羊体内吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和梨形虫的检测膜是在Biodyne C薄膜上固定有吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，或者其上还固定有巴贝斯虫特异性寡核苷酸和泰勒虫通用特异性寡核苷酸。本发明的检测方法是待检血蜱体内提取的DNA作为模板，以特定的引物进行PCR扩增，其产物与检测的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内，在薄膜上放X光胶片进行曝光、显影等处理，根据胶片上产生的强度信号确定被检动物是否有患有相应的疾病。
文档编号G01N21/76GK101597650SQ200910147069
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者任巧云, 党志胜, 关贵全, 刘军龙, 刘志杰, 刘爱红, 李有全, 宏 殷, 牛庆丽, 罗建勋, 马米玲, 高金亮 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所